3.2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu
- Số lƣợng mẫu:
Trại 1: Lấy 18 mẫu phân gà khỏe và 18 con gà bệnh tiêu chảy, trong đó lấy bệnh phẩm gà bệnh tiêu chảy là thịt, gan, phổi, phân.
Trại 2: Lấy 18 mẫu phân gà khỏe và 18 con gà bệnh tiêu chảy, trong đó lấy bệnh phẩm gà bệnh tiêu chảy là thịt, gan, phổi, phân.
- Lấy mẫu bệnh phẩm gà bệnh: Chọn ngẫu nhiên những con gà bi tiêu chảy do nghi nhiễm E. coli. Tiến hành mổ lấy từng bệnh phẩm mỗi thứ lấy khoảng 25g và lấy theo thứ tự thịt, gan, phổi và phân. Ngoài ra lấy 1g phân gà bệnh để làm định lƣợng cho vào túi vô trùng có ghi ký hiệu, đƣợc bảo quản lạnh rồi đƣa về phòng thí nghiệm phân tích.
- Lấy mẫu phân gà khỏe: Dùng tampon vô trùng đƣa vào trực tràng của gà để lấy phân rồi đƣa ngay vào ống nghiệm vô trùng có chứa môi trƣờng chuyên chở, và lấy 1g phân để làm định lƣợng cho vào túi vô trùng có ghi ký hiệu, mẫu đƣợc bảo quản lạnh rồi đƣa về phòng thí nghiệm phân tích.
3.2.2 Phƣơng pháp định lƣợng vi khuẩn E. coli trong phân gà khỏe và gà bệnh
Phƣơng pháp định lƣợng vi khuẩn E. coli đƣợc thực hiện theo TCVN 7924: 2008 Bƣớc 1: Chuẩn bị 5 ống nghiệm có chứa 9ml nƣớc muối sinh lí 0,9%.
Bƣớc 2: Cân 1g mẫu phân cho vào ống nghiệm đầu tiên rồi lắc đều trên vortex sao cho mẫu phân hòa tan đều ta đƣợc dung dịch pha loãng với nồng độ 10-1. Các nồng độ pha loãng tiếp theo thực hiện bằng cách dùng micropipette hút 1ml dung dịch nồng độ trƣớc đó cho vào ống nghiêm tiếp theo và nhƣ thế ta sẽ có các nồng độ tiếp theo là 10-2 – 10-5, đó là những nồng độ pha loãng cần thiết. Chọn 2 độ pha loãng liên tiếp để nuôi cấy, phân lập sao cho trên mỗi đĩa có tổng số khuẩn lạc thu đƣợc có từ 15 – 300 khuẩn lạc.
Bƣớc 3: Sau khi chọn đƣợc hai nồng độ thích hợp sẽ tiến hành nuôi cấy E. coli trên môi trƣờng MC. Dùng micropipette hút 0,1 ml huyễn dịch từ ống nghiệm đƣợc chọn có nồng độ cần nuôi cấy thích hợp cho lên bề mặt đĩa môi trƣờng MC, sau đó bằng phƣơng pháp chan đĩa, chan đều cho đến khi bề mặt đĩa khô, mỗi nồng độ lập lại ở hai đĩa sau đó đem ủ ở 370C trong 24h.
Nhận diện khuẩn lạc E. coli: Trên môi trƣờng MC khuẩn lạc E. coli to, tròn đều, hơi lồi,có màu hồng đậm. Chọn 1 khuẩn lạc điển hình cấy trên môi trƣờng NA đem ủ ở 370C trong 24h. Thử sinh hóa để khẳng định là vi khuẩn E. coli.
Cách tính kết quả:
Đếm tất cả các khuẩn lạc đạt tiêu chuẩn xuất hiện trên các đĩa sau khi đem ủ ở các nồng độ thích hợp rồi áp dụng công thức tính định lƣợng vi khuẩn E. coli:
d n n V C X ) 2 * 2 1 ( Trong đó: X số khuẩn lạc CFU/ml C tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc V thể tích dung dịch pha loãng
n1 số đĩa đƣợc giữ lại ở nồng độ pha loãng thấp nhất n2 số đĩa đƣợc giữ lại ở nồng độ pha loãng thấp tiếp theo d hệ số pha loãng tƣơng ứng với nồng độ pha loãng thấp nhất
Mẫu phân (1g)
Huyễn dịch vi khuẩn Hút 0,1ml Chan trên môi trƣờng MC
370C/24h Đếm khuẩn lạc
Chọn khuẩn lạc điển hình cấy trên môi trƣờng NA 370C/24h
Kiểm tra đặc tính sinh hóa
KIA Indole VP Simmons’ Citrate MR 370C/24h
E. coli dƣơng tính
Phương pháp kiểm tra đặc tính sinh hóa vi khuẩn E. coli
Vi khuẩn E. coli sau khi đƣợc tăng sinh trên môi trƣờng NA, tiến hành kiểm tra
đặc tính sinh hóa của vi khuẩn trên các môi trƣờng KIA, LIM, VP, MR-VP và Simmons’ Citrat.
Môi trƣờng KIA dùng để kiểm tra sự lên đƣờng glucose, lactose, sinh hơi và sinh H2S của vi khuẩn. Nếu vi khuẩn chỉ lên đƣờng glucose thì phần thạch nghiêng của môi trƣờng có màu đỏ và phần thạch đứng có màu vàng. Nếu lactose đƣợc sử dụng thì cả hai phần thạch đứng và thạch nghiêng đều có màu vàng. Sự sinh hơi đƣợc ghi nhận bởi bọt khí hay sự bể, nứt của cột thạch. Nếu vi khuẩn sản sinh H2S thì môi trƣờng sẽ có màu đen.
Môi trƣờng LIM dùng để kiểm tra tính sinh Indole của vi khuẩn. Trên môi trƣờng này, sau khi nhỏ thuốc thử Kovacs’ vào nếu trên bề mặt môi trƣờng xuất hiện vòng đỏ thì phản ứng dƣơng tính và ngƣợc lại nếu trên bề mặt môi trƣờng không xuất hiện vòng đỏ thì Indole âm tính.
Môi trƣờng VP dùng để kiểm tra tính di động và tính sinh aceton của vi khuẩn. Vi khuẩn có khả năng di động sẽ làm đục môi trƣờng. Ngƣợc lại, vi khuẩn không có khả năng di động thì chỉ thấy vi khuẩn mọc theo đƣờng que cấy, môi trƣờng xung quanh trong. Trên môi trƣờng VP, sau khi cho thuốc thử VP1, VP2 vào nếu trên bề mặt môi trƣờng có vòng đỏ thì chứng tỏ vi khuẩn có khả năng sinh aceton. Ngƣợc lại, nếu trên bề mặt môi trƣờng không xuất hiện vòng đỏ thì vi khuẩn không có khả năng sinh aceton.
Môi trƣờng MR dùng để kiểm tra tính sử dụng đƣờng của vi khuẩn. Nhỏ lên bề mặt môi trƣờng vài giọt thuốc thử Methyl Red, phản ứng dƣơng tính sẽ có vòng đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trƣờng và ngƣợc lại.
Môi trƣờng Simmons’ citrate dùng để kiểm tra khả năng sử dụng citrate thay nguồn carbon của vi khuẩn. Trên môi trƣờng này, vi khuẩn cho kết quả dƣơng tính khi màu của môi trƣờng chuyển từ xanh lục sang xanh dƣơng.
Bảng 3.1: Định danh vi khuẩn E. coli bằng phản ứng sinh hóa
Vi khuẩn
Di động
Glucose Lactose H2S Indole MR VP Simmons’ Citrate
E. coli + +h +h - + + - -
Klebsiella - +h +h + + - + +
Enterobacter + +h +h - - - - +
3.2.3 Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn E. coli kháng kháng sinh và vi khuẩn
E. coli sinh enzyme β-lactamase phổ rộng (ESBL) trên gà
Mẫu phân và bệnh phẩm đem về đƣợc ria cấy trực tiếp trên môi trƣờng MC có bổ sung kháng sinh ceftazidime 2g/ml (Khan et al, 2008) rồi ủ ở 37oC trong 24 giờ. Chọn các khuẩn lạc E. coli to, tròn đều, hơi lồi, màu hồng đậm. Sau đó cấy trên môi trƣờng NA sau 24h đem thử sinh hóa để khẳng định chính xác vi khuẩn E. coli
và có mang gene đề kháng kháng sinh.
Tiếp đó thực hiện phƣơng pháp đĩa đôi kết hợp trên môi trƣờng MHA (Mueller Hinton Agar): Phƣơng pháp này đƣợc Jacoby và Han mô tả lần đầu tiên vào năm 1996 và xác định vi khuẩn E. coli sinh β-lactamse phổ rộng theo tiêu chuẩn CLSI 2014.
Phƣơng pháp thực hiện: Chuyển khuẩn lạc có mang gene đề kháng kháng sinh từ từ vào ống nghiệm chứa 2 – 3 ml nƣớc muối sinh lí 0,9% đến khi dung dịch trong ống nghiệm có độ đục bằng với độ đục của dung dịch chuẩn Mac Farland 0,5 (108
CFU/ml). Chuẩn bị 2 đĩa chứa môi trƣờng MHA, dùng que tampon vô trùng nhúng vào ống canh khuẩn đã chuẩn bị trƣớc, ép lên thành ống nghiệm cho ráo bớt nƣớc sau đó lấy ra dàn đều lên mặt thạch MHA. Sau khi mặt thạch khô tiến hành đặt các khoanh giấy kháng sinh nhƣ sau: Đĩa thứ nhất đặt các khoanh giấy kháng sinh chứa ceftazidime 30μg và chứa ceftazidime 30μg/clavulanic acid 10μg, đĩa thứ 2 đặt các khoanh giấy kháng sinh chứa cefotaxime 30μg và cefotaxime 30μg và clavulanic acid 10μg. Xong đem đĩa ủ ở 370C trong 24h, nếu có sự khác biệt hiệu số giữa 2 đĩa lớn hơn 5mm thì khẳng định là vi khuẩn E. coli sinh β-lactamase phổ rộng.
Hình 3.2 Sinh hóa khẳng định vi khuẩn E. coli
Hình 3.1 Khuẩn lạc E. coli trên môi trƣờng MC
Mẫu ( thịt, gan, phổi, phân)
Cấy trên môi trƣờng MC bổ sung Ceftazidime 370C/24h
Cấy trên môi trƣờng NA 370C/24h Kiểm tra đặc tính sinh hóa
KIA Indole VP Simmons’ Citrate MR 370C/24h
E. coli dƣơng tính 370C/24h
Xác định E. coli sinh ESBL bằng phƣơng pháp đĩa đôi kết hợp: Đĩa 1: ceftazidime 30μg và ceftazidime 30μg/ clavulanic aicd 10μg
Đĩa 2: cefotaxime 30μg và cefotaxime 30μg/ clavulanic acid 10μg 370C/24h
Khẳng định E. coli sinh ESBL:
Nếu có sự khác biệt hiệu số giữa 2 đĩa lớn hơn 5mm Giữ giống
Sơ đồ 3.2 Qui trình phân lập vi khuẩn E. coli kháng kháng sinh và vi khuẩn
3.2.4 Phƣơng pháp xác định sự đề kháng của vi khuẩn E. coli đối với kháng sinh nhóm β-lactam phổ rộng (ESBL) trên gà sinh nhóm β-lactam phổ rộng (ESBL) trên gà
Xác định tính đề kháng của vi khuẩn E. coli đối với kháng sinh nhóm β-lactam phổ rộng theo Bauer et al, (1966) đĩa kháng sinh khuếch tán trên môi trƣờng MHA. Nghiên cứu thực hiện chọn 12 loại kháng sinh làm kháng sinh đồ.
Chuẩn bị canh khuẩn:
Vi khuẩn E. Coli sinh ESBL tiến hành cấy trên môi trƣờng NA và ủ ấm ở 370C trong 24 giờ. Sau đó, chuyển khuẩn lạc có mang gene đề kháng kháng sinh từ từ vào ống nghiệm chứa 2 – 3 ml nƣớc muối sinh lí 0.9% đến khi dung dịch trong ống nghiệm có độ đục bằng với độ đục của dung dịch chuẩn Mac Farland 0,5 (108
CFU/ml).
Phƣơng pháp làm kháng sinh đồ:
Dùng que tăm bông vô trùng nhúng vào ống canh khuẩn đã chuẩn bị trƣớc, ép lên thành ống nghiệm cho ráo bớt nƣớc sau đó lấy ra dàn đều lên mặt thạch MHA. Chờ mặt thạch khô, dùng kẹp vô trùng kẹp các đĩa kháng sinh đặt lên mặt thạch. Đặt đĩa kháng sinh sao cho các đĩa cách nhau 2,5 – 3cm và cách rìa đĩa thạch từ 2 – 2,5cm. Thạch trong đĩa có độ dày 3,5 – 4mm. Nhƣ vậy, với một đĩa thạch có đƣờng kính 90mm có thể đặt 7 – 8 đĩa kháng sinh. Ủ đĩa thạch ở 370
C trong 24 giờ, sau đó đọc kết quả.
Đọc kết quả kháng sinh đồ:
Việc đọc kết quả bằng cách đo đƣờng kính vòng vô khuẩn, sau đó so sánh với bảng vòng vô khuẩn tiêu chuẩn Clinical and Laboratory Standars Institute (CLSI, 2014) để xác định kháng sinh nhạy, trung gian, đề kháng.
Huyễn dịch vi khuẩn
Môi trƣờng MHA, đặt các đĩa kháng sinh 370C/24h
Đo đƣờng kính vô khuẩn (mm)
Xác định các loại kháng sinh nhay, trung gian, đề khang theo tiêu chuẩn CLSI (2014)
Bảng 3.2: Bảng tiêu chuẩn phân tích kết quả đƣờng kính vô khuẩn (CLSI, 2014) Kháng sinh Tên viết tắt Lƣợng kháng sinh (μg) Đƣờng kính vô khuẩn (mm) Đề kháng ()
Trung gian Nhạy cảm () Ampicillin Am 10μg 13 14 - 16 17 Ceftazidime Cz 30μg 17 18 – 20 21 Ceftazidime/ clavulanic acid Zc 30μg/10μg 12 13 – 17 18 Cefotaxime Ct 30μg 22 23 – 25 26 Cefaclor Cr 30μg 14 15 – 17 18 Cefuroxime Cu 30μg 14 15 – 17 18 Streptomycin Sm 10μg 11 12 – 14 15 Amikacin Ak 30μg 14 15 – 16 17 Tetracycline Te 30μg 11 12 – 14 15 Doxycycline Dx 30μg 10 11 – 13 14 Trimethoprim/ sulfamethoxazol Bt 5μg 10 11 – 15 16 Norfloxacin Nr 10μg 12 13 – 16 17 3.2.5 Phƣơng pháp xử lí số liệu:
Số liệu đƣợc xử lý bằng phƣơng pháp sử dụng phần mềm Minitab 16.0, Chi square yates.
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Tổng quan về địa điểm lấy mẫu thực hiện đề tài tại hai trại gà thả vƣờn thuộc huyện Mỏ Cày Bắc tỉnh Bến Tre thuộc huyện Mỏ Cày Bắc tỉnh Bến Tre
Điều kiện tự nhiên huyện Mỏ Cày Bắc tỉnh Bến Tre
(http://vi.wikipedia.org/wiki/Ph%C3%BA_M%E1%BB%B9,_M%E1%BB%8F_C%C3% A0y_B%E1%BA%AFc)
Vị trí địa lí: Huyện Mỏ Cày Bắc có địa giới hành chính nhƣ sau: Đông giáp huyện Mỏ Cày Nam, huyện Giồng Trôm; Tây giáp huyện Chợ Lách; Nam giáp tỉnh Vĩnh Long; Bắc giáp huyện Châu Thành, thành phố Bến Tre.
Khí hậu: tỉnh Bến Tre nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa cận xích đạo, với hai mùa rõ rệt mùa mƣa từ tháng 5 đến tháng 11, mùa khô từ tháng 12 đến tháng 4 năm sau. Lƣợng mƣa trung bình hàng năm từ 2.000 đến 2.300 mm, nhiệt độ trung bình hàng năm từ 260C – 270C. Với vị trí nằm tiếp giáp biển Đông, nhƣng Bến Tre ít chịu ảnh hƣởng của bão lũ, khí hậu ôn hòa, mát mẻ quanh năm… Đây là điều kiện thuận lợi cho việc đầu tƣ, sản xuất, kinh doanh và du lịch của tỉnh.
Tình hình chăn nuôi gà thả vƣờn tại huyện Mỏ Cày Bắc tỉnh Bến Tre: Chăn nuôi gà thả vƣờn là một trong những thế mạnh của huyện Mỏ Cày Bắc. Đặc biệt trong những năm gần đây việc chăn nuôi gia cầm trong huyện phát triển khá nhanh, tổng đàn gia cầm hiện nay 700.000 con, chủ yếu là giống gà tàu lai địa phƣơng, bình quân mỗi hộ nuôi với quy mô đàn từ 500-1.000 con (nguồn từ thú y xã Phú Sơn huyện Mỏ Cày Bắc tỉnh Bến Tre).
Tổng quan về địa điểm lấy mẫu
Trại 1: Lê Minh Tiến, 299/60 ấp Phú Thạnh, xã Phú Mỹ, huyện Mỏ Cày Bắc, tỉnh Bến Tre.
Tổng đàn: 1.000 con. Mô hình nuôi hở, diện tích trại gồm có chuồng úm rộng 35m2 , tổng diện tích trại 80m2. Sử dụng thức ăn của ANOVA thức hỗn hợp dành cho gà thịt (22 – 42 ngày tuổi), gà đƣợc nuôi trong chuồng úm đến 6 tuần tuổi sau đó đƣợc thả ra vƣờn đến khi xuất thịt là trên 3 tháng tuổi, trọng lƣợng xuất thịt trung bình là 1,6kg.
Bảng 4.1 Phòng bệnh bằng kháng sinh tại trại 1
Ngày tuổi Buổi Thuốc Liều dùng
1 – 3 Sáng Vet-moxcol 1g/ 2 lít H2O/ 3 ngày 6 – 7 Sáng Imequyl 20% 1ml/ 1 lít H2O/ 4 ngày 8 – 12 Sáng Flodox 1g/ 1 lít H2O/ 5 ngày 15 – 17 Sáng Isotyl-250 1ml/ 3 lít H2O/ 3 ngày 19 – 21 Sáng Vet-moxcol 1g/ 2 lít H2O/ 3 ngày 24 – 25 Sáng Vet-moxcol 1g/ 2 lít H2O/ 2 ngày 26 – 28 Sáng Isotyl-250 1ml/ 3 lít H2O/ 3 ngày
Trại 2: Đinh Văn Chính, ấp Lăng Tây, xã Phú Sơn, huyện Mỏ Cày Bắc, tỉnh Bến Tre.
Tổng đàn: 1.000 con. Mô hình nuôi hở, diện tích trại gồm có chuồng úm rộng 8m2, tổng diện tích trại 1.000m2. Sử dụng thức ăn của ANOVA thức ăn hỗn hợp dành cho gà thịt (22 – 42 ngày tuổi), gà đƣợc nuôi trong chuồng úm đến 6 tuần tuổi sau đó đƣợc thả ra vƣờn đến khi xuất thịt là trên 3 tháng tuổi, trọng lƣợng xuất thịt trung bình là 1,6kg.
Bảng 4.2 Phòng bệnh bằng kháng sinh tại trại 2
Ngày tuổi Buổi Thuốc Liều dùng
1 – 4 Sáng Vet-moxcol 1g/ 2 lít H2O/ 4 ngày 5 – 7 Sáng Neo-pennox 1g/ 1 lít H2O/ 3 ngày 8 – 10 Sáng Vet-moxcol 1g/ 2 lít H2O/ 3 ngày 12 – 14 Sáng Enrox-100 1ml/ 2 lít H2O/ 3 ngày 18 – 20 Sáng Vet-moxcol 1g/ 2 lít H2O/ 3 ngày 23 – 25 Sáng Oxystrepsol 2g/ 1 lít H2O/ 3 ngày 26 – 28 Sáng Coli 102 2g/ 1 lít H2O/ 3 ngày
4.2 Kết quả khảo sát gà bệnh tiêu chảy chết do nghi nhiễm vi khuẩn E. coli tại hai trại thuộc huyện Mỏ Cày Bắc tỉnh Bến Tre
Qua theo dõi tình hình gà bị tiêu chảy chết tại hai trại thuộc huyện Mỏ Cày Bắc tỉnh Bến Tre có các biểu hiện nghi nhiễm E. coli. Kết quả đƣợc ghi nhận lại và trình bày ở bảng 4.1
Bảng 4.3 Tỷ lệ gà bệnh tiêu chảy chết do nghi nhiễm vi khuẩn E. coli tại hai trại
Địa điểm Số con khảo sát Số con chết Tỷ lệ (%)
Trại 1 1.000 56 5,60
Trại 2 1.000 93 9,30
(P = 0,002)
Tổng 2.000 149 7,45
Kết quả bảng 4.3 cho thấy, gà bị tiêu chảy chết ở hai trại chiếm tỷ lệ là 7,45%. Trong đó, gà ở trại 2 bị tiêu chảy chết chiếm tỷ lệ 9,30% cao hơn so với trại 1 (5,60%) và sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (P = 0,002). Điều này có thể là do mật độ nuôi gà trại 2 (125con/ m2) cao hơn trại 1 (30 con/m2). Chuồng nền từ 0 – 6