4.2.3.1 Phƣơng pháp xác định vi sinh
Các chỉ tiêu kiểm tra vi sinh tại công ty Tổng số vi sinh vật hiếu khí Coliform Escherichia Coli Staphylococcus Aureus Salmonnella Vibri Cholera Enterobacteriaceae Quy trình - Chuẩn bị mẫu:
Sau khi tiếp nhận mẫu, cho vào khay đƣa vào buồng vô trùng chứa. Dùng dụng cụ vô trùng để lấy mẫu và chứa mẫu.
Cân 10g mẫu trong điều kiện vô trùng, trộn lƣợng mẫu này trong 90ml dung dịch pha loãng SPW.
Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu, thời gian khoảng 30 giây.
- Pha loãng: dịch mẫu sau khi đồng nhất đƣợc pha loãng bằng nhiều nồng độ bắng SPW theo dãy thập phân bằng cách dùng pipet vô trùng chuyển 1ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng SPW (tránh tiếp xúc pipet với dung dịch pha loãng), trộn đều dịch mẫu trong ống nghiệm bằng máy lắc. Màu giấy thử Vàng Vàng cam nhạt Vàng cam đậm Vàng đỏ Đỏ đậm Đỏ nâu Nâu đen Nồng độ (g/l) 0 0,3 0,6 1,0 3,0 5,0 10
55
- Cấy mẫu: dùng pipet vô trùng chuyển 1ml dịch mẫu ở nồng độ thích hợp vào mép đĩa petri vô trùng, đổ vào 10 - 15ml môi trƣờng PCA ở 45oC. Trộn đều mẫu và môi trƣờng bằng cách lắc tròn đĩa petri xuôi và ngƣợc chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3 - 5 vòng hoặc bằng cách xoay đĩa theo hình số 8.
Lƣu ý:
Thời gian từ lúc đồng nhất mẫu đến khi đổ môi trƣờng không đƣợc quá 20 phút
Không đƣợc lấy dịch mẫu bằng miệng. Phải thực hiện 2 đĩa đối chứng gồm
1 đĩa chứa 1ml dung dịch SPW và 10 -15ml môi trƣờng PCA (kiểm tra độ vô trùng của dung dịch pha loãng)
1 đĩa chỉ chứa 10 - 15ml môi trƣờng PCA (kiểm tra độ vô trùng của vật dụng và môi trƣờng).
Đặt đĩa trên mặt phẳng ngang cho đông tự nhiên. - Ủ: đợi môi trƣờng đông cứng, lật ngƣợc đĩa và ủ ở 37o
C/48 giờ.
- Đọc kết quả: đếm tất cả khuẩn lạc hiện diện trên đĩa, kể cả khuẩn lạc nhỏ nhƣ ngòi viết.
4.2.3.1 Phƣơng pháp kiểm nghiệm dƣ lƣợng kháng sinh cấm
Định nghĩa: kháng sinh là chất hữu cơ có nguồn gốc sinh học, bán tổng hợp hoặc tổng hợp có tác dụng ức chế sự phát triển hoặc giết chết vi khuẩn trên cơ sở kết hợp với một điểm tiếp nhận (receptor) trong quá trình biến dƣỡng, dẫn đến sự ngƣng trệ quá trình sống của vi khuẩn bên trong cơ thể vì vậy kháng sinh thƣờng dùng để điều trị trên cơ sở bị nhiễm trùng.
Các chỉ tiêu kiểm kháng sinh tại công ty Chloramphenicol
AOZ AMOZ Enro/Cipro Trifluralin
Phƣơng pháp kiểm nghiệm dƣ lƣợng Chloramphenicol
Quy trình phân tích
- Cân 3g mẫu đã đồng nhất cho vào ống nghiệm và 6ml Etyl acetate. Sau đó lắc đều trong 3 phút, ly tâm 5’/4000g ở nhiệt độ phòng.
56
- Lấy 4ml của phần dịch nổi bên trên và làm khô bằng khí Nitrogen trong bể điều nhiệt 60-70oC.
- Pha loãng dung dịch chiết tách và dung dịch rửa (sample extraction diluent & washing solution) tỉ lệ 1:9 với nƣớc cất.
- Hoà tan cặn khô với 2ml n-Hexan và bổ sung 1ml (sample extraction Buffer), lắc 2’ (Vortex).
- Ly tâm 10’/4000g ở nhiệt độ phòng, lấy phần dịch trong suốt dƣới đáy ống nghiệm cho vào ống tip 1,5ml.
- Hút 50µl CAP chuẩn/mẫu cho vào mỗi giếng chuẩn/mẫu.
- Hút 100µl Antibody1 cho vào mỗi giếng chuẩn/mẩu (lắc nhẹ), sau đó ủ 30’ ở nhiệt độ phòng (20-25o
C).
- Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa washing solution và thêm 150µl dung dịch Antibody vào mỗi giếng. Tiếp tục ủ 30’ ở nhiệt độ phòng (20-25oC) và Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa washing solution.
- Cho vào mỗi giếng 100µl TMB substrate và ủ 15’ ở nhiệt độ phòng (20-25oC).
- Sau đó, cho vào mỗi giếng 100µl chất dừng phản ứng (Stop solution) và đọc kết quả trên máy Eliza với bƣớc sóng kép 450nm & 650nm (thời gian không quá 60’).
Tính kết quả
- Dựng đồ thị kiểm chuẩn từ kết quả của các mẫu chuẩn. - So sánh kết quả của mẫu kiểm tra với đƣờng cong chuẩn.
- Hàm lƣợng CAP trong mẫu tƣơng ứng với mức độ hấp thụ của mẫu (OD-Optical Density) so với đƣờng cong chuẩn.
- Nhân giá trị thu đƣợc với hệ số pha loãng (hệ số pha loãng=0.5) sẽ thu đƣợc hàm lƣợng CAP thực có trong mẫu. Đơn vị tính : (ppt or ppb).
Phƣơng pháp phân tích dƣ lƣợng kháng sinh Nitrofuran (AOZ)
Quy trình phân tích
- Cân 1g mẫu (đã đồng nhất) cho vào ống nghiệm và 0.5ml sample extraction, 3,5ml nƣớc cất hai lần, 0.5ml HCl (1M) và 20µl “50mM 2- Nitrobenzaldehyde”, lắc kỹ 1’.
- Ủ 3giờ ở nhiệt độ 50oC lắc đều 1’ bằng vortex mỗi 30 phút trong quá trình ủ/hoặc ủ 37oC/16h.
57
- Thêm 5ml dung dịch “0.1M K2HPO4” và 0.4ml NaOH (1M) và 6ml Ethyl acetate, lắc kỹ 1’.
- Ly tâm 10’/4000g ở nhiệt độ phòng. Lấy 3ml của phần dịch nổi bên trên và làm khô bằng khí Nitrogen trong bể điều nhiệt 60-70oC.
- Hoà tan cặn khô với 1ml n-Hexan và bổ sung 1ml dung dịch “sample Extraction Buffer” đã đƣợc pha loãng lắc kỹ 2’.
- Tiếp tục ly tâm 10’/4000g ở nhiệt độ phòng sau đó Lấy phần dịch trong suốt dƣới đáy ống nghiệm cho vào ống típ 1.5ml.
- Hút trực tiếp 50µl AOZ chuẩn/mẫu cho vào mỗi giếng chuẩn/mẫu. - Hút trực tiếp 100µl Antibody1 cho vào mỗi giếng chuẩn/ mẫu và lắc nhẹ. Sau đó ủ 30’ ở nhiệt độ phòng (chỗ tối) 20-25oC rồi rửa 3 lần mỗi lần 250µl dung dịch “Washing solution”.
- Bổ sung 150µl dung dịch Antibody2 vào mỗi giếng, ủ 30’ ở nhiệt độ phòng (chỗ tối) 20-25oC.
- Tiếp tục rửa 3 lần mỗi lần 250µl dung dịch “Washing solution”, bổ sung 100µl dung dịch TMB substrate vào mỗi giếng và ủ 15’ ở nhiệt độ phòng (chỗ tối).
- Sau đó cho 100µl chất dừng phản ứng và kết quả trên máy Elisa với bƣớc sóng 450nm có thể đọc kết quả trong vòng 60’
Tính kết quả
- Dựng đồ thị kiểm chuẩn từ kết quả của các mẫu chuẩn. - So sánh kết quả của mẫu kiểm tra với đƣờng cong chuẩn.
- Hàm lƣợng AOZ trong mẫu tƣơng ứng với mức độ hấp thụ của mẫu (OD-Optical Density) so với đƣờng cong chuẩn.
- Nhân giá trị thu đƣợc với hệ số pha loãng (hệ số pha loãng=2) sẽ thu đƣợc hàm lƣợng AOZ thực có trong mẫu. Đơn vị tính: ppt (or ppb).