3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VĂ PHƯƠNG PHÂP NGHIÍN CỨU
3.3.Phương phâp nghiắn cứu
đề tăi bao gồm 4 thắ nghiệm:
Thắ nghiệm 1: đânh giâ năng suất, câc yếu tố cấu thănh năng suất vă mức ựộ nhiễm sđu bệnh của nguồn vật liệu.
- Thắ nghiệm ựược bố trắ theo kiểu tập ựoăn tuần từ không nhắc lại, cứ cấy ựược 10 dòng thì cấy 4 ựối chứng
- Diện tắch ô thắ nghiệm 5m2, tổng diện tắch thắ nghiệm lă 600m2 (tắnh cả bảo vệ). - Kỹ thuật âp dụng:
+ Mật ựộ cấy 40 khóm/m2, cấy 1 dảnh/khóm. + Thời vụ: trong vụ Mùa 2011
+ Phđn bón (tắnh cho 01 ha): 120kg N, 90kg P2O5 vă 60kg K2O
+ Chăm sóc lăm cỏ, phương phâp bón phđn, phòng trừ sđu bệnh âp dụng như sản xuất ựại tră.
Câc chỉ tiắu theo dõi:
Trường đại học Nông nghiệp Hă Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 29 + Tổng thời gian sinh trưởng (từ gieo ựến thu = 95% hạt chắn)
+ Khả năng ựẻ nhânh: số nhânh tối ựa, số nhânh hữu hiệu
+ Câc yếu tố cấu thănh năng suất (Bông/m2; Số hạt/bông; Tỷ lệ hạt chắc; Khối lượng 1000 hạt).
NSLT (tạ/ha) = (Số bông/m2 x Số hạt/bông x Khối lượng 1000 hạt xTỷ lệ hạt chắc) x 10 -4
Thắ nghiệm 2: Xâc ựịnh tắnh thơm của câc dòng, giống lúa bằng phương phâp cảm quan
đânh giâ cảm quan mùi thơm theo phương phâp của Sood vă Siddip (1978): - Mùi thơm trắn lâ: Thu 10 lâ của mỗi mẫu giống sau cấy 45 ngăy, lấy 2 g lâ, cắt thănh những ựoạn dăi 5 mm, bỏ văo ống nghiệm, ngđm với 5 ml dung dịch KOH 1,7%, ựậy nắp lại vă ựể ở nhiệt ựộ phòng trong 15 phút. Mức ựộ thơm ựược chấm ựiểm bởi 5 người cho theo 4 mức: thơm ựậm (ựiểm 5), thơm (ựiểm 4), thơm nhẹ (ựiểm 3), thơm rất nhẹ (ựiểm 2) vă không thơm (ựiểm 1) rồi lấy trung bình.
- Mùi thơm của gạo: Theo Kibria vă cs., (2008). Lấy 40 hạt gạo lật của mỗi giống, vừa mới thu hoạch cho văo ống nghiệm, bổ sung 5ml dung dịch KOH 1,7%, ựậy nắp văo ựể yắn ở nhiệt ựộ phòng trong 15 phút. điểm thơm của một câ thể lă trung bình của 3 lần ngửi lặp lại của 1 mẫu, mỗi lần câch nhau 10 phút
Thắ nghiệm 3: Sử dụng chỉ thị phđn tử xâc ựịnh sự có mặt của gen thơm ở câc dòng, giống trong tập ựoăn vật liệu
+ Sử dụng chỉ thị phđn tử ựể xâc ựịnh sự có mặt của gen Badh2.1 bằng hai marker ựặc thù ựê ựược Bradbury vă cs, công bố năm 2005
Cặp mồi ngoăi: ESP: TTGTTTGGAGCTTGCTGATG EAP: AGTGCTTTACAAGCCCGC
Cặp mồi trong: IFAP: CATAGGAGCAGCTGAATATATACC INSP: CTGGTAAAAGTTTATGGCTTC
Phương phâp tiến hănh:
- Tâch chiết DNA tổng tinh sạch từ câc mẫu thơm chuẩn, không thơm chuẩn vă câc dòng nghiắn cứu.
Trường đại học Nông nghiệp Hă Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 30 Tiến hănh cắt văo lúc sâng sớm, chọn những lâ còn non dăi 2cm, không bị sđu bệnh bỏ văo ống nghiệm có dung dịch 1,5cm, ựânh dấu tắn giống rồi ựặt văo ựâ lạnh.
Trong phòng thắ nghiệm, câc cối chăy sứ ựê ựược hấp khử trùng vă ựặt trắn ựâ lạnh.
+ Câc mẫu lâ 2cm ựược cắt nhỏ 0,5mm rồi bỏ trong cối chăy sứ.
+ Nhỏ 400ộl dung dịch chiết tâch DNA văo chối chăy sứ rồi lấy chăy nghiền nhỏ mẫu lâ.
+ Nghiền kỹ mô lâ ựến khi dung dịch chiết xuất chuyển sang mău xanh ựen, chứng tỏ tế băo lâ ựê vỡ vă diệp lục ựược giải phóng ra.
+ đổ thắm 400ộl dung dịch chiết xuất DNA văo, trộn lẫn vă chuyển 400ộl văo ống nghiệm ựê ựânh dấu theo tắn giống ban ựầu.
+ đổ văo ống nghiệm 400ộl (25 phenol: 24 chloroform: 1 isoaminachohol) trộn ựều, quay ly tđm 13.000 vòng trong 5 phút sau ựó chuyển phần dung dịch lớp bắn trắn sang ống nghiệm mới ựê ựânh số theo từng tắn giống.
+ đổ văo ống nghiệm 400ộl (24 chlorofrom: 1 isoaminachohol) lăm tương tự như bước 5.
+ đổ 800ộl ethanol (Isopropanol) trộn ựều sau ựó ly tđm 13.000 vòng trong 5 phút. đổ phần dung dịch phắa trắn ựi, giữ lại phần kết tủa ở ựây ống nghiệm.
+ Rửa kết tủa bằng Ethanol 70%, lăm khô tự nhiắn ở nhiệt ựộ phòng bằng câch úp ngược ống nghiệm trắn giấy thấm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phần kết tủa chắnh lă DNA, Hòa tan DNA kết tủa bằng 50ộl dung dịch TE rồi bảo quản ở nhiệt ựộ -200C , dùng cho câc giai ựoạn nghiắn cứu tiếp theo.
+ Hóa chất sử dụng với 4 Primer: ESP, IFAP, INSP, EAP
STT Hoâ chất Nồng ựộ (ộl)
1 DNA temple (10ng/ộl) 1
2 Tag DNA polymerase 0,2
3 10X PCR buffer 2,5 4 50mM MgCl2 1 5 dNTPs (5mM) 1 6 4 Primer (2mM) 2,5 ộl/mồi 7 H20 Thắm cho ựủ 30 ộl Tổng thể tắch 30
Trường đại học Nông nghiệp Hă Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 31
- Phản ứng nhđn gen trong mây PCR
+ 4 Primer: ESP, IFAP, INSP, EAP với chu kỳ nhiệt như sau: Bước 1: 940C trong 2 phút,
Bước 2: 940C trong 30 giđy Bước 3: 58 0C trong 30 giđy, Bước 4: 720C trong 1Ỗ30 giđy. Bước 5: 720C trong 5 phút. Bước 6: giữ ở 40C.
Chu kỳ nhiệt từ bước 2 ựến bước 4 lặp lại 30 chu kỳ.
- Chuẩn bị gel agarose
+ Chuẩn bị một tỉ lệ chất ựệm dẫn ựiện thắch hợp (1X TBE) ựể ựổ ựầy văo hộp dẫn ựiện vă chuẩn bị gel.
+ Thắm văo một lượng agarose theo yắu cầu với một tỉ lệ chất ựệm dẫn ựiện thắch hợp ựể lăm bảng gel (2%). để lăm bảng gel 18x30cm cần chuẩn bị 300ml dung dịch gel agarose.
+ Hoă tan agarose trong lò vi sóng, ựể chắc chắn rằng nó ựược hoă tan hoăn toăn. Xoay tròn ựể ựảm bảo chúng ựược trộn ựều.
+ đậy nắp khuôn gel. Lăm tan agarose ở nhiệt ựộ 550C trước khi ựổ văo khay. đổ agarose hoă tan văo vă căi lược văo gel sao cho không có bọt ở bắn dưới lược vă tất cả bọt ở trắn bề mặt của agarose ựược lấy ra trước khi gel chạy. Cho sản phẩm PCR văo vă chạy gel với hiệu ựiện thế 70v trong vòng 60 phút