Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn E.coli kháng kháng sinh và vi khuẩn

E. coli sinh enzyme β-lactamase phổ rộng (ESBL) trên gà

Mẫu phân và bệnh phẩm đem về đƣợc ria cấy trực tiếp trên môi trƣờng MC có bổ sung kháng sinh ceftazidime 2g/ml (Khan et al, 2008) rồi ủ ở 37oC trong 24 giờ. Chọn các khuẩn lạc E. coli to, tròn đều, hơi lồi, màu hồng đậm. Sau đó cấy trên môi trƣờng NA sau 24h đem thử sinh hóa để khẳng định chính xác vi khuẩn E. coli

và có mang gene đề kháng kháng sinh.

Tiếp đó thực hiện phƣơng pháp đĩa đôi kết hợp trên môi trƣờng MHA (Mueller Hinton Agar): Phƣơng pháp này đƣợc Jacoby và Han mô tả lần đầu tiên vào năm 1996 và xác định vi khuẩn E. coli sinh β-lactamse phổ rộng theo tiêu chuẩn CLSI 2014.

Phƣơng pháp thực hiện: Chuyển khuẩn lạc có mang gene đề kháng kháng sinh từ từ vào ống nghiệm chứa 2 – 3 ml nƣớc muối sinh lí 0,9% đến khi dung dịch trong ống nghiệm có độ đục bằng với độ đục của dung dịch chuẩn Mac Farland 0,5 (108

CFU/ml). Chuẩn bị 2 đĩa chứa môi trƣờng MHA, dùng que tampon vô trùng nhúng vào ống canh khuẩn đã chuẩn bị trƣớc, ép lên thành ống nghiệm cho ráo bớt nƣớc sau đó lấy ra dàn đều lên mặt thạch MHA. Sau khi mặt thạch khô tiến hành đặt các khoanh giấy kháng sinh nhƣ sau: Đĩa thứ nhất đặt các khoanh giấy kháng sinh chứa ceftazidime 30μg và chứa ceftazidime 30μg/clavulanic acid 10μg, đĩa thứ 2 đặt các khoanh giấy kháng sinh chứa cefotaxime 30μg và cefotaxime 30μg và clavulanic acid 10μg. Xong đem đĩa ủ ở 370C trong 24h, nếu có sự khác biệt hiệu số giữa 2 đĩa lớn hơn 5mm thì khẳng định là vi khuẩn E. coli sinh β-lactamase phổ rộng.

Hình 3.2 Sinh hóa khẳng định vi khuẩn E. coli

Hình 3.1 Khuẩn lạc E. coli trên môi trƣờng MC

Mẫu ( thịt, gan, phổi, phân)

Cấy trên môi trƣờng MC bổ sung Ceftazidime 370C/24h

Cấy trên môi trƣờng NA 370C/24h Kiểm tra đặc tính sinh hóa

KIA Indole VP Simmons’ Citrate MR 370C/24h

E. coli dƣơng tính 370C/24h

Xác định E. coli sinh ESBL bằng phƣơng pháp đĩa đôi kết hợp: Đĩa 1: ceftazidime 30μg và ceftazidime 30μg/ clavulanic aicd 10μg

Đĩa 2: cefotaxime 30μg và cefotaxime 30μg/ clavulanic acid 10μg 370C/24h

Khẳng định E. coli sinh ESBL:

Nếu có sự khác biệt hiệu số giữa 2 đĩa lớn hơn 5mm Giữ giống

Sơ đồ 3.2 Qui trình phân lập vi khuẩn E. coli kháng kháng sinh và vi khuẩn