5. Điểm mới của đề tài
1.4.2. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn
Một trong những điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành CKS.
Trong số 8000 CKS hiện biết trên thế giới có trên 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn [4].
Một trong những tính chất của các CKS có nguồn gốc từ VSV nói chung và từ xạ khuẩn nói riêng là có tác dụng chọn lọc. Mỗi CKS chỉ có tác dụng với một nhóm VSV nhất định. Hầu hết CKS có nguồn gốc xạ khuẩn đều có phổ kháng khuẩn rộng. Khả năng kháng khuẩn của các CKS là một đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn.
Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành CKS. Một số tác giả cho rằng sự hình thành CKS là do cơ chế giúp cho VSV tồn tại trong môi trƣờng tự nhiên. Số khác cho rằng, sự hình thành CKS là do sự cạnh tranh trong môi trƣờng dinh dƣỡng. Hầu hết các tác giả cho rằng kháng sinh là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp đƣợc hình thành vào cuối pha tích lũy thừa, đầu pha cân bằng của chu kỳ sinh trƣởng [2].
Mặc dù CKS có cấu trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng đa dạng, nhƣng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đƣờng nhất định.
19
-CKS đƣợc tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua một chuỗi phản ứng enzyme.
-CKS đƣợc hình thành từ hai hoặc ba chất chuyển hóa sơ cấp khác nhau. -CKS đƣợc hình thành bằng con đƣờng polyme hóa các chất chuyển hóa sơ cấp, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzyme khác.
Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều CKS có cấu trúc hóa học và có tác dụng tƣơng tự nhau. Quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gene, ngoài các gene chịu trách nhiệm tổng hợp CKS, còn có cả các gene chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzyme và cofactor.
1.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 1.3.4.1. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
* Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hƣởng rất lớn đến sinh trƣởng và khả năng tổng hợp CKS của xạ khuẩn. Đa số các xạ khuẩn phát triển tốt ở nhệt độ 28 – 30oC, nhƣng nhiệt độ tối ƣu cho sinh trƣởng tổng hợp CKS thƣờng chỉ nằm trong khoảng 18 – 28oC [17].
*pH môi trường
Sinh tổng hợp CKS phụ thuộc rất nhiều vào pH môi trƣờng. pH tác động trực tiếp đến tính chất hệ keo của tế bào, đến hoạt lực của các enzyme và tác động gián tiếp qua môi trƣờng. pH thích hợp cho sinh tổng hợp CKS thƣờng là trung tính, pH kiềm hay axit đều ức chế quá trình tổng hợp CKS [19], [25].
*Độ thông khí
Xạ khuẩn là loại VSV có nhu cầu thông khí cao hơn so với các VSV khác, nhất là ở giai đoạn nhân giống (khoảng từ giờ thứ 6 đến giờ thứ 12 của quá trình nuôi cấy). Do vậy để đảm bảo thông khí tốt, ngƣời ta thƣờng bổ sung vào môi trƣờng lên men benzilthioxyanat... làm tăng khả năng hòa tan
20
oxy. Nồng độ oxy thích hợp cho sinh tổng hợp CKS là 2 – 8ml O2/100ml môi trƣờng lên men [10].
*Tuổi giống
Việc tổng hợp CKS không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men, mà còn phụ thuộc vào chất lƣợng của bào tử và giống sinh dƣỡng. Tuổi giống cấy truyền vào môi trƣờng lên men cho hiệu suất CKS cao nhất thƣờng là 24 giờ tuổi. Lƣợng giống cấy truyền khoảng từ 2 – 10% [15].
1.4.3.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men
CKS là sản phẩm thứ cấp nên quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc chặt chẽ vào thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng. Trƣớc hết là nguồn cacbon, nitơ, tỷ lệ C/N và các chất khoáng... [2],[20], [22].
*Nguồn cacbon
Các hợp chất cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong sự sinh trƣởng và hình thành CKS. Đối với nhiều chủng xạ khuẩn, nguồn cacbon thích hợp là tinh bột. Tuy nhiên, tùy từng chủng khác nhau mà khả năng sử dụng các loại đƣờng là khác nhau, có chủng sử dụng tốt các loại đƣờng đơn nhƣ glucoza, mannoza, fructoza... có chủng sử dụng tốt loại đƣờng đa nhƣ sacaroza, maltoza... Ngoài ra một số chủng còn có thể sử dụng các loại acid hữu cơ và chất béo làm nguồn thức ăn cacbon trong lên men sinh CKS.
*Nguồn nitơ
Hầu hết các chủng xạ khuẩn sinh CKS đều đòi hỏi cả hai nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ. Nguồn nitơ hữu cơ thích hợp nhất thƣờng là các hợp chất từ thực vật nhƣ bột đậu tƣơng, cao ngô. Cao ngô là nguồn bổ sung cả nitơ và protein, tuy nhiên lƣợng photphat vô cơ trong cao ngô cao sẽ ức chế sinh tổng hợp CKS [21]. Nguồn nitơ vô cơ thƣờng sử dụng là muối amon. Muối nitrat không thích hợp cho sự sinh tổng hợp CKS của nhiều chủng xạ khuẩn.
21
Photphat vô cơ đóng vai trò nhƣ là tác nhân điều chỉnh sinh tổng hợp CKS. Nồng độ photphat thích hợp cho sinh tổng hợp CKS thƣờng không vƣợt quá 10mg/ml. Nồng độ photphat ban đầu cao sẽ làm tăng lƣợng axit nucleic dẫn đến kéo dài pha sinh trƣởng, rút ngắn pha tổng hợp, làm tăng ATP trong tế bào, dẫn đến giảm hoặc ngừng hẳn sinh tổng hợp CKS.
*Các yếu tố vi lượng
Đây là thành phần không thể thiếu trong môi trƣờng lên men. Nếu môi trƣờng lên men có nguồn dinh dƣỡng tự nhiên thì hầu hết các nguyên tố vi lƣợng đã có sẵn. Việc bổ sung các chất giàu nguyên tố vi lƣợng vào môi trƣờng sẽ làm thay đổi đáng kể khả năng tổng hợp CKS của nhiều chủng xạ khuẩn.
*Hình thức lên men
Trong tổng hợp CKS, phƣơng pháp nuôi cấy cũng là một trong những yếu tố quyết định. Khi nuôi cấy bề mặt, đặc điểm hai pha thƣờng không quan sát thấy và CKS đƣợc tạo thành trong suốt pha sinh trƣởng. Quá trình sản xuất CKS thƣờng đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp nuôi cấy chìm trong nồi lên men có cách khuấy đảo và sục khí.
1.5. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn ở Việt Nam
Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn ở Việt Nam đang nở rộ. Các chủng xạ khuẩn đƣợc nghiên cứu về nhiều mặt: tối ƣu hóa môi trƣờng nuôi cấy (Bùi Việt Hà, 1998, Lê Gia Huy, 1994…), nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn (Biền Văn Minh, 2000 – 2004), tìm hiểu khả năng sử dụng dầu mỏ của một số chủng xạ khuẩn (Lại Thúy Hiền và cs, 1998)…, trong các nghiên cứu đó thì việc nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh kháng các vi sinh vật gây bệnh của các chủng xạ khuẩn cũng là một trong những vấn đề đang đƣợc qua tâm (Kiều Hữu Ảnh và cs, 2003; Lê Gia Huy và cs, 1992, 1994, 2005).
22
Những nghiên cứu kháng sinh của Việt Nam đƣợc mở đầu bằng việc sử dụng dịch nuôi cấy nấm Penicillium để chữa trị cho các thƣơng binh trong chiến tranh năm 1949 do GS. Đặng Văn Ngữ tiến hành. Tuy nhiên, 6 năm sau penicillin mới đƣợc tinh chế.
Tiếp sau công trình đầu tiên đó, các nghiên cứu về chất kháng sinh tiếp theo đƣợc thực hiện tại Đại học Dƣợc Hà Nội, Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, Đại học Sƣ phạm Hà Nội. Tại đây đã nghiên cứu, phân lập, tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh kháng sinh mạnh, xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa của chất kháng sinh, sơ bộ định loại nhóm kháng sinh.
Cho đến năm 2000, việc nghiên cứu và thử nghiệm sản xuất thuốc kháng sinh ở Việt Nam bƣớc đầu đã có những thành công nhất định. Dây truyền sản xuất kháng sinh đầu tiên của Việt Nam đạt tiêu chuẩn GMP đƣợc lắp đặt tại Xí nghiệp Dƣợc phẩm Trung Ƣơng I với sản phẩm kháng sinh β – lactam dạng bột, độ tinh khiết cao có thể dùng để tiêm.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng và bƣớc đầu mạng lại thành công, nhƣng trình độ trong nghiên cứu CKS của chúng ta còn thấp so với thế giới. Một trong những hạn chế này là đa số các nghiên cứu hiện nay vẫn chỉ dừng lại ở phân lập, tuyển chọn chủng sinh kháng sinh. Tách chiết, tinh sạch, định tên kháng sinh vẫn là công việc đắt đỏ, yêu cầu phối hợp nghiên cứu nên mới chỉ thực hiện ở một số cơ sở nghiên cứu lớn. Tập chung nghiên cứu tìm kiếm kháng sinh mới và ứng dụng sản xuất kháng sinh cần đƣợc đẩy mạnh hơn nữa, nâng cao trình độ nghiên cứu và đáp ứng nhu cầu chăm sóc và bảo vệ sức khỏe con ngƣời, giảm thiểu nhập khẩu kháng sinh.
23
CHƢƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Mẫu cây
Mẫu nghiên cứu là cây rau dệu thu thập từ các địa điểm khác nhau của khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc.
2.1.2. Mẫu đất
Các mẫu đất đƣợc lấy ở các độ sâu khoảng 3 – 7cm tại các địa điểm khác nhau của khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên,Vĩnh Phúc.
2.1.3. Vi sinh vật kiểm định
Hai chủng vi sinh vật chủ yếu đƣợc sử dụng để kiểm định hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc từ vùng rễ cây rau dệu đó là vi khuẩn Bacilluss và vi khuẩn E.coli
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.2.1. Hóa chất
- Các loại đƣờng chuẩn: glucose, saccarose... của hãng Merck (Đức), Trung Quốc sản xuất.
- Các loại muối: K2HPO4, KH2PO4, MgSO. 7H2O, KNO3, NaCl, FeSO4. 7H2O, (NH4)2SO4, CaCO3, Na2CO3... nhập từ Trung Quốc, Anh sản xuất.
- Các loại cao: Cao thịt, cao nấm men, peptone... của hãng Merck ( Đức). - Các loại hóa chất khác: thạch, tinh bột tan, CMC (Carboxyl Methyl Cellulose)... của Nhật, Trung Quốc, Việt Nam sản xuất.
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị
Tủ ấm, tủ sấy Binder; Nồi hấp (TOMY – Nhật); Máy lắc; Máy li tâm (Shorwall super T21 – Mỹ); Cân điện tử (Presica XT 320M – Thụy Sĩ); Kính hiển vi quang học; Các dụng cụ khác trong Phòng thí nghiệm Vi sinh vật thuộc khoa Sinh – KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.
24
2.3. Môi trƣờng
2.3.1. Môi trường phân lập, bảo quản và giữ giống xạ khuẩn
Môi trường Gause I
K2HPO4 0,5 g FeSO4 (dạng vết) 0,01 g
KNO3 1 g Thạch agar 20 g
MgSO4. 7H2O 5 g pH 7,2
NaCl 0,5 g Nƣớc cất 1000 ml
2.3.2. Môi trường thử hoạt tính kháng sinh
Môi trƣờng MPA nuôi cấy giữ giống vi khuẩn kiểm định.
Môi trường MPA
Peptôn 5,0g Thạch 20,0g NaCl NaCl 5,0g Nƣớc cất 1000ml
Cao thịt 5,0g pH= 7,5
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1.Phương pháp thu mẫu và xử lí mẫu vật
Thu phần rễ của cây có đất bám vào, còn tƣơi, đựng mẫu vào túi nilon có ghi rõ ngày lấy, nơi lấy mẫu, loại rễ cây, độ sâu của rễ.
Sau khi mang về phòng thí nghiệm rũ bỏ phần đất bám vào túi nilon vô trùng, phần đất rũ bỏ đƣợc dùng làm một mẫu phân lập.
Xử lí mẫu:
*Mẫu đất
- Phơi khô mẫu trong không khí, nghiền nhỏ trong cối xứ và rây để loại bỏ các phần hữu cơ và các hạt đất, đá, sỏi… có kích thƣớc lớn.
- Đất bột mịn đƣợc xử lí theo 1 trong 2 cách: (cách 1: gói trong giấy báo, sấy khô 100oC trong thời gian 45 phút; cách 2: hòa trong nƣớc muối sinh lí vô trùng, đun nóng tới 50o
25
- Sau khi xử lí, lấy 0,1ml mẫu đó tiến hành pha loãng tới 10-4 và chang trên đĩa môi trƣờng (lặp lại 3 lần / mẫu – mỗi mẫu phân lập tại 10-2
, 10-3, 10-4); 28 – 30oC trong 10-14 ngày.
*Mẫu rễ
- Rễ cây đƣợc rửa sạch, để ráo nƣớc trên bề bề mặt rễ (để trong tủ cấy có quạt hút cho khô (hoặc để trƣớc quạt bàn hoặc trong phòng có điều hòa).
Sau đó đƣợc xử lí nhƣ sau:
- Ngâm trong cồn 75% trong thời gian 5 phút.
- Rửa tiếp với NaClO (javen) 2%.
- Rửa tiếp bằng nƣớc cất vô trùng 5 lần cho sạch hết các hóa chất đã dùng ở các bƣớc trƣớc (cồn, javen).
- Dùng kéo thanh trùng, cắt rễ thành các đoạn ngắn 1cm. Cân 1 gam rễ cho vào cối xứ và nghiền nát (có bổ sung 45 ml nƣớc muối sinh lí vô trùng).
- Hút 0,1ml dịch sau nghiền chang đều trên môi trƣờng phân lập (sau khi đổ môi trƣờng vào đĩa petri, cần để cho bề mặt môi trƣờng khô hết nƣớc đọng).
- Nuôi cấy trong điều kiện 28 - 30oC trong thời gian 10 – 14 ngày.
2.4.2. Phân lập tuyển chon xạ khuẩn
Phần đất rũ bỏ từ rễ đƣợc dùng làm mẫu phân lập xạ khuẩn theo tỉ lệ 9ml nƣớc cất/1g đất. Pha loãng đến nồng độ 10-4
. Từ dung dịch pha loãng 10-2 – 10-4 nhỏ 0,1 ml sang đĩa petri chứa môi trƣờng Gause – I.
Dùng que chang vô trùng chang đều, sau đó nuôi ở nhiệt độ phòng 4 – 7 ngày, các khuẩn lạc đƣợc làm sạch cấy truyền sang ống thạch nghiêng chứa môi trƣờng Gause – I, tiếp tục nuôi ở 10 – 14 ngày.
2.4.3. Phương pháp bảo quản chủng giống
Các chủng xạ khuẩn đã lựa chọn đƣợc cấy trên môi trƣờng thạch nghiêng Gause - I ở nhiệt độ phòng. Sau 10-14 ngày khi xạ khuẩn mọc tốt,
26
các ống giống đƣợc bảo quản trong tủ lạnh ở 4 - 6oC. Sau 2 - 3 tháng cấy truyền lại một lần.
2.4.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của xạ khuẩn
Quan sát màu sắc của hệ sợi khí sinh
Dựa theo tài liệu của ISP, Gause và cộng sự (1983), xác định màu sắc của HSKS dựa vào bảng màu của Tresner và Bakus. Căn cứ vào màu sắc HSKS của các chủng mới phân lập để phân thành các nhóm màu theo Gause và cộng sự: White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh…
Quan sát màu sắc của hệ sợi cơ chất
Màu sắc của HSCC đƣợc xác định qua quan sát trực tiếp trên môi trƣờng thạch đĩa hoặc thạch nghiêng và mô tả theo thang màu chuẩn của Bondarsev (1953), Tresner và cộng sự (1961).
Quan sát cuống sinh bào tử
Phương pháp 1: Phương pháp xẻ rãnh khối thạch
Xạ khuẩn đƣợc rải đều trên bề mặt hộp petri chứa môi trƣờng Gause – I. Dùng dao vô trùng xẻ hai đƣờng song song ở giữa hộp lồng, bỏ khối thạch ở giữa hai đƣờng xẻ ra ngoài. Sau đó đặt lamen vô trùng chéo theo rãnh thạch vừa xẻ. Để hộp lồng nuôi cấy trong tủ ấm 3 – 5 ngày, lấy lamen ra quan sát phần xạ khuẩn mọc lan ra hai đƣờng xẻ trên kính hiển vi quang học.
Phương pháp 2: Găm lamen nghiêng 45o
Xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng Gause - I có găm lamen nghiêng 45o trên bề mặt môi trƣờng. Sau 7 - 9 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng lấy ra quan sát hình dạng chuỗi sinh bào tử trên lamen dƣới kính hiển vi quang học. Chuỗi sinh bào tử có dạng thẳng hay lƣợn sóng ký hiệu là RF (Rectus Flexibilis), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn toàn ký hiệu là RA (Rectinaculum Apertum) và xoắn hoàn toàn ký hiệu là S (Spira).
27
Sự hình thành sắc tố tan
Xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng Gause – I. Sau 7, 14, 21 ngày lấy ra quan sát sắc tố tan tiết ra môi trƣờng.
2.4.5. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh a. Nguyên tắc
Nếu VSV trên khối thạch có khả năng hình thành CKS thì chúng sẽ ức chế và tiêu diệt các VSV kiểm định và tạo thành vòng vô khuẩn xung quanh khối thạch.
b.Tiến hành thí nghiệm
Phương pháp đục lỗ (xác định hoạt tính kháng sinh trong dịch thể)
Chuẩn bị dịch kháng sinh: nuôi lắc xạ khuẩn trên môi trƣờng dịch thể từ 5 – 7 ngày. Li tâm dịch lên men 4000 vòng/phút, loại bỏ sinh khối lấy dịch để thử hoạt tính kháng sinh.
Chuẩn bị VSV kiểm định: nuôi lắc VSV kiểm định trên môi trƣờng dịch thể thích hợp cho mỗi loại VSV kiểm định (Vi khuẩn trên môi trƣờng MPA).
Thử hoạt tính:
- Dùng micropipette nhỏ 100µl VSV kiểm định lên bề mặt môi trƣờng thạch sau đó chang đều bằng que chang vô trùng.
- Dùng khoan nút chai vô trùng khoan đĩa thạch thành các lỗ có đƣờng kính 1cm.
- Dùng micropipette nhỏ 100µl dịch kháng sinh vào lỗ thạch. Để hộp petri vào tủ lạnh trong 8h, sau đó nuôi trong tủ ấm 24 – 48h.
- Đánh giá sơ bộ hoạt tính kháng sinh: đo vòng vô khuẩn xung quanh lỗ thạch, hoạt tính kháng sinh đƣợc đánh giá bằng giá trị D – d .
Trong đó: D là đường kính vòng vô khuẩn (mm). d là đường kính lỗ thạch (mm).
(D-d) 25 mm: hoạt tính rất mạnh; (D-d) 20 mm: hoạt tính mạnh.
28
2.4.6. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả bằng toán học
Chúng tôi xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phƣơng