3.1.1 Đối tượng thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành trên 19 mẫu tinh cọng rạ ở 2 giống bò Brahman lai, Linousine (giống Brahman lai 10 mẫu, giống Limousine 9 mẫu) được thu thập tại trung tâm giống Phúc Vinh, thành phố Trà Vinh.
3.1.2 Thời gian thí nghiệm
Đề tài được tiến hành từ ngày 15 tháng 2 năm 2014 đến ngày 2 tháng 5 năm 2014.
3.1.3 Địa điểm thí nghiệm
Mẫu tinh cọng rạ được thu thập tại trung tâm giống Phúc Vinh, thành phố Trà Vinh. Mẫu tinh cọng rạ sau khi thu thập được trữ trong bình nitơ lỏng và được kiểm tra đánh giá tại phòng thí nghiệm Sản khoa và Gieo tinh nhân tạo (E202), Bộ môn Thú Y, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.4 Dụng cụ và hóa chất 3.1.4.1 Dụng cụ 3.1.4.1 Dụng cụ
- Bình nitơ 5 lít trữ tinh cọng rạ, nitơ lỏng
- Kính hiển vi quang học
- Buồng đếm Neubauer
- Waterbath, nhiệt kế, pen.
- Lame, lamelle, ống đong 20ml, cốc thủy tinh 50ml, cốc thủy tinh 100ml
- Đèn cồn, cồn 90o
- Pipette 1ml, pipette 2ml, micropipette 20µl, micropipette 50µl, micropipette 100µl
3.1.4.2 Hóa chất
- Dung dịch NaCl 1%, dung dịch NaCl 3%, nước cất.
- Blue de methylen 1%.
3.2 Phương pháp thí nghiệm
Hình 3.1: Sơ đồ mô tả thí nghiệm của đề tài
Bố trí thí nghiệm: Đề tài được tiến hành dựa trên 2 thí nghiệm. Thí nghiệm 1 được tiến hành với mục đích xác định thời gian rã đông thích hợp (30 giây hoặc 2 phút hoặc 5 phút) dựa trên 2 chỉ tiêu là hoạt lực và tỷ lệ tinh trùng sống. Thí nghiệm 2 được thực hiện nhằm để đánh giá chất lượng tinh cọng rạ của hai giống bò Brahman lai và Limousine.
Thí nghiệm 1:
Để xác định thời gian rã đông thích hợp, cọng rạ được rã đông ở bình rã đông trong 30 giây. Sau đó tinh dịch của cọng rạ được chuyển sang ống nghiệm đã làm ấm và trữ ở nhiệt độ giống với nhiệt độ bình rã đông (37oC). Mẫu tinh được kiểm tra ở các khoảng thời gian 30 giây, 2 phút và 5 phút sau khi rã đông. Các chỉ tiêu được kiểm tra là hoạt lực tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng sống. Dựa vào tiêu chuẩn 10TCN 531 – 2002 để xác định thời điểm rã đông cho kết quả tốt nhất.
Thí nghiệm
Mục đích 1: Xác định thời gian rã đông thích hợp (30 giây hoặc 2 phút hoặc 5 phút) dựa trên 2 chỉ tiêu là hoạt lực và tỷ lệ tinh trùng sống
Mục đích 2: Đánh giá chất lượng tinh cọng rạ của hai giống bò Brahman lai và Limousine Hoạt lực tinh trùng Tỷ lệ tinh trùng sống Hoạt lực tinh trùng Tỷ lệ tinh trùng sống Nồng độ tinh trùng Tỷ lệ kỳ hình Tiêu chuẩn 10TCN 531 - 2002
3.2.1 Rã đông tinh cọng rạ
Quá trình rã đông tinh cọng rạ được tiến hành bào gồm các bước như sau:
Dùng pen gấp tinh cọng rạ từ bình nitơ lỏng cho vào bình rã đông có chứa nước ấm có nhiệt độ 37oC. Chú ý, thao tác gấp phải nhanh chóng nhằm tránh ảnh hưởng đến chất lượng cọng rạ. Trường hợp không thể lấy được cọng rạ trong khoảng 30 giây thì nhanh chóng đặt quặng chứa những cọng rạ về vị trí cũ, sau đó tiến hành lấy lại. Quặng chứa cọng rạ phải đặt phía dưới miệng bình nitơ lỏng. Cọng rạ được đặt trong bình rã đông 30 giây, sau đó cọng rạ được lấy ra và cắt 2 đầu tinh dịch được chuyển sang ống nghiệm sạch (đã được làm ấm và được trữ trong Waterbath được điều chỉnh nhiệt độ là 37oC).
3.2.2 Đánh giá chất lượng tinh cọng rạ sau khi rã đông 30 giây, 2 phút, 5 phút dựa vào 2 chỉ tiêu hoạt lực và tỷ lệ tinh trùng sống. phút dựa vào 2 chỉ tiêu hoạt lực và tỷ lệ tinh trùng sống.
3.2.2.1 Hoạt lực của tinh trùng
Hoạt lực của tinh trùng là một chỉ tiêu quan trọng, có ảnh hưởng đặc biệt trong pha loãng tinh dịch và khả năng thụ tinh. Sức hoạt động của tinh trùng được đặc trưng bởi sự hình thành các dòng tinh trùng với tốc độ di chuyển khác nhau, cường độ khác nhau tùy thuộc vào hiệu quả của việc rã đông.
Tiến hành: dùng micropipette hút 1 giọt (30µl) tinh dịch từ ống nghiệm
sau khi rã đông 30 giây (không được lấy ống nghiệm ra khỏi bình nước ấm để tinh dịch được tiếp tục rã đông ở thời gian lâu hơn) nhỏ lên lame đã được làm ấm và dùng lamelle ấm đậy lại. Sau đó mẫu tinh được đánh giá nhanh hoạt lực sử dụng kính hiển vi với vật kính 10x. Tiếp tục thực hiện lặp lại quá trình trên khi thời gian rã đông đạt 2 phút và 5 phút.
Việc đánh giá hoạt lực tinh trùng thông qua điểm số bằng cách quy đổi từ tỷ lệ phần trăm tương ứng được thực hiện quy định ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1: Thang điểm đánh giá hoạt lực tinh trùng dựa trên phần trăm tinh trùng tiến thẳng (Hoàng Kim Giao, 1997)
Thang điểm % tinh trùng hoạt động tiến thẳng
1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 95 – 100 85 – 95 75 – 85 65 – 75 55 – 65 45 – 55 35 – 45 25 – 35 15 – 25 5 – 15 0 3.2.2.2 Tỷ lệ tinh trùng sống
Dựa vào tiêu chuẩn 10TCN 531 – 2002 để đánh giá chỉ tiêu tỷ lệ tinh trùng sống sau khi rã đông ở thời gian thích hợp (thời gian khi tinh trùng có hoạt lực cao nhất). Sau khi xác định thời gian rã đông thích hợp, chỉ tiêu tỷ lệ tinh trùng sống được tiến hành như sau:
Tiến hành: Dùng micropipette hút 30 µl tinh dịch nhỏ lên một miếng lame đã được làm ấm, sau đó nhỏ 2 – 3 giọt Rough de Eosin 5% (đã được làm ấm ở 37oC) vào giọt tinh và trộn đều. Lấy một giọt hỗn hợp tinh dịch và thuốc nhuộm cho vào lame khác, đàn mỏng mẫu một cách từ từ và đều tay. Để khô mẫu trong 2 phút sau đó quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 10x. Đếm tối thiểu 300 tinh trùng ở một vài vi trường một cách ngẫu nhiên và xác định tỷ lệ tinh trùng chết bằng cách đếm những tinh trùng bắt màu hồng đậm của thuốc nhuộm.
Công thức xác định tỷ lệ tinh trùng sống Tỷ lệ tinh trùng sống = Số tinh trùng sống/300
3.2.3 Đánh giá chất lượng tinh cọng rạ hai giống bò Brahman lai và Limousine sau khi rã đông 2 phút Limousine sau khi rã đông 2 phút
Thí nghiệm 2: Các chỉ tiêu nồng độ tinh trùng, hoạt lực tinh trùng, tỷ lệ tinh
trùng sống và kỳ hình của 2 giống bò Brahman lai và Limousine được xác định ở thời điểm rã đông tối ưu được tiến hành như sau:
Sử dụng buồng đếm Neubauer để kiểm tra nồng độ tinh dịch sau rã đông.
Tiến hành: Sau khi rã đông tinh cọng rạ ở thời gian rã đông 2 phút, dùng micropipette hút 50µl tinh dịch cho vào ống nghiệm đã chuẩn bị trước có chứa 5ml dung dịch NaCl 3%, lúc này độ pha loãng của tinh dịch là 100 lần. Dùng micropipette khuấy đều, sau đó rút tinh dịch đã được pha loãng đặt lên cạnh lamelle của buồng đếm và bơm nhẹ, nhờ hiện tượng mao dẫn, tinh dịch đã được pha loãng được hút vào trong buồng đếm. Chú ý: không được để dung dịch tràn ra ngoài những cạnh của buồng đếm. Đặt buồng đếm lên kính hiển vi quang học và đếm số lượng tinh trùng ở cả 2 buồng đếm. Có thể đếm tinh trùng ở vật kính 20x hoặc 40x.
Công thức tính tinh trùng sau khi đếm:
C/mm3 = số TT trung bình đếm được x độ pha loãng x V buồng đếm C/mm3 = số TT trung bình đếm được x 100 x 50
C/ml = số TT trung bình đếm được x 100 x 50 x 103
C/0,25ml = số TT trung bình đếm được x 100 x 50 x 103 x 0,25 Trong đó: C: số tinh trùng trên một đơn vị thể tích
TT: tinh trùng V: thể tích
Để tránh sai sót không cần thiết, ta đếm cả 2 buồng sau đó lấy số trung bình. Tuy nhiên kết quả 2 lần có thể sai khác 10% và có thể lên đến 20% là đạt yêu cầu.
3.2.2.2 Kiểm tra hoạt lực tinh trùng
Hoạt lực tinh trùng của 2 giống bò Brahman lai và Limousine được tiến hành tương tự như ở Thí nghiệm 1. Tuy nhiên, đối với Thí nghiệm 2, chỉ kiểm tra hoạt lực 1 lần ở thời điểm rã đông tối ưu đã biết trước từ Thí nghiệm 1.
3.2.2.3 Kiểm tra tỷ lệ tinh trùng sống
Phương pháp tiến hành kiểm tra tỷ lệ tinh trùng sống của 2 giống bò Brahman lai và Limousine được thực hiện tương tự như ở Thí nghiệm 1.
3.2.2.4 Kiểm tra tinh trùng kỳ hình
Chỉ tiêu kỳ hình là chỉ tiêu rất quan trọng đóng góp vào việc đánh giá chất lượng tinh cọng rạ. Một cọng rạ đạt chuẩn phải có tỷ lệ kỳ hình thấp. Nếu tỷ lệ kỳ hình lớn hơn 20% và tỷ lệ kỳ hình ở đầu cao hơn 5% thì liều tinh đó không đạt yêu cầu.
Tiến hành: dùng micropipette hút 30µl tinh dịch từ ống nghiệm lên lame và dùng lamelle đàn mỏng mẫu dọc theo chiều dài lame. Làm khô tiêu bản vừa được đàn mỏng dưới ngọn lửa đèn cồn.
Nhuộm tiêu bản: sau khi tiêu bản đã khô, nhỏ 3 giọt Blue de methylen
1% lên tiêu bản, trãi đều thuốc nhuộm khắp lame đã được đàn mỏng một lớp tinh dịch, để khô trong khoảng 5 phút để đảm bảo tiêu bản bắt màu hoàn toàn. Dùng nước cất rửa nhẹ tiêu bản, làm khô tiêu bản một lần nữa trên ngọn lửa đèn cồn. Tiến hành quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 10x hoặc 40x. Kiểm tra tổng số 300 tinh trùng, xác định tỷ lệ kỳ hình bằng cách đếm tinh trùng kỳ hình có trong 1 – 2 vi trường (300 tinh trùng). Trong GTNT, tổng số tinh trùng kỳ hình có thể chiếm 18% trên tổng số tinh trùng trong một liều gieo vẫn được chấp nhận. Tuy nhiên, kỳ hình đầu chiếm không quá 5%.
Công thức xác định tỷ lệ tinh trùng kỳ hình
Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình = Số tinh trùng trùng kỳ hình/300
3.3 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu loạt lực, nồng độ tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng sống và kỳ hình được xử lý bằng phương pháp ANOVA, sử dụng phần mềm thống kê Minitab 16.2.3.0.
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 So sánh chất lượng tinh cọng rạ khi rã đông ở 30 giây, 2 phút, 5 phút
Trong cùng điều kiện như nhiệt độ rã đông, kỹ thuật kiểm tra, môi trường xung quanh thời gian rã đông tác động đến 2 chỉ tiêu vô cùng quan trọng là hoạt lực tinh trùng và tỷ lệ tinh trùng sống. Đây là 2 yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến tỷ lệ đậu thai sau khi phối giống cho bò cái.
4.1.1 Hoạt lực tinh trùng
Hoạt lực tinh trùng là tỷ lệ số tinh trùng tiến thẳng trên tổng số tinh trùng. Thông thường khi thực hiện GTNT, dẫn tinh viên sẽ thực hiện việc rã đông trong nước ấm với nhiệt độ 35 – 38oC trong 30 giây (Đinh Văn Cải, 2007). Tuy nhiên không phải cọng rạ nào cũng đảm bảo sẽ đạt tiêu chuẩn hoạt lực cho phép (>40%).
Sau khi đánh giá 19 tinh cọng rạ ở thời gian rã đông 30 giây, 2 phút, 5 phút thu được kết quả trình bày ở Bảng 4.1:
Bảng 4.1: Hoạt lực trung bình tinh cọng rạ ở thời gian rã đông 30 giây, 2 phút và 5 phút
Chỉ tiêu Thời gian rã đông
30 giây 2 phút 5 phút A N 19 19 19 Mean±SE (%) 56,368a ± 6,525 60,474a ± 5,264 47,947b ± 6,794 A đạt tiêu chuẩn N 19 19 16 Mean±SE (%) 56,368a ± 6,525 60,474a ± 5,264 50,563b ± 3,898 Tỷ lệ (%) 100 100 84,2
Ghi chú: các giá trị trong cùng một hàng mang những ký hiệu a, b khác nhau thì sai khác nhau (p<0,05)
Dựa vào kết quả thu được ta thấy hoạt lực sau thời gian rã đông 5 phút là thấp nhất ở cả mẫu đánh giá và cũng như những mẫu đạt chuẩn sau khi so sánh với tiêu chuẩn Nông Nghiệp 10TCN 531 – 2002. Tỷ lệ tinh trùng ở mẫu đánh giá và mẫu đạt chuẩn lần lượt là 47,947±6,794% và 50,563±3,898%. Tuy nhiên, không phải mẫu tinh nào sau khi rã đông ở 5 phútđều đạt chuẩn vì qua đánh giá tỷ lệ đạt tiêu chuẩn chỉ đạt 84,2%. Trong khi đó, đối với những mẫu có thời gian rã đông 30 giây và 2 phút lại cho kết quả cao hơn. Hoạt lực tinh trùng trung bình và hoạt lực trung bình đạt chuẩn lần lượt là 56,368±6,525% và 56,368±6,525%, thêm vào đó tỷ lệ đạt chuẩn rất cao 100%. Tiến hành rã đông ở thời gian 2 phút hoạt lực của tinh trùng tiếp tục được nâng lên với 60,474±5,264% là hoạt lực đánh giá mẫu và 60,474±5,264% là hoạt lực sau khi so sánh với tiêu chuẩn 10TCN 531 – 2002. Qua kết quả xử lý số liệu thu
thập được đều mang ý nghĩa thống kê rõ rệt (P<0,05). Vì vậy khi rã đông ở 30 giây và 2 phút cho hiệu quả tương đương nhau và tốt hơn so với khi rã đông ở 5 phút.
Có thể giải thích rằng khi rã đông tinh cọng rạ ở mốc 5 phút với nhiệt độ rã đông là 37oC, tinh trùng có một quãng thời gian dài hoạt động nên đã mất nhiều năng lượng dẫn đến việc hoạt lực của tinh trùng giảm xuống. Ngoài ra, yếu tố môi trường như ánh sáng, những lần lấy mẫu trước đó gây sốc tinh trùng cũng có thể là nguyên nhân dẫn đến hoạt lực tinh trùng giảm so với 2 khoảng thời gian trước đó. Chính vì vậy không nên rã đông tinh cọng rạ với thời gian quá dài (>5 phút) sẽ vừa gây mất thời gian mà lại không hiệu quả trong việc GTNT. Thời gian rã đông tối ưu nhất nên là khoảng từ 30 giây đến 2 phút.
Qua đánh giá có thể kết luận: thời gian rã đông ảnh hưởng mạnh đến hoạt lực tinh trùng. Nên thực hiện việc rã đông tinh cọng rạ trong khoảng thời gian 30 giây đến 2 phút để cho chất lượng tinh dịch tốt hơn.
4.1.2 Tỷ lệ tinh trùng sống
Tinh trùng rất nhạy cảm với những sự thay đổi từ môi trường ngoài, nên sau khi rã đông sự thay đổi đột ngột của môi trường và nhiệt độ, khiến cho tinh trùng dễ dàng chết đi.
Sau khi đánh giá 19 tinh cọng rạ ở thời gian rã đông 2 phút, thu được kết quả trình bày ở Bảng 4.2:
Bảng 4.2: Tỷ lệ tinh trùng sống trong tinh cọng rạ ở thời gian rã đông 2 phút
Chỉ tiêu Thời gian rã đông 2 phút
Tỷ lệ tinh trùng sống N 19 Mean±SE (%) 95,842 ± 0,441 Tỷ lệ tinh trùng sống đạt chuẩn N 19 Mean±SE (%) 95,842 ± 0,441 Tỷ lệ (%) 100
Bảng 4.2 cho thấy, tỷ lệ tinh trùng sống chiếm tỷ lệ rất cao, hơn 95%. Trong 19 mẫu kiểm tra không có mẫu nào không đạt chuẩn (theo tiêu chuẩn 10TCN 531 – 2002). Vì vậy có thể kết luận: thời gian rã đông 2 phút cho kết quả tỷ lệ tinh trùng sống rất cao, đạt chuẩn của cọng rạ tốt, có thể sử dụng để gieo tinh cho bò cái.
4.2 Đánh giá và so sánh chất lượng tinh cọng rạ 2 giống bò Brahman lai và Limousine và Limousine
4.2.1 Hoạt lực tinh trùng
Trong đánh giá tinh cọng rạ, hoạt lực tinh trùng thường xếp theo thang điểm 0 – 1 tương ứng với 0 – 100%. Hoạt lực tinh trùng kết hợp với tổng số tinh trong cọng rạ sẽ có được tổng số tinh trùng sống hoạt động tiến thẳng trong cọng rạ đó.
Chỉ có tinh trùng tiến thẳng mới tham gia vào quá trình thụ tinh. Chính vì vậy phần trăm tinh trùng tiến thẳng được xem là chỉ tiêu rất quan trọng trong việc đánh giá 1 liều tinh dùng trong GTNT.
Hoạt lực tinh trùng phụ thuộc vào từng cá thể đực giống và được đánh giá thông qua khả năng hoạt động của tinh trùng nên chỉ tiêu này chịu ảnh hưởng của một số yếu tố như: mùa vụ, môi trường pha loãng tinh dịch, sức kháng đông của tinh trùng... Kết quả đánh giá hoạt lực tinh trùng trong cọng rạ của 2 giống bò Brahman lai và Limousine được trình bày ở Bảng 4.3:
Bảng 4.3: Hoạt lực trung bình tinh cọng rạ của 2 giống bò Brahman lai và