Bẹ cây móc được thu hái tại thành phố Thái Bình, tỉnh Thái Bình vào tháng 9/2014. Mẫu nghiên cứu được ThS.Nghiêm Đức Trọng, Bộ môn Thực vật, Trường
Đại học Dược Hà Nội thẩm định tên khoa học là Caryota mitis Lour., Arecaceae và
lưu tiêu bản tại phòng tiêu bản của Bộ môn. Nguyên liệu sau khi thu hái, rửa sạch,
thái nhỏ, sấy khô ở nhiệt độ 60-700C, nghiền thành bột thô.
Chiết xuất dược liệu: Dược liệu được chiết với các dung môi: nước, cồn 300,
cồn 600, cồn 800, cồn tuyệt đối và methanol theo phương pháp chiết nóng được ghi
trong phụ lục 1.1, Dược điển Việt Nam IV [8]. Cân dược liệu với khối lượng thích hợp, cho vào bình cầu, cho dung môi lượng vừa phải, chiết nóng bằng cách sử dụng thiết bị chiết hồi lưu, với mỗi dung môi đều chiết 3 lần, đem lọc dịch chiết thu được để loại tạp. Cô dịch chiết thành cao đặc để bảo quản. Hiệu suất chiết và hàm ẩm của các cao được trình bày trong bảng 2.1
Bảng 2.1: Hiệu suất chiết và hàm ẩm của các cao chiết
Cao chiết Khối lượng dược liệu khô (g) Khối lượng cao (g) Hiệu suất chiết (%) Hàm ẩm (%) Cao nước 279,53 34,63 12,39 14,03 Cao cồn 300 277,69 52,37 18,86 15,89 Cao cồn 600 287,55 60,6 21,07 19,54 Cao cồn 800 293,74 61,61 20,97 19,93
Cao cồn tuyệt đối 279,89 43,79 15,64 13,76
Cao methanol 303,16 55,93 18,45 12,43
Phân đoạn cao chiết có tác dụng tốt nhất: cao chiết có tác dụng tốt nhất được chiết phân đoạn bằng các dung môi n- hexan, chloroform, ethyl acetat, nước. Ở mỗi
phân đoạn, bốc hơi hoàn toàn dung môi, thu lấy cắn. Sơ đồ chiết xuất thể hiện ở hình 2.1. Hiệu suất chiết phân đoạn và hàm ẩm của cắn được thể hiện ở bảng 2.2
Chế phẩm cho chuột uống: cao đặc được pha loãng với nước cất đến tỷ lệ thích hợp.
Chế phẩm dùng trong thí nghiệm dùng ngoài và thí nghiệm trên tai thỏ cô lập: Cao đặc bẹ móc được pha loãng với nước (thí nghiệm dùng ngoài) hoặc dung dịch ringer (thí nghiệm trên tai thỏ) đến tỷ lệ thích hợp (cao lỏng 1:5) rồi ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút, lọc để loại cắn hoàn toàn, thu lấy phần dịch trong suốt làm dịch gốc, sau đó tiếp tục pha loãng với nước hoặc dung dịch ringer để tiến hành thí nghiệm.
Hình 2.1: Sơ đồ chiết phân đoạn cao chiết có tác dụng tốt nhất
Bột dược liệu Methanol
Cắn metanol toàn phần
n – hexan Cắn phân đoạn n – hexan
C Dung dịch nước
chloroform Cắn phân đoạn chloroform
C CHCl3 Dung dịch nước
ethylacetat Cắn phân đoạn ethylacetat
Cắn Ethylacetat
Dung dịch nước Cắn phân đoạn nước
Cắn metanol toàn phần trong nước Nước
Bảng 2.2: Hiệu suất chiết và hàm ẩm của các cắn phân đoạn cao methanol Cắn phân đoạn Khối lượng dược liệu (g) Khối lượng cắn (g) Hiệu suất chiết (%) Hàm ẩm (%) PĐ n – hexan 298,77 2,76 0,92 8,97 PĐ chloroform 0,81 0,27 9,6 PĐ ethylacetat 3,73 1,25 8,64 PĐ nước 17,91 6,00 16,84 2.1.2. Động vật nghiên cứu
Chuột cống trắng chủng Wistar, cả hai giống, trọng lượng 120 – 160g khỏe
mạnh, do Học viện Quân y cung cấp.
Thỏ cả 2 giống, khối lượng 2 – 3 kg do Học viện Quân y cung cấp.
Động vật sau khi mua về được nuôi tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội 5 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm. Chuột được ăn thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp, uống nước tự do.
2.1.3. Hóa chất và trang thiết bị
Hóa chất:
- Ethanol tuyệt đối do Công ty cổ phần hóa chất Đức Giang, Hà Nội sản xuất - Methanol do Xilong Chemical Co.,Ltd, Trung Quốc sản xuất
- Adrenalin ống tiêm 1mg/1mL do Công ty Dược – VTYT Thanh Hóa sản xuất
- Carbazochrom dihydrat (biệt dược Adrenoxyl 10mg) do Sanofi-Synthelabo, Việt Nam sản xuất
- Indomethacin do Công ty cổ phần Dược phẩm TW 2 sản xuất - Carrageenan do hãng Sigma Aldrich, US sản xuất
Các hóa chất, dung môi khác đạt tiêu chuẩn thí nghiệm do phòng vật tư - trang thiết bị Trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp.
Trang thiết bị:
- Tủ sấy do hãng Memmert, Đức sản xuất
- Dụng cụ cất quay Rotavapor R – 200 do hãng Buchi, Thụy Sĩ sản xuất - Máy li tâm EBA - 20 do hãng Hettich, Đức sản xuất
- Máy đo độ phù chân chuột (phù kế Plethysmometer) do hãng Letica, US sản xuất
Các máy móc, dụng cụ thí nghiệm khác do phòng vật tư - trang thiết bị Trường Đại học Dược cung cấp.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Định tính sơ bộ thành phần hóa học của bẹ cây móc.
- Đánh giá tác dụng theo hướng cầm máu của các cao chiết từ bẹ cây móc để xác định cao chiết có tác dụng tốt nhất.
Đánh giá tác dụng cầm máu của các cao chiết khác nhau từ bẹ cây móc bằng
mô hình cắt đuôi chuột.
Đánh giá tác dụng giảm tính thấm thành mạch của các cao chiết khác nhau
từ bẹ cây móc bằng mô hình gây phù bằng carrageenan.
Đánh giá tác dụng co mạch của các cao chiết từ bẹ cây móc bằng mô hình
trên hệ mạch tai thỏ cô lập.
- Đánh giá tác dụng cầm máu của các phân đoạn từ dịch chiết có tác dụng tốt nhất bằng mô hình cắt đuôi chuột.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu
2.3.1. Định tính thành phần hóa học của bẹ cây móc
Chiết xuất và định tính các nhóm chất hữu cơ: glycosid tim, saponin, anthranoid, flavonoid, anthocyanidin, coumarin, tanin, alkaloid, chất béo, carotenoid, sterol, đường khử, acid hữu cơ, polysaccharid trong bẹ cây móc bằng các phản ứng hóa học đặc trưng theo các tài liệu [2], [4],[16].
2.3.2. Nghiên cứu tác dụng theo hướng cầm máu của các cao chiết bẹ móc của các dung môi khác nhau các dung môi khác nhau
2.3.2.1. Nghiên cứu tác dụng cầm máu
● Đánh giá tác dụng cầm máu đường uống [13], [14]
Chuột cống trắng được chia thành 8 lô. Mỗi lô 10 con Lô chứng: uống nước muối sinh lý
Lô chứng dương: uống carbazochrom liều 12mg/kg chuột
Các lô thử: chuột ở các lô lần lượt uống các cao chiết từ bẹ móc với liều 3g/kg chuột cống tính theo dược liệu khô
Cho chuột uống nước muối sinh lý hoặc thuốc trong 5 ngày. Đến ngày thứ 5, sau khi các lô đã được uống thuốc 2 giờ, gây mê cho chuột bằng thiopental với liều
Phương pháp nghiên cứu
Định tính thành phần
hóa học
Tác dụng theo hướng cầm máu của các cao chiết khác nhau
Tác dụng cầm máu của các phân đoạn của cao chiết có tác dụng tốt nhất Tác dụng cầm máu đường uống Tác dụng cầm máu đường uống và tại chỗ Tác dụng giảm tính thấm thành mạch Tác dụng trên hệ mạch tai thỏ cô lập
20mg/kg sau đó tiến hành cắt đuôi chuột 2mm tính từ chóp đuôi, nhúng vào cốc
nước 370C, xác định thời gian máu chảy bằng đồng hồ bấm giây. Thời gian chảy
máu được tính từ khi có giọt máu đầu tiên sau khi cắt đuôi chuột cho tới khi máu ngừng chảy. So sánh thời gian chảy máu giữa các lô.
Tính % độ giảm thời gian chảy máu của các lô bẹ móc thử so với lô chứng theo công thức (1)
A% = × 100 (1)
Trong đó:
A(%): độ giảm thời gian chảy máu của lô thử so với lô chứng
T0: Thời gian chảy máu trung bình của lô chứng
Tt: thời gian chảy máu trung bình của lô thử
● Đánh giá tác dụng cầm máu tại chỗ
Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 8 lô. Mỗi lô 10 con Lô chứng: nhúng đuôi chuột vào nước muối sinh lý
Lô chứng dương: nhúng đuôi chuột vào dung dịch adrenalin 2x10-8g/mL
Các lô thử: nhúng đuôi chuột vào cao chiết: nước, cồn 300, cồn 600, cồn 800,
cồn tuyệt đối và methanol nồng độ 2 % (tính theo dược liệu khô)
Chuột được gây mê bằng thiopental với liều 20mg/kg chuột. Cắt đuôi chuột 2mm tính từ chóp đuôi. Nhúng ngay đuôi chuột vào nước muối sinh lý hoặc dung dịch adrenalin hoặc dung dịch nước muối có pha thêm cao bẹ móc chiết bằng các
dung môi khác nhau ở trên, các dung dịch ở 370C. Xác định thời gian chảy máu
đuôi chuột bằng đồng hồ bấm giây. Thời gian chảy máu được tính từ khi có giọt máu đầu tiên sau khi cắt đuôi chuột cho tới khi máu ngừng chảy.
So sánh thời gian chảy máu giữa các lô. Tính % độ giảm thời gian chảy máu của lô thử với lô chứng theo công thức (1)
2.3.2.2. Nghiên cứu tác dụng giảm tính thấm thành mạch
Nghiên cứu tác dụng giảm tính thấm thành mạch trên mô hình gây phù bằng carrageenan. Chuột cống trắng được chia thành 7 lô. Mỗi lô 10 con
Lô chứng dương: uống indomethacin liều 10mg/kg chuột
Các lô thử: uống các cao chiết: nước, cồn 600, cồn 800, cồn tuyệt đối và
methanol của bẹ móc với liều 3g/kg chuột cống
Cho chuột uống thuốc liên tục trong 5 ngày. Ngày thứ 5, sau khi uống thuốc lần cuối 1 giờ thì gây phù bằng cách tiêm 0,05mL carrageenan 1% vào dưới da gan bàn chân sau phải của chuột. Đo thể tích bàn chân sau phải của chuột tại các thời điểm trước và sau khi tiêm carrageenan 1 giờ, 3 giờ, 5 giờ, 7 giờ.
Tính độ phù chân chuột và % ức chế phù của các lô thử so với lô chứng theo công thức (2) và (3). So sánh giữa lô thử và lô chứng
Độ phù chân chuột của mỗi chuột được tính theo công thức:
X% = × 100 (2)
Trong đó: X%: Độ phù chân chuột
Vt: Thể tích chân chuột sau khi tiêm carrageenan t giờ
V0: Thể tích chân chuột trước khi tiêm carrageenan
Tỷ lệ % ức chế phù được tính theo công thức:
I% = × 100 (3)
Trong đó: I%: Tỷ lệ ức chế phù bàn chân chuột
: Độ phù chân chuột trung bình ở lô chứng : Độ phù chân chuột trung bình ở lô thử
2.3.2.3. Nghiên cứu tác dụng gây co mạch trên hệ mạch tai thỏ cô lập
Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Krawkow [18], [33] Thỏ được chia thành các lô
Lô chứng dương: dùng dung dịch adrenalin 10-8 g/mL
Lô cao nước: dùng cao nước bẹ móc
Lô cao methanol: dùng cao methanol của bẹ móc
Nhốt thỏ vào hộp, cố định đầu thỏ, cắt rời tai thỏ ra khỏi cơ thể.
Luồn kim vào động mạch tai thỏ, bơm dung dịch ringer cho sạch máu rồi cố định tai thỏ vào bàn cố định. Nối kim vào bình chứa ringer, để bình ở một độ cao
nhất định để tạo áp lực thủy tĩnh hằng định. Cho dung dịch chảy qua hệ mạch tai thỏ. Đếm số giọt chảy qua hệ mạch tai thỏ trong thời gian một phút.
Khi lưu lượng chảy đã ổn định, thêm dung dịch adrenalin (với thể tích phù
hợp để đạt nồng độ 10-8 g/mL) hoặc dịch chiết bẹ móc đã được ly tâm bỏ cắn với
các thể tích khác nhau vào bình chứa ringer để được dung dịch bẹ móc với nồng độ tăng dần từ 0,05% đến 2%. Sau 5 phút đếm lại số giọt chảy qua hệ mạch tai.
Ghi lại kết quả, so sánh số giọt chảy trong 1 phút trước và sau khi thêm dung dịch bẹ móc. Tính % độ giảm lượng dịch chảy qua theo công thức (4):
I(%)= x 100 (4)
Trong đó:
I (%): độ giảm lượng dịch chảy qua sau khi thêm dịch chiết bẹ móc so với ban đầu
N0: số giọt chảy ra trong 1 phút khi cho dung dịch ringer chảy qua
N1: số giọt chảy ra trong 1 phút sau khi cho thêm dịch chiết bẹ móc
2.3.3.Tác dụng cầm máu ở các phân đoạn của cao chiết có tác dụng tốt nhất
Nghiên cứu tác dụng cầm máu đường uống của các phân đoạn của cao chiết có tác dụng tốt nhất được tiến hành tương tự như mục 2.3.2.1, đường dùng là đường uống.
2.4. Phương pháp xử lý số liệu.
Kết quả được biểu diễn dưới dạng M ± SE (M: giá trị trung bình của từng lô, SE: sai số chuẩn). So sánh giá trị trung bình giữa các lô bằng one - way ANOVA, dùng hậu kiểm để so sánh giá trị trung bình của các lô thử so với lô chứng.
Phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS 20.0, sự khác biệt giữa các lô được coi là có ý nghĩa khi p < 0,05.
Chương 3
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu
3.1.1. Định tính sơ bộ thành phần hóa học trong bẹ móc
Bẹ cây móc từ lâu đã được sử dụng trong dân gian làm thuốc cầm máu, đồng thời cũng đã có một số nghiên cứu trên thực nghiệm về tác dụng của dược liệu. Tuy nhiên chưa có tài liệu nào nghiên cứu về thành phần hóa học của bẹ cây móc (Caryota mitis Lour., Arecaceae). Vì vậy, để tìm hiểu thành phần có tác dụng cầm máu, đồng thời để làm cơ sở cho việc lựa chọn dung môi chiết xuất, chúng tôi thực hiện các phản ứng định tính để sơ bộ xác định thành phần hóa học có trong bẹ móc.
3.1.1.1. Định tính glycosid tim ● Chiết xuất:
Cân khoảng 10g bột bẹ móc. Thêm 100mL cồn 25%, ngâm trong 24 giờ. Gạn thu dịch chiết. Thêm vào dịch chiết 3mL chì acetat 30%, khuấy đều. Lọc qua giấy lọc. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat. Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1mL chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat.
Chuyển toàn bộ dịch lọc vào một bình gạn. Chiết glycosid tim bằng cách lắc với cloroform: ethanol (4-1) 2 lần, mỗi lần 8 mL. Gạn lấy lớp cloroform. Gộp các dịch chiết chloroform và loại nước bằng natrisulfat khan.
Chia đều dịch chiết vào 6 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô, bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô. Cắn thu được đem tiến hành làm các phản ứng định tính.
● Tiến hành phản ứng định tính Phản ứng Liberman
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn bẹ móc 1 mL anhydrid acetic, lắc đều cho
tan hết cắn. Nghiêng ống 450. Cho từ từ theo thành ống 0,5 mL acid sulfuric đặc,
tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng sẽ xuất hiện một vòng màu tím đỏ. Phản ứng dương tính khi lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên có màu xanh lá.
Hiện tượng quan sát được: Không xuất hiện vòng tròn tím đổ ở mặt tiếp xúc. Lớp chất lỏng phía dưới màu đỏ, phía trên không màu
Kết quả: Phản ứng âm tính (-)
Phản ứng Baljet
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn bẹ móc 0,5 mL ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha cho đến khi xuất hiện màu đỏ da cam. So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn glycosid tim thấy ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng là phản ứng dương tính.
Hiện tượng quan sát được: Khi cho thuốc thử, ống thử màu nâu đỏvà không thay đổi màu khi cho thuốc thử so với ống chứng
Kết quả: Phản ứng âm tính (-)
Phản ứng Keller-Kiliani
Cho vào ống nghiệm chứa cắn bẹ móc 0,5 mL ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic. Lắc đều.
Nghiêng ống 450. Cho từ từ theo thành ống 0,5 mL acid sulphuric đặc, tránh xáo
trộn chất lỏng trong ống. Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng sẽ xuất hiện 1 vòng màu tím đỏ.
Lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía trên sẽ có màu xanh lá. Phản ứng dương tính Hiện tượng quan sát được: Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng không xuất hiện vòng tròn tím đỏ. Lớp chất lỏng phía trên không màu khi lắc nhẹ
Kết quả: Phản ứng âm tính (-)
3.1.1.2. Định tính saponin
Quan sát hiện tượng tạo bọt
Cho vào ống nghiệm lớn 1 g bột dược liệu, thêm 5 mL nước. Lắc mạnh trong 5 phút. Ðể yên và quan sát hiện tượng tạo bọt. Nếu bọt còn bền vững sau 15 phút thì sơ bộ kết luận dược liệu có chứa saponin.
Hiện tượng quan sát được: Ống nghiệm không xuất hiện cột bọt Kết quả: Phản ứng âm tính (-)
3.1.1.3. Ðịnh tính các hợp chất anthranoid trong dược liệu ● Ðịnh tính anthranoid toàn phần (Phản ứng Borntraeger)
Cho vào ống nghiệm 2g bột bẹ móc. Thêm 10 mL dung dịch acid sulfuric 1N. Đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sôi. Để nguội, lấy dịch lọc. Cho dịch lọc vào