Phƣơng pháp định lƣợng vi khuẩn E. coli đƣợc thực hiện theo TCVN 7924: 2008 Bƣớc 1: Chuẩn bị 5 ống nghiệm có chứa 9ml nƣớc muối sinh lí 0,9%.
Bƣớc 2: Cân 1g mẫu phân cho vào ống nghiệm đầu tiên rồi lắc đều trên vortex sao cho mẫu phân hòa tan đều ta đƣợc dung dịch pha loãng với nồng độ 10-1. Các nồng độ pha loãng tiếp theo thực hiện bằng cách dùng micropipette hút 1ml dung dịch nồng độ trƣớc đó cho vào ống nghiêm tiếp theo và nhƣ thế ta sẽ có các nồng độ tiếp theo là 10-2 – 10-5, đó là những nồng độ pha loãng cần thiết. Chọn 2 độ pha loãng liên tiếp để nuôi cấy, phân lập sao cho trên mỗi đĩa có tổng số khuẩn lạc thu đƣợc có từ 15 – 300 khuẩn lạc.
Bƣớc 3: Sau khi chọn đƣợc hai nồng độ thích hợp sẽ tiến hành nuôi cấy E. coli trên môi trƣờng MC. Dùng micropipette hút 0,1 ml huyễn dịch từ ống nghiệm đƣợc chọn có nồng độ cần nuôi cấy thích hợp cho lên bề mặt đĩa môi trƣờng MC, sau đó bằng phƣơng pháp chan đĩa, chan đều cho đến khi bề mặt đĩa khô, mỗi nồng độ lập lại ở hai đĩa sau đó đem ủ ở 370C trong 24h.
Nhận diện khuẩn lạc E. coli: Trên môi trƣờng MC khuẩn lạc E. coli to, tròn đều, hơi lồi,có màu hồng đậm. Chọn 1 khuẩn lạc điển hình cấy trên môi trƣờng NA đem ủ ở 370C trong 24h. Thử sinh hóa để khẳng định là vi khuẩn E. coli.
Cách tính kết quả:
Đếm tất cả các khuẩn lạc đạt tiêu chuẩn xuất hiện trên các đĩa sau khi đem ủ ở các nồng độ thích hợp rồi áp dụng công thức tính định lƣợng vi khuẩn E. coli:
d n n V C X ) 2 * 2 1 ( Trong đó: X số khuẩn lạc CFU/ml C tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc V thể tích dung dịch pha loãng
n1 số đĩa đƣợc giữ lại ở nồng độ pha loãng thấp nhất n2 số đĩa đƣợc giữ lại ở nồng độ pha loãng thấp tiếp theo d hệ số pha loãng tƣơng ứng với nồng độ pha loãng thấp nhất
Mẫu phân (1g)
Huyễn dịch vi khuẩn Hút 0,1ml Chan trên môi trƣờng MC
370C/24h Đếm khuẩn lạc
Chọn khuẩn lạc điển hình cấy trên môi trƣờng NA 370C/24h
Kiểm tra đặc tính sinh hóa
KIA Indole VP Simmons’ Citrate MR 370C/24h
E. coli dƣơng tính
Phương pháp kiểm tra đặc tính sinh hóa vi khuẩn E. coli
Vi khuẩn E. coli sau khi đƣợc tăng sinh trên môi trƣờng NA, tiến hành kiểm tra
đặc tính sinh hóa của vi khuẩn trên các môi trƣờng KIA, LIM, VP, MR-VP và Simmons’ Citrat.
Môi trƣờng KIA dùng để kiểm tra sự lên đƣờng glucose, lactose, sinh hơi và sinh H2S của vi khuẩn. Nếu vi khuẩn chỉ lên đƣờng glucose thì phần thạch nghiêng của môi trƣờng có màu đỏ và phần thạch đứng có màu vàng. Nếu lactose đƣợc sử dụng thì cả hai phần thạch đứng và thạch nghiêng đều có màu vàng. Sự sinh hơi đƣợc ghi nhận bởi bọt khí hay sự bể, nứt của cột thạch. Nếu vi khuẩn sản sinh H2S thì môi trƣờng sẽ có màu đen.
Môi trƣờng LIM dùng để kiểm tra tính sinh Indole của vi khuẩn. Trên môi trƣờng này, sau khi nhỏ thuốc thử Kovacs’ vào nếu trên bề mặt môi trƣờng xuất hiện vòng đỏ thì phản ứng dƣơng tính và ngƣợc lại nếu trên bề mặt môi trƣờng không xuất hiện vòng đỏ thì Indole âm tính.
Môi trƣờng VP dùng để kiểm tra tính di động và tính sinh aceton của vi khuẩn. Vi khuẩn có khả năng di động sẽ làm đục môi trƣờng. Ngƣợc lại, vi khuẩn không có khả năng di động thì chỉ thấy vi khuẩn mọc theo đƣờng que cấy, môi trƣờng xung quanh trong. Trên môi trƣờng VP, sau khi cho thuốc thử VP1, VP2 vào nếu trên bề mặt môi trƣờng có vòng đỏ thì chứng tỏ vi khuẩn có khả năng sinh aceton. Ngƣợc lại, nếu trên bề mặt môi trƣờng không xuất hiện vòng đỏ thì vi khuẩn không có khả năng sinh aceton.
Môi trƣờng MR dùng để kiểm tra tính sử dụng đƣờng của vi khuẩn. Nhỏ lên bề mặt môi trƣờng vài giọt thuốc thử Methyl Red, phản ứng dƣơng tính sẽ có vòng đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trƣờng và ngƣợc lại.
Môi trƣờng Simmons’ citrate dùng để kiểm tra khả năng sử dụng citrate thay nguồn carbon của vi khuẩn. Trên môi trƣờng này, vi khuẩn cho kết quả dƣơng tính khi màu của môi trƣờng chuyển từ xanh lục sang xanh dƣơng.
Bảng 3.1: Định danh vi khuẩn E. coli bằng phản ứng sinh hóa
Vi khuẩn
Di động
Glucose Lactose H2S Indole MR VP Simmons’ Citrate
E. coli + +h +h - + + - -
Klebsiella - +h +h + + - + +
Enterobacter + +h +h - - - - +