5. Điểm mới của đề tài
1.4. Chất kháng sinh từ xạ khuẩn
1.4.1. Lược sử nghiên cứu chất kháng sinh
Các CKS là những chất hóa học đặc hiệu có nguồn gốc từ hoạt động sống của sinh vật, có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt một cách có chọn lọc sự sinh trƣởng và phát triển của những sinh vật hoặc tế bào sống nhất định ngay ở nồng độ thấp (Nguyễn Thành Đạt, năm 1999).
Ngƣời đầu tiên đặt nền móng cho khoa học nghiên cứu CKS là Alexander Fleming – Nhà sinh vật học ngƣời Anh, đã phát hiện ra penicillin vào tháng 10 năm 1928.
Sau một thập kỷ, nhờ sự nỗ lực hợp tác của các nhà vi sinh học và sinh hóa học Anh, Mỹ, penicillin đã đƣợc nghiên cứu, sản xuất với số lƣợng lớn và trở thành “một loại thuốc thần kỳ”. Năm 1945, A.Fleming, E.Chain và H. W.Florey đã đƣợc nhận giải thƣởng Nobel vì đã khám phá ra giá trị to lớn của penicillin mở ra một kỷ nguyên mới trong y học – kỷ nguyên kháng sinh.
Những năm 1940 – 1959 đƣợc coi là thời kỳ hoàng kim của việc nghiên cứu CKS với hàng loạt CKS mới liên tiếp đƣợc phát hiện nhƣ: gramixidin, tiroxidin do Rene Jules Dubos phát hiện năm 1939, streptomycin do
17
Waksman phát hiện năm 1941, erythromycin do Gurre phát hiện năm 1952… Cùng với việc phát hiện ra các CKS mới, công nghệ lên men sản xuất CKS cũng ra đời và dần đƣợc hoàn thiện [23].
Ngay từ những năm 1950, CKS đã đƣợc nghiên cứu sử dụng trong việc phòng chống bệnh, kích thích sự tăng trƣởng của động vật nuôi và cây trồng. CKS thu hút đƣợc sự quan tâm của các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau trên thế giới.
Tốc độ tìm kiếm các CKS trong thời gian gần đây vẫn diễn ra nhanh chóng, nhiều trung tâm nghiên cứu khoa học về y học, dƣợc phẩm và nông nghiệp tại nhiều nƣớc trên thế giới vẫn liên tục phát hiện đƣợc hàng loạt các CKS mới có giá trị ứng dụng trong thực tiễn.
Năm 1999 một kháng sinh mới khác đƣợc phát hiện có tác dụng ngăn chặn hiện tƣợng cholesterol, tăng sức đề kháng đối với các chất độc của chuột, ngoài ra kháng sinh này còn có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh. Đó là kháng sinh liposomal HA – 92, đƣợc tách ra từ xạ khuẩn Streptomyces
CDRLL – 32.
Năm 2003, nhiều nƣớc trên thế giới vẫn tiếp tục phát hiện đƣợc hàng loạt các CKS mới. Tại Nhật Bản, chất kháng sinh mới là yatakemycin đã đƣợc tách chiết từ xạ khuẩn Streptomyces sp. TP – A0356 bằng phƣơng pháp sắc kí cột.
CKS này có khả năng kìm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus
fumigalus và Candida albicans. Ngoài ra chất này còn có khả năng chống lại
các tế bào ung thƣ với giá trị Mic là 0,01 – 0,3 mg/ml [16].
Năm 2007, tại Hàn Quốc đã phân lập đƣợc loài xạ khuẩn Streptomyces
sp. C684 sinh CKS laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin [26].
Ngày nay với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hỗ trợ của nhiều ngành khoa học khác đã giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng CKS
18
đạt đƣợc những thành tựu rực rỡ. Để sản xuất CKS con ngƣời không chỉ tìm kiếm những chủng VSV sinh CKS từ tự nhiên mà còn cải tạo chúng bằng nhiều phƣơng pháp nhƣ dùng kỹ thuật di truyền và công nghệ gene, gây đột biến định hƣớng, chọn dòng gene sinh tổng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần để tạo ra các chủng có HTKS cao, đồng thời nhằm mục đích tìm kiếm các loại kháng sinh mới và quý trong thời gian ngắn [8], [24].
Những thành tựu gần đây trong sinh học phân tử nhƣ tái tổ hợp ADN, kỹ thuật tách dòng gene và biểu hiện tổng hợp ở vi khuẩn E. coli không những đem lại kết quả to lớn trong phát triển chủng giống mà còn mở ra phƣơng hƣớng đầy triển vọng trong sản xuất các CKS.
1.4.2. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn
Một trong những điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành CKS.
Trong số 8000 CKS hiện biết trên thế giới có trên 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn [4].
Một trong những tính chất của các CKS có nguồn gốc từ VSV nói chung và từ xạ khuẩn nói riêng là có tác dụng chọn lọc. Mỗi CKS chỉ có tác dụng với một nhóm VSV nhất định. Hầu hết CKS có nguồn gốc xạ khuẩn đều có phổ kháng khuẩn rộng. Khả năng kháng khuẩn của các CKS là một đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn.
Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành CKS. Một số tác giả cho rằng sự hình thành CKS là do cơ chế giúp cho VSV tồn tại trong môi trƣờng tự nhiên. Số khác cho rằng, sự hình thành CKS là do sự cạnh tranh trong môi trƣờng dinh dƣỡng. Hầu hết các tác giả cho rằng kháng sinh là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp đƣợc hình thành vào cuối pha tích lũy thừa, đầu pha cân bằng của chu kỳ sinh trƣởng [2].
Mặc dù CKS có cấu trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng đa dạng, nhƣng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đƣờng nhất định.
19
-CKS đƣợc tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua một chuỗi phản ứng enzyme.
-CKS đƣợc hình thành từ hai hoặc ba chất chuyển hóa sơ cấp khác nhau. -CKS đƣợc hình thành bằng con đƣờng polyme hóa các chất chuyển hóa sơ cấp, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzyme khác.
Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều CKS có cấu trúc hóa học và có tác dụng tƣơng tự nhau. Quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gene, ngoài các gene chịu trách nhiệm tổng hợp CKS, còn có cả các gene chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzyme và cofactor.
1.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 1.3.4.1. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
* Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hƣởng rất lớn đến sinh trƣởng và khả năng tổng hợp CKS của xạ khuẩn. Đa số các xạ khuẩn phát triển tốt ở nhệt độ 28 – 30oC, nhƣng nhiệt độ tối ƣu cho sinh trƣởng tổng hợp CKS thƣờng chỉ nằm trong khoảng 18 – 28oC [17].
*pH môi trường
Sinh tổng hợp CKS phụ thuộc rất nhiều vào pH môi trƣờng. pH tác động trực tiếp đến tính chất hệ keo của tế bào, đến hoạt lực của các enzyme và tác động gián tiếp qua môi trƣờng. pH thích hợp cho sinh tổng hợp CKS thƣờng là trung tính, pH kiềm hay axit đều ức chế quá trình tổng hợp CKS [19], [25].
*Độ thông khí
Xạ khuẩn là loại VSV có nhu cầu thông khí cao hơn so với các VSV khác, nhất là ở giai đoạn nhân giống (khoảng từ giờ thứ 6 đến giờ thứ 12 của quá trình nuôi cấy). Do vậy để đảm bảo thông khí tốt, ngƣời ta thƣờng bổ sung vào môi trƣờng lên men benzilthioxyanat... làm tăng khả năng hòa tan
20
oxy. Nồng độ oxy thích hợp cho sinh tổng hợp CKS là 2 – 8ml O2/100ml môi trƣờng lên men [10].
*Tuổi giống
Việc tổng hợp CKS không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men, mà còn phụ thuộc vào chất lƣợng của bào tử và giống sinh dƣỡng. Tuổi giống cấy truyền vào môi trƣờng lên men cho hiệu suất CKS cao nhất thƣờng là 24 giờ tuổi. Lƣợng giống cấy truyền khoảng từ 2 – 10% [15].
1.4.3.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men
CKS là sản phẩm thứ cấp nên quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc chặt chẽ vào thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng. Trƣớc hết là nguồn cacbon, nitơ, tỷ lệ C/N và các chất khoáng... [2],[20], [22].
*Nguồn cacbon
Các hợp chất cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong sự sinh trƣởng và hình thành CKS. Đối với nhiều chủng xạ khuẩn, nguồn cacbon thích hợp là tinh bột. Tuy nhiên, tùy từng chủng khác nhau mà khả năng sử dụng các loại đƣờng là khác nhau, có chủng sử dụng tốt các loại đƣờng đơn nhƣ glucoza, mannoza, fructoza... có chủng sử dụng tốt loại đƣờng đa nhƣ sacaroza, maltoza... Ngoài ra một số chủng còn có thể sử dụng các loại acid hữu cơ và chất béo làm nguồn thức ăn cacbon trong lên men sinh CKS.
*Nguồn nitơ
Hầu hết các chủng xạ khuẩn sinh CKS đều đòi hỏi cả hai nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ. Nguồn nitơ hữu cơ thích hợp nhất thƣờng là các hợp chất từ thực vật nhƣ bột đậu tƣơng, cao ngô. Cao ngô là nguồn bổ sung cả nitơ và protein, tuy nhiên lƣợng photphat vô cơ trong cao ngô cao sẽ ức chế sinh tổng hợp CKS [21]. Nguồn nitơ vô cơ thƣờng sử dụng là muối amon. Muối nitrat không thích hợp cho sự sinh tổng hợp CKS của nhiều chủng xạ khuẩn.
21
Photphat vô cơ đóng vai trò nhƣ là tác nhân điều chỉnh sinh tổng hợp CKS. Nồng độ photphat thích hợp cho sinh tổng hợp CKS thƣờng không vƣợt quá 10mg/ml. Nồng độ photphat ban đầu cao sẽ làm tăng lƣợng axit nucleic dẫn đến kéo dài pha sinh trƣởng, rút ngắn pha tổng hợp, làm tăng ATP trong tế bào, dẫn đến giảm hoặc ngừng hẳn sinh tổng hợp CKS.
*Các yếu tố vi lượng
Đây là thành phần không thể thiếu trong môi trƣờng lên men. Nếu môi trƣờng lên men có nguồn dinh dƣỡng tự nhiên thì hầu hết các nguyên tố vi lƣợng đã có sẵn. Việc bổ sung các chất giàu nguyên tố vi lƣợng vào môi trƣờng sẽ làm thay đổi đáng kể khả năng tổng hợp CKS của nhiều chủng xạ khuẩn.
*Hình thức lên men
Trong tổng hợp CKS, phƣơng pháp nuôi cấy cũng là một trong những yếu tố quyết định. Khi nuôi cấy bề mặt, đặc điểm hai pha thƣờng không quan sát thấy và CKS đƣợc tạo thành trong suốt pha sinh trƣởng. Quá trình sản xuất CKS thƣờng đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp nuôi cấy chìm trong nồi lên men có cách khuấy đảo và sục khí.
1.5. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn ở Việt Nam
Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn ở Việt Nam đang nở rộ. Các chủng xạ khuẩn đƣợc nghiên cứu về nhiều mặt: tối ƣu hóa môi trƣờng nuôi cấy (Bùi Việt Hà, 1998, Lê Gia Huy, 1994…), nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn (Biền Văn Minh, 2000 – 2004), tìm hiểu khả năng sử dụng dầu mỏ của một số chủng xạ khuẩn (Lại Thúy Hiền và cs, 1998)…, trong các nghiên cứu đó thì việc nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh kháng các vi sinh vật gây bệnh của các chủng xạ khuẩn cũng là một trong những vấn đề đang đƣợc qua tâm (Kiều Hữu Ảnh và cs, 2003; Lê Gia Huy và cs, 1992, 1994, 2005).
22
Những nghiên cứu kháng sinh của Việt Nam đƣợc mở đầu bằng việc sử dụng dịch nuôi cấy nấm Penicillium để chữa trị cho các thƣơng binh trong chiến tranh năm 1949 do GS. Đặng Văn Ngữ tiến hành. Tuy nhiên, 6 năm sau penicillin mới đƣợc tinh chế.
Tiếp sau công trình đầu tiên đó, các nghiên cứu về chất kháng sinh tiếp theo đƣợc thực hiện tại Đại học Dƣợc Hà Nội, Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, Đại học Sƣ phạm Hà Nội. Tại đây đã nghiên cứu, phân lập, tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh kháng sinh mạnh, xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa của chất kháng sinh, sơ bộ định loại nhóm kháng sinh.
Cho đến năm 2000, việc nghiên cứu và thử nghiệm sản xuất thuốc kháng sinh ở Việt Nam bƣớc đầu đã có những thành công nhất định. Dây truyền sản xuất kháng sinh đầu tiên của Việt Nam đạt tiêu chuẩn GMP đƣợc lắp đặt tại Xí nghiệp Dƣợc phẩm Trung Ƣơng I với sản phẩm kháng sinh β – lactam dạng bột, độ tinh khiết cao có thể dùng để tiêm.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng và bƣớc đầu mạng lại thành công, nhƣng trình độ trong nghiên cứu CKS của chúng ta còn thấp so với thế giới. Một trong những hạn chế này là đa số các nghiên cứu hiện nay vẫn chỉ dừng lại ở phân lập, tuyển chọn chủng sinh kháng sinh. Tách chiết, tinh sạch, định tên kháng sinh vẫn là công việc đắt đỏ, yêu cầu phối hợp nghiên cứu nên mới chỉ thực hiện ở một số cơ sở nghiên cứu lớn. Tập chung nghiên cứu tìm kiếm kháng sinh mới và ứng dụng sản xuất kháng sinh cần đƣợc đẩy mạnh hơn nữa, nâng cao trình độ nghiên cứu và đáp ứng nhu cầu chăm sóc và bảo vệ sức khỏe con ngƣời, giảm thiểu nhập khẩu kháng sinh.
23
CHƢƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Mẫu cây
Mẫu nghiên cứu là cây rau dệu thu thập từ các địa điểm khác nhau của khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc.
2.1.2. Mẫu đất
Các mẫu đất đƣợc lấy ở các độ sâu khoảng 3 – 7cm tại các địa điểm khác nhau của khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên,Vĩnh Phúc.
2.1.3. Vi sinh vật kiểm định
Hai chủng vi sinh vật chủ yếu đƣợc sử dụng để kiểm định hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc từ vùng rễ cây rau dệu đó là vi khuẩn Bacilluss và vi khuẩn E.coli
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.2.1. Hóa chất
- Các loại đƣờng chuẩn: glucose, saccarose... của hãng Merck (Đức), Trung Quốc sản xuất.
- Các loại muối: K2HPO4, KH2PO4, MgSO. 7H2O, KNO3, NaCl, FeSO4. 7H2O, (NH4)2SO4, CaCO3, Na2CO3... nhập từ Trung Quốc, Anh sản xuất.
- Các loại cao: Cao thịt, cao nấm men, peptone... của hãng Merck ( Đức). - Các loại hóa chất khác: thạch, tinh bột tan, CMC (Carboxyl Methyl Cellulose)... của Nhật, Trung Quốc, Việt Nam sản xuất.
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị
Tủ ấm, tủ sấy Binder; Nồi hấp (TOMY – Nhật); Máy lắc; Máy li tâm (Shorwall super T21 – Mỹ); Cân điện tử (Presica XT 320M – Thụy Sĩ); Kính hiển vi quang học; Các dụng cụ khác trong Phòng thí nghiệm Vi sinh vật thuộc khoa Sinh – KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.
24
2.3. Môi trƣờng
2.3.1. Môi trường phân lập, bảo quản và giữ giống xạ khuẩn
Môi trường Gause I
K2HPO4 0,5 g FeSO4 (dạng vết) 0,01 g
KNO3 1 g Thạch agar 20 g
MgSO4. 7H2O 5 g pH 7,2
NaCl 0,5 g Nƣớc cất 1000 ml
2.3.2. Môi trường thử hoạt tính kháng sinh
Môi trƣờng MPA nuôi cấy giữ giống vi khuẩn kiểm định.
Môi trường MPA
Peptôn 5,0g Thạch 20,0g NaCl NaCl 5,0g Nƣớc cất 1000ml
Cao thịt 5,0g pH= 7,5
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1.Phương pháp thu mẫu và xử lí mẫu vật
Thu phần rễ của cây có đất bám vào, còn tƣơi, đựng mẫu vào túi nilon có ghi rõ ngày lấy, nơi lấy mẫu, loại rễ cây, độ sâu của rễ.
Sau khi mang về phòng thí nghiệm rũ bỏ phần đất bám vào túi nilon vô trùng, phần đất rũ bỏ đƣợc dùng làm một mẫu phân lập.
Xử lí mẫu:
*Mẫu đất
- Phơi khô mẫu trong không khí, nghiền nhỏ trong cối xứ và rây để loại bỏ các phần hữu cơ và các hạt đất, đá, sỏi… có kích thƣớc lớn.
- Đất bột mịn đƣợc xử lí theo 1 trong 2 cách: (cách 1: gói trong giấy báo, sấy khô 100oC trong thời gian 45 phút; cách 2: hòa trong nƣớc muối sinh lí vô trùng, đun nóng tới 50o
25
- Sau khi xử lí, lấy 0,1ml mẫu đó tiến hành pha loãng tới 10-4 và chang trên đĩa môi trƣờng (lặp lại 3 lần / mẫu – mỗi mẫu phân lập tại 10-2
, 10-3, 10-4); 28 – 30oC trong 10-14 ngày.
*Mẫu rễ
- Rễ cây đƣợc rửa sạch, để ráo nƣớc trên bề bề mặt rễ (để trong tủ cấy có quạt hút cho khô (hoặc để trƣớc quạt bàn hoặc trong phòng có điều hòa).
Sau đó đƣợc xử lí nhƣ sau:
- Ngâm trong cồn 75% trong thời gian 5 phút.
- Rửa tiếp với NaClO (javen) 2%.
- Rửa tiếp bằng nƣớc cất vô trùng 5 lần cho sạch hết các hóa chất đã dùng ở các bƣớc trƣớc (cồn, javen).
- Dùng kéo thanh trùng, cắt rễ thành các đoạn ngắn 1cm. Cân 1 gam rễ cho vào cối xứ và nghiền nát (có bổ sung 45 ml nƣớc muối sinh lí vô trùng).
- Hút 0,1ml dịch sau nghiền chang đều trên môi trƣờng phân lập (sau khi đổ môi trƣờng vào đĩa petri, cần để cho bề mặt môi trƣờng khô hết nƣớc đọng).
- Nuôi cấy trong điều kiện 28 - 30oC trong thời gian 10 – 14 ngày.
2.4.2. Phân lập tuyển chon xạ khuẩn
Phần đất rũ bỏ từ rễ đƣợc dùng làm mẫu phân lập xạ khuẩn theo tỉ lệ 9ml nƣớc cất/1g đất. Pha loãng đến nồng độ 10-4