các dung môi khác nhau
2.3.2.1. Nghiên cứu tác dụng cầm máu
● Đánh giá tác dụng cầm máu đường uống [13], [14]
Chuột cống trắng được chia thành 8 lô. Mỗi lô 10 con Lô chứng: uống nước muối sinh lý
Lô chứng dương: uống carbazochrom liều 12mg/kg chuột
Các lô thử: chuột ở các lô lần lượt uống các cao chiết từ bẹ móc với liều 3g/kg chuột cống tính theo dược liệu khô
Cho chuột uống nước muối sinh lý hoặc thuốc trong 5 ngày. Đến ngày thứ 5, sau khi các lô đã được uống thuốc 2 giờ, gây mê cho chuột bằng thiopental với liều
Phương pháp nghiên cứu
Định tính thành phần
hóa học
Tác dụng theo hướng cầm máu của các cao chiết khác nhau
Tác dụng cầm máu của các phân đoạn của cao chiết có tác dụng tốt nhất Tác dụng cầm máu đường uống Tác dụng cầm máu đường uống và tại chỗ Tác dụng giảm tính thấm thành mạch Tác dụng trên hệ mạch tai thỏ cô lập
20mg/kg sau đó tiến hành cắt đuôi chuột 2mm tính từ chóp đuôi, nhúng vào cốc
nước 370C, xác định thời gian máu chảy bằng đồng hồ bấm giây. Thời gian chảy
máu được tính từ khi có giọt máu đầu tiên sau khi cắt đuôi chuột cho tới khi máu ngừng chảy. So sánh thời gian chảy máu giữa các lô.
Tính % độ giảm thời gian chảy máu của các lô bẹ móc thử so với lô chứng theo công thức (1)
A% = × 100 (1)
Trong đó:
A(%): độ giảm thời gian chảy máu của lô thử so với lô chứng
T0: Thời gian chảy máu trung bình của lô chứng
Tt: thời gian chảy máu trung bình của lô thử
● Đánh giá tác dụng cầm máu tại chỗ
Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 8 lô. Mỗi lô 10 con Lô chứng: nhúng đuôi chuột vào nước muối sinh lý
Lô chứng dương: nhúng đuôi chuột vào dung dịch adrenalin 2x10-8g/mL
Các lô thử: nhúng đuôi chuột vào cao chiết: nước, cồn 300, cồn 600, cồn 800,
cồn tuyệt đối và methanol nồng độ 2 % (tính theo dược liệu khô)
Chuột được gây mê bằng thiopental với liều 20mg/kg chuột. Cắt đuôi chuột 2mm tính từ chóp đuôi. Nhúng ngay đuôi chuột vào nước muối sinh lý hoặc dung dịch adrenalin hoặc dung dịch nước muối có pha thêm cao bẹ móc chiết bằng các
dung môi khác nhau ở trên, các dung dịch ở 370C. Xác định thời gian chảy máu
đuôi chuột bằng đồng hồ bấm giây. Thời gian chảy máu được tính từ khi có giọt máu đầu tiên sau khi cắt đuôi chuột cho tới khi máu ngừng chảy.
So sánh thời gian chảy máu giữa các lô. Tính % độ giảm thời gian chảy máu của lô thử với lô chứng theo công thức (1)
2.3.2.2. Nghiên cứu tác dụng giảm tính thấm thành mạch
Nghiên cứu tác dụng giảm tính thấm thành mạch trên mô hình gây phù bằng carrageenan. Chuột cống trắng được chia thành 7 lô. Mỗi lô 10 con
Lô chứng dương: uống indomethacin liều 10mg/kg chuột
Các lô thử: uống các cao chiết: nước, cồn 600, cồn 800, cồn tuyệt đối và
methanol của bẹ móc với liều 3g/kg chuột cống
Cho chuột uống thuốc liên tục trong 5 ngày. Ngày thứ 5, sau khi uống thuốc lần cuối 1 giờ thì gây phù bằng cách tiêm 0,05mL carrageenan 1% vào dưới da gan bàn chân sau phải của chuột. Đo thể tích bàn chân sau phải của chuột tại các thời điểm trước và sau khi tiêm carrageenan 1 giờ, 3 giờ, 5 giờ, 7 giờ.
Tính độ phù chân chuột và % ức chế phù của các lô thử so với lô chứng theo công thức (2) và (3). So sánh giữa lô thử và lô chứng
Độ phù chân chuột của mỗi chuột được tính theo công thức:
X% = × 100 (2)
Trong đó: X%: Độ phù chân chuột
Vt: Thể tích chân chuột sau khi tiêm carrageenan t giờ
V0: Thể tích chân chuột trước khi tiêm carrageenan
Tỷ lệ % ức chế phù được tính theo công thức:
I% = × 100 (3)
Trong đó: I%: Tỷ lệ ức chế phù bàn chân chuột
: Độ phù chân chuột trung bình ở lô chứng : Độ phù chân chuột trung bình ở lô thử
2.3.2.3. Nghiên cứu tác dụng gây co mạch trên hệ mạch tai thỏ cô lập
Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Krawkow [18], [33] Thỏ được chia thành các lô
Lô chứng dương: dùng dung dịch adrenalin 10-8 g/mL
Lô cao nước: dùng cao nước bẹ móc
Lô cao methanol: dùng cao methanol của bẹ móc
Nhốt thỏ vào hộp, cố định đầu thỏ, cắt rời tai thỏ ra khỏi cơ thể.
Luồn kim vào động mạch tai thỏ, bơm dung dịch ringer cho sạch máu rồi cố định tai thỏ vào bàn cố định. Nối kim vào bình chứa ringer, để bình ở một độ cao
nhất định để tạo áp lực thủy tĩnh hằng định. Cho dung dịch chảy qua hệ mạch tai thỏ. Đếm số giọt chảy qua hệ mạch tai thỏ trong thời gian một phút.
Khi lưu lượng chảy đã ổn định, thêm dung dịch adrenalin (với thể tích phù
hợp để đạt nồng độ 10-8 g/mL) hoặc dịch chiết bẹ móc đã được ly tâm bỏ cắn với
các thể tích khác nhau vào bình chứa ringer để được dung dịch bẹ móc với nồng độ tăng dần từ 0,05% đến 2%. Sau 5 phút đếm lại số giọt chảy qua hệ mạch tai.
Ghi lại kết quả, so sánh số giọt chảy trong 1 phút trước và sau khi thêm dung dịch bẹ móc. Tính % độ giảm lượng dịch chảy qua theo công thức (4):
I(%)= x 100 (4)
Trong đó:
I (%): độ giảm lượng dịch chảy qua sau khi thêm dịch chiết bẹ móc so với ban đầu
N0: số giọt chảy ra trong 1 phút khi cho dung dịch ringer chảy qua
N1: số giọt chảy ra trong 1 phút sau khi cho thêm dịch chiết bẹ móc
2.3.3.Tác dụng cầm máu ở các phân đoạn của cao chiết có tác dụng tốt nhất
Nghiên cứu tác dụng cầm máu đường uống của các phân đoạn của cao chiết có tác dụng tốt nhất được tiến hành tương tự như mục 2.3.2.1, đường dùng là đường uống.
2.4. Phương pháp xử lý số liệu.
Kết quả được biểu diễn dưới dạng M ± SE (M: giá trị trung bình của từng lô, SE: sai số chuẩn). So sánh giá trị trung bình giữa các lô bằng one - way ANOVA, dùng hậu kiểm để so sánh giá trị trung bình của các lô thử so với lô chứng.
Phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS 20.0, sự khác biệt giữa các lô được coi là có ý nghĩa khi p < 0,05.
Chương 3
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu
3.1.1. Định tính sơ bộ thành phần hóa học trong bẹ móc
Bẹ cây móc từ lâu đã được sử dụng trong dân gian làm thuốc cầm máu, đồng thời cũng đã có một số nghiên cứu trên thực nghiệm về tác dụng của dược liệu. Tuy nhiên chưa có tài liệu nào nghiên cứu về thành phần hóa học của bẹ cây móc (Caryota mitis Lour., Arecaceae). Vì vậy, để tìm hiểu thành phần có tác dụng cầm máu, đồng thời để làm cơ sở cho việc lựa chọn dung môi chiết xuất, chúng tôi thực hiện các phản ứng định tính để sơ bộ xác định thành phần hóa học có trong bẹ móc.
3.1.1.1. Định tính glycosid tim ● Chiết xuất:
Cân khoảng 10g bột bẹ móc. Thêm 100mL cồn 25%, ngâm trong 24 giờ. Gạn thu dịch chiết. Thêm vào dịch chiết 3mL chì acetat 30%, khuấy đều. Lọc qua giấy lọc. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat. Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1mL chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat.
Chuyển toàn bộ dịch lọc vào một bình gạn. Chiết glycosid tim bằng cách lắc với cloroform: ethanol (4-1) 2 lần, mỗi lần 8 mL. Gạn lấy lớp cloroform. Gộp các dịch chiết chloroform và loại nước bằng natrisulfat khan.
Chia đều dịch chiết vào 6 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô, bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô. Cắn thu được đem tiến hành làm các phản ứng định tính.
● Tiến hành phản ứng định tính Phản ứng Liberman
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn bẹ móc 1 mL anhydrid acetic, lắc đều cho
tan hết cắn. Nghiêng ống 450. Cho từ từ theo thành ống 0,5 mL acid sulfuric đặc,
tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng sẽ xuất hiện một vòng màu tím đỏ. Phản ứng dương tính khi lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên có màu xanh lá.
Hiện tượng quan sát được: Không xuất hiện vòng tròn tím đổ ở mặt tiếp xúc. Lớp chất lỏng phía dưới màu đỏ, phía trên không màu
Kết quả: Phản ứng âm tính (-)
Phản ứng Baljet
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn bẹ móc 0,5 mL ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha cho đến khi xuất hiện màu đỏ da cam. So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn glycosid tim thấy ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng là phản ứng dương tính.
Hiện tượng quan sát được: Khi cho thuốc thử, ống thử màu nâu đỏvà không thay đổi màu khi cho thuốc thử so với ống chứng
Kết quả: Phản ứng âm tính (-)
Phản ứng Keller-Kiliani
Cho vào ống nghiệm chứa cắn bẹ móc 0,5 mL ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic. Lắc đều.
Nghiêng ống 450. Cho từ từ theo thành ống 0,5 mL acid sulphuric đặc, tránh xáo
trộn chất lỏng trong ống. Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng sẽ xuất hiện 1 vòng màu tím đỏ.
Lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía trên sẽ có màu xanh lá. Phản ứng dương tính Hiện tượng quan sát được: Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng không xuất hiện vòng tròn tím đỏ. Lớp chất lỏng phía trên không màu khi lắc nhẹ
Kết quả: Phản ứng âm tính (-)
3.1.1.2. Định tính saponin
Quan sát hiện tượng tạo bọt
Cho vào ống nghiệm lớn 1 g bột dược liệu, thêm 5 mL nước. Lắc mạnh trong 5 phút. Ðể yên và quan sát hiện tượng tạo bọt. Nếu bọt còn bền vững sau 15 phút thì sơ bộ kết luận dược liệu có chứa saponin.
Hiện tượng quan sát được: Ống nghiệm không xuất hiện cột bọt Kết quả: Phản ứng âm tính (-)
3.1.1.3. Ðịnh tính các hợp chất anthranoid trong dược liệu ● Ðịnh tính anthranoid toàn phần (Phản ứng Borntraeger)
Cho vào ống nghiệm 2g bột bẹ móc. Thêm 10 mL dung dịch acid sulfuric 1N. Đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sôi. Để nguội, lấy dịch lọc. Cho dịch lọc vào
bình gạn, lắc với 10 mL CHCl3.
Lấy 1mL dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1 mL dung dịch NaOH 10%. Lắc nhẹ. Lớp nước sẽ có màu đỏ sim. Phản ứng dương tính
Hiện tượng quan sát được: Lớp nước không màu Kết quả: Phản ứng âm tính (-)
● Vi thăng hoa:
Trải bột dược liệu thành lớp mỏng trong một nắp chai bằng nhôm, đốt nhẹ trên đèn cồn để loại nước. Sau đó đậy lên nắp nhôm một miếng lam kính, bên trên có miếng bông đã thấm nước, tiếp tục đun nóng trong khoảng 5 - 10 phút. Lấy lam kính ra để nguội, soi kính hiển vi thấy tinh thể hình kim màu vàng. Sau khi nhỏ dung dịch natri hydroxyd lên lam kính, dung dịch sẽ có màu đỏ. Phản ứng dương tính.
Hiện tượng quan sát được: Soi kính hiển vi không thấy có tinh thể hình kim màu vàng. Nhỏ dung dịch NaOH lên lam kính không thấy xuất hiện màu đỏ.
Kết quả: Phản ứng âm tính (-)
3.1.1.4. Ðịnh tính flavonoid trong bẹ móc ● Chiết xuất:
Cân 10g bột bẹ móc, thêm 50mL ethanol 90%. Đun cách thủy sôi trong 15 phút. Lọc nóng. Dịch lọc được tiến hành các phản ứng định tính.
● Tiến hành phản ứng:
Phản ứng Cyanidin (phản ứng Shinoda)
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 mL dịch chiết. Thêm một ít bột magnesi kim loại (khoảng 10 mg). Giỏ từng giọt HCl đậm đặc (3-5 giọt). Ðể yên một vài phút, dung dịch sẽ chuyển từ màu vàng sang màu đỏ. Phản ứng dương tính.
Phản ứng với kiềm
1. Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 mL dịch chiết . Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%. Sẽ thấy xuất hiện tủa vàng. Thêm 1 mL nước cất, tủa sẽ tan và màu vàng của dung dịch sẽ được tăng thêm.
Kết quả: Phản ứng dương tính (+++)
2. Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nút, sẽ thấy màu vàng của vết dịch chiết được tăng lên.
Kết quả: Phản ứng dương tính (+++)
Phản ứng với FeCl3
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 mL dịch chiết. Thêm vài giọt dung dịch
FeCl3 5%. Sẽ xuất hiện tủa xanh đen.Kết quả: Phản ứng dương tính (+++)
Phản ứng diazo hoá
Cho 1 mL dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hoá bằng dung dịch kiềm (dung
dịch NaOH, KOH, Na2CO3 ), thêm vài giọt thuốc thử diazoni, lắc đều (có thể đun
nóng trên nồi cách thuỷ trong vài phút) xuất hiện màu đỏ. Kết quả: Phản ứng dương tính (+++)
3.1.1.5.Ðịnh tính các hợp chất anthoxyan trong bẹ móc
Cho vào ống nghiệm lớn 1 g và 5 mL nước. Ðun sôi trong 5 phút. Gạn lấy dịch chiết.
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 mL dịch chiết, thêm vài giọt HCl 10%, sẽ có màu đỏ, đồng thời cho vào ống nghiệm nhỏ 1 mL dịch chiết, thêm vài giọt NaOH 10%, sẽ có màu xanh. Phản ứng dương tính.
Hiện tượng quan sát được: Khi nhỏ HCl, ống nghiệm không thay đổi màu. Khi nhỏ NaOH, ống nghiệm chuyển màu đỏ
3.1.1.6. Ðịnh tính Coumarin trong bẹ móc ● Chiết xuất coumarin
Cân khoảng 5g bột bẹ móc cho vào bình nón, thêm 50 mL ethanol 90%, quấy đều. Đun cách thủy sôi khoảng 3 - 5 phút. Lọc nóng qua giấy lọc. Dịch chiết thu được để làm các phản ứng định tính.
● Phản ứng mở đóng vòng lacton
- Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 mL dịch chiết
ống 1: thêm 0,5 mL dung dịch NaOH 10%; ống 2: để nguyên - Ðun cả 2 ống nghiệm đến sôi- Ðể nguội
Quan sát: ống1: có màu vàng hoặc tủa đục màu vàng, ống 2: trong - Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 mL nước cất. Lắc đều.
Quan sát: ống 1: trong suốt; ống 2: có tủa đục.
Acid hoá ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 sẽ trở lại đục như ống 2. Phản ứng dương tính khi hiện tượng xảy ra như ống 1.
Hiện tượng quan sát được: khi cho NaOH vào, ống thử xuất hiện tủa đục màu đỏ. Thêm nước cất, tủa không tan. Thêm HCl, ống 1 vẫn xuất hiện tủa.
Kết quả: Phản ứng âm tính (-)
● Phản ứng diazo hoá
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 mL dịch chiết. Thêm vào đó 2 mL dung dịch NaOH 10%.
Ðun cách thuỷ đến sôi rồi để nguội. Giỏ vài giọt thuốc thử Diazo- sẽ có màu đỏ gạch.
Kết quả: Phản ứng dương tính (+)
● Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm.
Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy thấm. Nhỏ tiếp vài giọt dung dịch NaOH 5%. Sấy nhẹ. Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một miếng kim loại, sau đó chiếu tia tử ngoại trong 5 phút. Bỏ miếng kim loại ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại sẽ thấy: phần không bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che. Nếu tiếp
tục chiếu tia tử ngoại, phần bị che sẽ sáng dần lên, sau vài phút cả hai phần đều phát quang như nhau. Phản ứng dương tính.
Hiện tượng quan sát được: Quan sát dưới đèn tử ngoại thấy phần bị che và phần không bị che phát sáng như nhau.
Kết quả: Phản ứng âm tính (-)
3.1.1.7. Ðịnh tính tanin trong bẹ móc
● Chiết xuất
Lấy khoảng 10g bột dược liệu cho vào bình nón, thêm 20mL nước cất, đun sôi trong 2 phút. Ðể nguội, lọc. Dịch lọc được dùng để định tính.
● Phản ứng định tính:
a. Ống 1: lấy 2mL dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% (TT) sẽ xuất
hiện màu hoặc tủa màu xanh đen hoặc xanh nâu nhạt. Phản ứng dương tính. Kết quả: Phản ứng dương tính (+++)
b. Ống 2: lấy 2mL dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10% (TT) sẽ xuất hiện tủa bông.
Phản ứng dương tính.
Kết quả: Phản ứng dương tính (+++)
c. Ống 3: lấy 2mL dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1% sẽ xuất hiện
tủa bông trắng. Phản ứng dương tính. Kết quả: Phản ứng dương tính (+++)
3.1.1.8. Định tính alkaloid trong bẹ móc