2.4.1. Hiện tượng đông băng chất lỏng
Tinh trùng là một tế bào sống, vận động ngoài cơ thể, rất mẫn cảm với sự thay đổi của điều kiện môi trường xung quanh. Trong quá trình đông lạnh, tinh trùng sẽ chịu ảnh hưởng của hiện tượng đông băng chất lỏng.
Khi một chất lỏng được làm lạnh, quá trình đông băng xảy ra, quá trình này gồm: Tiền đông băng (Supercooling), tạo nhân (nucleation), giãn nở của tinh thể băng (growth of ice crystals) và kết tinh hoàn thiện tại một nhiệt độ nhất định (Eutectic Point), diễn biến nhiệt độ trong quá trình đông băng theo đồ thị như hình dưới. Khi đông lạnh tinh dịch sự tạo tinh thể và giãn nở tinh thể băng chỉ xảy ra trong điều kiện đông lạnh chậm, còn khi đông lạnh cực nhanh thì hai hiện tượng trên không xảy ra, mà xảy ra hiện tượng thủy tinh hóa (Vitrification), tạo ra các hạt băng nhỏ li ti, loại trừ được hiện tượng giãn nở tinh thể (Mazur, 1989).
Hình 2.5: Quá trình đông lạnh tinh dịch bò (Hiroshi, 1992)
2.4.2. Ảnh hưởng của hiện tượng đông băng lên tế bào tinh trùng 2.4.2.1. Hiện tượng đông băng nội bào 2.4.2.1. Hiện tượng đông băng nội bào
Tinh trùng bị chết hoặc mất năng lực hoạt động, khi cấu tạo nội bào bị phá vỡ do việc hình thành tinh thể nước nội bào. Nếu tinh trùng nằm trong dung dịch muối sinh lý có thể loại trừ được hiện tượng này vì được các phân tử nước dạng lỏng bao quanh, mặc dù dung dịch ngoại bào bắt đầu đông băng ở nhiệt độ - 2oC hoặc -5oC. Như vậy quá trình đông băng sẽ không làm hại tới tế bào tinh trùng cho đến khi nước nội bào đông lạnh mặc dù dung dịch môi trường bao quanh đã đông lạnh (Mazur, 1989).
2.4.2.2. Sự mất nước của tế bào tinh trùng
Nếu nước nội bào thoát ra ngoài, tinh trùng sẽ bị teo lại, nhưng vẫn có tinh trùng sống được ở nhiệt độ thấp hoặc siêu thấp chẳng hạn -196oC. Trong quá trình làm lạnh, nước ngoại bào đông băng làm áp suất thẩm thấu chênh lệch, nước nội bào thoát ra khỏi tinh trùng và tiếp tục đông băng phần ngoại
bào. Có 80% nước nội bào bị đông lạnh ở -15oC và được thoát ra ngoài do đó ngăn ngừa được hiện tượng đông băng nội bào (Hà Văn Chiêu, 1999).
Phần lớn nước nội bào thoát ra khỏi tinh trùng ở -30oC. Tinh trùng có thể chịu lạnh ở -30oC, có thể tồn tại được ở -196oC, còn tế bào bình thường thì bị phá hủy, tuy nhiên cũng có tinh trùng không có khả năng chịu lạnh do các biến đổi lý - hoá - sinh xảy ra. Những biến đổi lý - hóa - sinh có thể xảy ra trong tế bào bị phá hủy ở nhiệt độ thấp, thay đổi trong cấu trúc nội bào là do thay đổi liên kết hydro ở chuỗi polyme. Sự đông đặc hóa không thể quay trở lại như cũ và sự kết tủa protein do mất nước của nguyên sinh chất (Aritani, 1989).
2.4.2.4. Chuyển động của nước và sự dãn nở của tinh thể nước gây ra huỷ hoại cơ học đối với tinh trùng
Hiện tượng giải đông giống như đông lạnh có ảnh hưởng đến tinh trùng do chênh lệch áp suất thẩm thấu, sự di chuyển của nước qua màng tế bào tinh trùng và sự dãn nở của các tinh thể nước đá trong quá trình đông lạnh hoặc tan băng có thể gây tổn thương tinh trùng. Bọt khí tồn tại trong tinh thể băng cũng có thể gây tổn hại tinh trùng trong quá trình này (Hà Văn Chiêu, 1999).
Các tổn thương trên có thể loại trừ được bằng cách giảm kích cỡ các tinh thể băng và làm tăng số lượng tinh thể nhỏ hơn. Tốc độ làm lạnh nhanh có thể làm tăng tinh thể nhỏ đó khi đông lạnh. Nói cách khác là khi làm lạnh nhanh sẽ ngăn chặn được sự lớn lên của các tinh thể băng trong dung dịch và tạo điều kiện đông lạnh giống như thủy tinh hóa. Tuy vậy, băng thủy tinh gồm các tinh thể băng sẽ không ổn định ở nhiệt độ trên -129oC và sự chuyển động và tái tinh thể hóa của chúng sẽ gây tổn hại tế bào tinh trùng. Chuyển động sẽ tăng lên ở trên -40oC và dễ gây tổn hại tinh trùng đặc biệt là ở khoảng -20oC (Hiroshi, 1992).
Những ảnh hưởng trên có thể gây biến đổi hình thái tinh trùng, đặc biệt là sự dị hình acrosome; gây rò rỉ lipide ra khỏi thể đỉnh, ở tinh trùng bò đực thấy rõ hiện tượng rò rỉ choline plasmalogen, lecithin và sphingomielin, gây ra phá hủy màng sinh chất và giảm nguồn năng lượng cho tế bào tinh trùng; gây hiện tượng thấm qua của các hợp chất vô cơ, với tinh trùng bò đực, ion K và Mg ra khỏi tế bào còn ion Na và Ca thì ở lại; các hợp chất cao phân tử thoát khỏi tinh trùng như các enzyme gồm: Hyaluronidase, lactic dehyrogenase, glutamic oxaloacetic transaminase và alkaline phosphatase. Nói chung, hiện tượng đông băng làm giảm sức sống, sức vận động và trao đổi chất, có khoảng từ 10 - 50% số tinh trùng trong tinh dịch bị chết, mặc dù đã được pha vào môi trường có chứa glyceryl. Tuy nhiên các tinh trùng sống có cả các tinh trùng
vận động và trao đổi chất kém. Sự giảm trao đổi chất của tinh trùng thấy rõ ở quá trình glycolysis hơn là quá trình hô hấp (Hiroshi, 1992).
2.5 Khai thác tinh bò đực và sản xuất tinh cọng rạ
2.5.1 Một số tiêu chuẩn tinh dịch bò để sản xuất tinh đông lạnh 10 TCN 531-2002
Theo quy định của Bộ NN & PTNT (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2003), tinh dịch bò đực giống được sử dụng để sản xuất tinh đông lạnh dạng cọng rạ phải đạt như sau:
- Yêu cầu với tinh tươi:
+ Tinh dịch có màu trắng sữa hoặc trắng ngà và có độ mịn đồng nhất.
+ Lượng xuất tinh V ≥ 3ml.
+ Hoạt lực tinh trùng sau khi khai thác A ≥ 70 %. + Nồng độ tinh trùng C ≥ 800.000.000/ml
+ Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình K ≤ 20% + pH 6,5 - 6,8
- Yêu cầu với tinh đông lạnh dạng cọng rạ: + Thể tích cọng rạ 0,25ml.
+ Tổng số tinh trùng sống/cọng rạ trước đông lạnh 25 triệu tinh trùng
+ Hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh ≥ 40% + Tỷ lệ tinh trùng chết <12%
+ Số tinh trùng sống tối thiểu 10 triệu tinh trùng.
2.5.2 Khai thác tinh dịch từ bò đực
Theo Phùng Thế Hải (2010) thì công việc khai thác tinh gồm các bước sau:
- Chuẩn bị âm đạo giả: Các bộ phận của âm đạo giả đã được khử trùng
rồi lắp ráp và bảo quản trong tủ ấm 420C trước khi khai thác tinh. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Chuẩn bị bò đực giống khai thác tinh: Bò đực giống đến lịch khai thác
tinh, đầu giờ sáng bò đực giống đưa ra khu vực chờ khai thác tinh tắm trải sạch sẽ bằng nước sạch và thụt rửa bao dương vật bằng nước muối sinh lý 0,9% trước khi lấy tinh 30 phút.
- Chuẩn bị bò làm giá và giá nhảy nhân tạo: Chọn bò làm giá hoặc giá
- Khai thác tinh bằng âm đạo giả: Kích thích tính dục cho bò đực giống thật hăng, rồi cho nhảy giá và khai thác tinh bằng âm đạo giả (chỉ khai thác tinh một lượt). Sau khi thu nhận được tinh dịch từ bò đực giống trong lần xuất tinh, người lấy tinh chuyển ngay vào phòng thí nghiệm để đánh giá các chỉ tiêu.
2.5.3 Sản xuất tinh cọng rạ
Trong những năm gần đây, kỹ thuật động lạnh tinh dịch trong những “cọng rạ” đã thay thế hầu hết những dạng tinh đông lạnh khác (Đinh Văn Cải, 2007).
2.5.3.1 Tinh cọng rạ
Đây là kỹ thuật mà tinh dịch sau khi pha loãng được nạp vào các ống nhựa dung tích 0,25 – 0,5ml, gọi là các cọng rạ. Tinh cọng rạ được Cassou đi vào nghiên cứu từ năm 1948. Lúc đầu cọng rạ lớn có dung lượng từ 1 – 1,2ml, đến năm 1965 sản xuất cọng rạ trung bình có dung lượng là 0,5ml và từ sau năm 1969 sản xuất ra cọng rạ nhỏ có dung lượng 0,25ml. Các nghiên cứu của Cassou từ năm 1964 – 1968 cho thấy rằng việc ứng dụng các cọng rạ nhỏ không làm giảm tỷ lệ thụ thai mà còn tăng hiệu quả kinh tế kỹ thuật lên rất nhiều. Tinh sau khi được pha loãng được cho vào các ống nhựa nhỏ (trông giống cọng rạ), sao đó được làm lạnh sâu và bảo quản trong nitơ lỏng. Dạng tinh này có thể khắc phục hầu hết các nhược điểm của các dạng tinh khác trên thị trường (Đinh Văn Cải, 2007).
a) Ưu điểm tinh cọng rạ
- Tinh không tiếp xúc trực tiếp với nitơ khi bảo quản và khi làm tan băng không phải pha vào nước sinh lý do đó giữ được độ thuần khiết cao.
- Gia tăng tỷ lệ tinh trùng còn sống sau khi tan băng, hoạt lực cao (A>40%) và ít mất tinh khi phối giống (trên 95% tinh trùng trong cọng rạ được đưa trực tiếp vào tử cung bò cái khi phối tinh).
- Ghi được chi tiết số hiệu đực giống, ngày lấy tinh, lần lấy tinh, nơi sản xuất tinh trên vỏ cọng rạ do vậy dễ dàng trong ghi chép, quản lý GTNT và quản lý giống.
- Sản xuất được trên quy mô công nghiệp với sự trợ giúp của các thiết bị chuyên dụng.
b) Nhược điểm tinh cọng rạ
- Tốn nhiều nitơ trong viêc bảo quản.
- Khi sử dụng tinh để GTNT cho bò cần phải có các dụng cụ chuyên dụng đi kèm như nhiệt kế, dụng cụ làm tan băng, súng bắn tinh.
- Bên cạnh đó dẫn tinh viên cần có kinh nghiệm và kiến thức chuyên môn nhất định về việc sử dụng tinh cọng rạ để đảm bảo tỷ lệ thụ thai cao.
2.5.3.2 Sơ lượt quy trình sản xuất tinh cọng rạ
Theo Phùng Thế Hải (2010), quy trình sản xuất tinh cọng rạ như sau:
- Chuẩn bị môi trường pha loãng tinh dịch. Môi trường pha loãng tinh dịch, đã được pha chế sẵn theo công thức môi trường của Nhật Bản gồm: Môi trường A không có Glyceryl (Tris, Citric axit, Lactose, Fructose, mRaffinose, nước cất 2 lần, lòng đỏ trứng gà, Peniciline, Steptomycine) và môi trường B (môi trường A + Glyceryl), được bảo quản trong tủ bảo quản có nhiệt độ 50C. Trước khi sử dụng, môi trường được lấy ra và đặt trong Autobath có nhiệt độ 35oC để cân bằng nhiệt độ với nhiệt độ tinh dịch.
- Pha loãng tinh dịch.
+ Pha loãng với môi trường A với lượng bằng 50% tổng lượng môi trường cần dùng và bảo quản ở nhiệt độ 5oC trong 1 đến 2 giờ.
+ Pha loãng với môi trường B bằng phương pháp nhỏ giọt trong 3 giờ.
- In nhãn mác lên vỏ cọng rạ bằng máy in chuyên dùng.
- Nạp tinh và hàn đầu cọng rạ bằng máy tự động.
- Cân bằng glyceryl ở 50C, các cọng rạ được rải đều một lớp trên giá chuyên dụng và đặt trong buồng có nhiệt độ 5oC trong 3 giờ.
- Đông lạnh bằng máy đông lạnh chuyên dụng, tự động điều khiển hạ nhiệt độ dần dần xuống -196oC.
2.5.3.3 Kỹ thuật bảo quản tinh cọng rạ
Kết quả nghiên cứu cho thấy tinh được bảo quản trong nitơ lỏng có nhiệt độ bảo quản tới -196oC sau 10 năm thì tinh trùng vẫn còn khả năng thụ tinh cao sau khi rã đông. Tuy nhiên để bảo quản tinh đúng kỹ thuật cần có những điều kiện nhất định.
a) Dụng cụ bảo quản (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Là các bình chứa nitơ lỏng với dung tích khác nhau, có thể từ 3 – 100lít, tùy điều kiện và mục đích sử dụng. Bình được cấu tạo bằng inox hoặc thép không rỉ trên nguyên tắc là bình 2 lớp, giữa 2 lớp được rút không khí tạo thành môi trường chân không (giống như bình thủy giữ nước sôi). b) Phương thức bảo quản
Tinh luôn luôn ngập trong nitơ lỏng, đảm bảo nhiệt độ trong bình luôn ổn định ở -196oC. Trong bình chứa nitơ, nhiệt độ dao động từ -196oC đến 2 – 5oC ở trên miệng bình. Chính vì vậy thao tác lấy tinh cọng rạ từ bình chứa ra ngoài khi GTNT phải nhanh, tránh để nhiệt độ cọng rạ thay đổi nhiều dẫn đến hiện tượng “sốc nhiệt”.
Bảng 2.2: Biên độ nhiệt ở các vị trí khác nhau trong bình nitơ 5 lít
Vị trí Nhiệt độ Đỉnh Cách đỉnh 2,5cm Cách đỉnh 5,0cm Cách đỉnh 7,5cm Cách đỉnh 10,0cm Cách đỉnh 12,5cm Cách đỉnh 15,0cm 2o đến 5oC -22oC đến -15oC -46oC đến -40oC -86oC đến -75oC -120oC đến -100oC -160oC đến -140oC -196oC đến -180oC
(Đinh Văn Cải, 2007)
2.5.3.4 Kỹ thuật rã đông cọng rạ
Rã đông tinh cọng rạ sau khi lấy ra khỏi bình nitơ có thể xem là một trong những bước quan trọng quyết định sự thành bại của quá trình GTNT.
Theo Ray Nebel (2010) khi nhấc cọng tinh ra khỏi bình chứa nitơ đòi hỏi thao tác phải nhanh, tối đa 10 giây cho việc gấp cọng tinh từ bình đến chỗ rã đông. Nếu hơn 10 giây, sẽ phải giữ để cọng tinh ở giũa bình nitơ làm mát lại trong khoảng 20 – 30 giây rồi thực hiện lại thao tác. Sau khi gấp cọng tinh ra khỏi bình chứa, lắc nhẹ để những giọt nitơ còn dính trên vỏ nhựa rơi xuống rồi mới tiến hành rã đông.
Ở Việt Nam, sau khi lấy tinh cọng rạ ra khỏi bình chứa nitơ, dẫn tinh viên thường rã đông trong nước ấm có nhiệt độ giao động từ 36 – 38oC, tuy nhiên không nên vượt quá giới hạn này vì sẽ làm chết tinh trùng một cách nhanh chóng. Thời gian rã đông tối thiểu thường là 30 giây sẽ đảm bảo hoạt lực có thể đạt ≥40%.
2.6 Đặc điểm của 2 giống bò Brahman lai và Limousine 2.6.1 Bò Brahman lai 2.6.1 Bò Brahman lai
- Nguồn gốc: Là kết quả lai kinh tế giữa đực giống Brahman với bò cái lai Sind để tạo đàn bò lai F1 nuôi lấy thịt. Đây là phẩm giống có tỷ lệ thịt xẻ cao.
- Khối lượng bê sơ sinh 18 - 22kg, ở 3 tháng tuổi đã đạt trọng lượng trên 80kg, 5-6 tháng tuổi đạt từ 120-150kg/con, so với bê lai Sind thì bê lai Brahman có trọng lượng lớn hơn và lớn nhanh hơn.
- Tỷ lệ thịt xẻ 51 – 53 %, tỷ lệ thịt tinh 40%.
Hình 2.6: Bò Brahman lai
(http://giongkiengiang.com/chitietsanpham.aspx?ProductID=85)
2.6.2 Bò Limousine
- Bò Limousin là một giống bò thịt có nguồn gốc từ vùng Limousin và Marche, miền Nam trung tâm nước Pháp. Đây là giống bò chuyên thịt rất nổi tiếng, thịt có chất lượng cao.
- Giống bò này có sắc lông màu đỏ và không có đốm. Niêm mạc mũi cũng màu đỏ hoặc màu hồng nhạt (tùy cá thể). Sừng và móng chân màu trắng, trắng xám, tầm vóc của bò lớn, thân hình dài, lưng thẳng, đầu ngắn, trán rộng.
- Khối lượng bò cái bình quân 540 – 600kg, bò đực bình quân 800 – 900kg. Nuôi thịt lúc 12 tháng tuổi bê đực đạt 450 – 460kg, bê cái 380 – 400kg.
Hình 2.7: Bò Limousine
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phương tiện thí nghiệm 3.1.1 Đối tượng thí nghiệm 3.1.1 Đối tượng thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành trên 19 mẫu tinh cọng rạ ở 2 giống bò Brahman lai, Linousine (giống Brahman lai 10 mẫu, giống Limousine 9 mẫu) được thu thập tại trung tâm giống Phúc Vinh, thành phố Trà Vinh.
3.1.2 Thời gian thí nghiệm
Đề tài được tiến hành từ ngày 15 tháng 2 năm 2014 đến ngày 2 tháng 5 năm 2014.
3.1.3 Địa điểm thí nghiệm
Mẫu tinh cọng rạ được thu thập tại trung tâm giống Phúc Vinh, thành phố Trà Vinh. Mẫu tinh cọng rạ sau khi thu thập được trữ trong bình nitơ lỏng và được kiểm tra đánh giá tại phòng thí nghiệm Sản khoa và Gieo tinh nhân tạo (E202), Bộ môn Thú Y, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.4 Dụng cụ và hóa chất 3.1.4.1 Dụng cụ 3.1.4.1 Dụng cụ
- Bình nitơ 5 lít trữ tinh cọng rạ, nitơ lỏng
- Kính hiển vi quang học (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Buồng đếm Neubauer
- Waterbath, nhiệt kế, pen.
- Lame, lamelle, ống đong 20ml, cốc thủy tinh 50ml, cốc thủy tinh 100ml