Về kết quả định tính thành phần hóa học của bẹ móc
Để từng bước đưa bẹ móc từ một vị thuốc được sử dụng nhiều trong dân gian thành các chế phẩm từ dược liệu và được sử dụng rộng rãi hơn trên lâm sàng, nhóm nghiên cứu chúng tôi tiến hành nghiên cứu đánh giá tác dụng cầm máu của dược liệu này trên thực nghiệm và từng bước xác định nhóm hoạt chất tạo ra tác dụng này. Vì vậy để tiếp tục các nghiên cứu trước của nhóm, trong khóa luận này, việc chúng tôi tiến hành trước tiên là nghiên cứu thành phần hóa học của bẹ móc.
Nghiên cứu thành phần hóa học của dược liệu là một công việc quan trọng nhưng phức tạp gồm nhiều quy trình và phương pháp khác nhau.Thông thường ở mức độ đơn giản nhất, việc nghiên cứu thành phần hóa học của dược liệu sẽ được bắt đầu bằng việc xác định các nhóm chất có trong cây bằng các phản ứng hóa học đặc trưng. Bẹ móc là dược liệu mà chưa có bất kỳ nghiên cứu nào về thành phần hóa học do đó việc nghiên cứu thành phần hóa học của bẹ móc có tác dụng là việc rất cần thiết và bước đầu tiên cần làm là định tính thành phần hóa học. Định tính thành phần hóa học sẽ giúp lựa chọn dung môi chiết phù hợp và góp phần dự đoán hoạt chất nào tạo ra tác dụng của bẹ móc.
Để định tính các nhóm chất có trong bẹ móc, chúng tôi đã tiến hành định tính xác định các nhóm chất bằng việc sử dụng các quy trình chiết đặc hiệu cùng với nhiều phản ứng hóa học đặc hiệu để khẳng định chắc chắn sự có mặt của nhóm hợp chất.
Theo kết quả định tính thu được, chúng tôi xác định trong bẹ móc có các nhóm hoạt chất: flavonoid, tanin, đường khử, acid hữu cơ. So với trong tua móc, bẹ móc chứa ít nhóm chất hữu cơ hơn (trong tua móc có chứa anthranoid, coumarin, flavonoid, tanin, saponin, chất béo, đường khử, acid amin [10]).
Flavonoid có một số tác dụng sinh học như: khả năng dập tắt các gốc tự do (các gốc này sẽ gây ra những ảnh hưởng nguy hại như gây đột biến, hủy hoại tế bào, gây ung thư, tăng nhanh sự lão hóa…); chống độc cho cơ thể (flavonoid giúp làm giảm tổn thương gan, bảo vệ chức năng gan khi cơ thể bị nhiễm độc như benzen, ethanol); giúp làm tăng tuần hoàn não; một số flavonoid có tác dụng ức chế enzym hyaluronidase (enzym này làm tăng tính thấm của thành mạch), do đó chúng có tác dụng làm giảm tính thấm thành mạch,có tác dụng trong các trường hợp chảy máu;…[3]. Tanin có tác dụng kháng khuẩn, có tác dụng làm săn se niêm mạc nên dùng để đắp lên vết thương giúp cầm máu, chữa trĩ, rò hậu môn [3]. Với các tác dụng đã biết ở trên, cùng với sự có mặt rõ ràng của các nhóm chất khi định tính (các phản ứng dương tính mạnh) có thể dự đoán tác dụng cầm máu của bẹ móc có thể do nhóm chất flavonoid hoặc tanin.
Kết quả định tính ở trên cũng đã giúp chúng tôi định hướng lựa chọn dung môi chiết để có thể chiết được hai nhóm chất này. Tanin hầu như không tan trong dung môi kém phân cực, tan ít trong cồn loãng, tan tốt nhất trong nước nóng [3], do vậy, chúng tôi lựa chọn phương pháp chiết nóng để chiết được tanin. Flavonoid có độ tan rất khác nhau, flavonoid glycosid thường dễ tan trong các dung môi phân cực, các flavonid aglycon dễ tan trong các dung môi kém phân cực. Thông thường để chiết các flavonoid glycosid, người ta chiết bằng nước nóng hoặc methanol hoặc ethanol. Cồn ở các nồng độ khác nhau với nước thường chiết được phần lớn các flavonoid [3]. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn các dung môi để khảo sát là các dung môi
phân cực gồm có nước, ethanol 300, ethanol 600, ethanol 800, ethanol tuyệt đối và
methanol.
Để nghiên cứu thành phần có tác dụng cầm máu của bẹ móc, khóa luận này dừng lại ở việc định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học đặc trưng. Để xác
định cụ thể hợp chất có tác dụng cầm máu cần các nghiên cứu ở mức độ cao hơn có thể sử dụng phương pháp sắc ký hoặc phân tích quang phổ.
Về quy trình chiết xuất
Với tất cả dung môi chiết, chúng tôi đều sử dụng phương pháp chiết nóng. Thông số của các quá trình chiết đều đồng nhất với nhau (khối lượng dược liệu chiết: 300g; thời gian chiết: 3 lần, mỗi lần 1 giờ; tổng thể tích dung môi sử dụng: 2,5 lít).Do đó, quy trìnhchiết sẽ không ảnh hưởng đến sự khác biệt về kết quả giữa các cao chiết khác nhau.
Về liều dùng
Từ các nghiên cứu trước [13], chúng tôi lựa chọn bẹ móc là nguyên liệu được sử dụng cho nghiên cứu. Liều bẹ móc thể hiện tác dụng mạnh nhất trên chuột bình thường trong các liều khảo sát là 6g/kg chuột nhắt [13] tương đương với liều 3g/kg chuột cống [21]. Do đó, chúng tôi tiếp tục lựa chọn mức liều 3g/kg chuột cống để đánh giá tác dụng của dược liệu.
3.2.2. Về tác dụng của các cao chiết khác nhau từ bẹ cây móc
Sau khi thu được các cao chiết, chúng tôi khảo sát tác dụng của các cao chiết từ bẹ móc với các dung môi khác nhau nhằm tìm ra dung môi tốt nhất đối với tác dụng theo hướng cầm máu của bẹ móc.
Tác dụng cầm máu đường uống của các cao chiết khác nhau từ bẹ cây móc
Mô hình cắt đuôt chuột là mô hình đơn giản, dễ thực hiện và được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu cầm máu [13],[14],[29],[32],[34]. Mô hình này đánh giá tác dụng của thuốc trên tổng thể quá trình cầm máu, thường dùng để đánh giá ban đầu về tác dụng cầm máu của thuốc. Do vậy chúng tôi lựa chọn mô hình này cho nghiên cứu.
Kết quả nghiên cứu cho thấy: cao nước, cao cồn 300, cồn 600, cồn 800, cồn
tuyệt đối và methanol đều làm giảm thời gian chảy máu lần lượt là 24,52% - 28,75% - 34% - 32,24% - 28,62% - 53,81% so với chứng (p < 0,05). Cao methanol còn làm giảm thời gian chảy máu mạnh hơn (53,81%) so với tất cả các cao chiết còn
lại (p < 0,01). Điều này chứng tỏ cao chiết methanol có tác dụng cầm máu đường uống tốt nhất trong tất cả các cao chiết. .
Tác dụng cầm máu tại chỗ của cao chiết khác nhau từ bẹ cây móc
Song song với việc đánh giá tác dụng cầm máu đường uống, chúng tôi tiến hành đánh giá tác dụng cầm máu tại chỗ của các cao chiết khác nhau từ bẹ móc. Theo nghiên cứu trước, cao nước bẹ móc có thể hiện tác dụng cầm máu tại chỗ[13]. Vì vậy chúng tôi dự đoán rằng, các cao chiết với các dung môi được lựa chọn, căn cứ vào định tính thành phần hóa học ở phần trước, cũng sẽ thể hiện tác dụng trên mô hình này.
Adrenalin là thuốc gây co mạch được ứng dụng rộng rãi trên lâm sàng. Cơ
chế tác dụng là do adrenalin kích thích receptor α1 gây co mạch ngoại vi. Vì vậy
chúng tôi lựa chọn adrenalin làm đối chứng dương cho thí nghiệm.
Kết quả nghiên cứu cho thấy cao nước, cồn 300, cồn 600, cồn 800, cồn tuyệt
đối và methanol đều làm giảm thời gian chảy máu so với chứng lần lượt là 30,9%; 37,7%; 53,4%; 39,8%; 45,9%; 58,5%. Như vậy, cao methanol làm giảm thời gian chảy máu mạnh nhất trong tất cả các cao.
Các kết quả về tác dụng cầm máu đường uống và tại chỗ của các cao chiết khác nhau của bẹ móc đã giúp chúng tôi khẳng định cao chiết methanol có tác dụng cầm máu tốt nhất trong tất cả các cao chiết. Các dung môi trên đều là dung môi phân cực nên trong mỗi cao chiết đều có thể chứa cả flavonoid hoặc tanin. Tuy nhiên, các dung môi trên khác nhau về độ phân cực và sự liên kết giữa các tiểu phân dung môi với chất tan dẫn đễn tỷ lệ chất tan trong mỗi cao là khác nhau dẫn đến tác dụng cầm máu khác nhau.
Tác dụng giảm tính thấm thành mạch của bẹ móc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các nghiên cứu trước đó cho thấy:bẹ móc không làm thay đổi số lượng tiểu cầu cũng như các chỉ số đông máu (PT, aPTT, fibrin) [13],[14] cho nên cơ chế cầm máu của bẹ móc có thể là do tác dụng co mạch, làm giảm tính thấm thành mạch là chủ yếu. Một thuốc có tác dụng làm giảm tính thấm thành mạch hoặc tăng sức bền thành mạch sẽ giúp làm giảm sự thoát mạch của các dịch và protein huyết tương, từ
đó làm giảm giảm mức độ phù. Do đó, để tiếp tục khẳng định dung môi chiết cho tác dụng tốt nhất, đồng thời khẳng định thêm tác dụng của bẹ móc là do giảm tính thấm thành mạch, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan và đánh giá gián tiếp tác dụng giảm tính thấm thành mạch qua tỷ lệ ức chế phù. Carrageenan là tác nhân gây phù được sử dụng nhiều trong nghiên cứu thực nghiệm [24], [25], [28]. Sau khi tiêm carrageenan vào bàn chân chuột sẽ kích thích cơ thể giải phóng các chất trung gian như histamin, serotonin và prostaglandin gây giãn các tiểu động mạch, mao mạch, tĩnh mạch dẫn đến tăng tính thấm thành mạch [15].
Ở mô hình này, chúng tôi không thử với cao chiết cồn 300 do tác dụng cầm
máu của dịch chiết này là yếu nhất. Kết quả nghiên cứu cho thấy tất cả các cao chiết đều có tác dụng ức chế phù bàn chân chuột ngay ở giờ thứ nhất (p < 0,01) và giờ thứ 5 sau khi tiêm carrageenan (p < 0,05). Như vậy, với cơ chế làm giảm tính thấm thành mạch, bẹ móc vừa có tác dụng cầm máu, vừa có tác dụng chống viêm. Đây có thể là ưu điểm của bẹ móc khi dùng để điều trị cho những bệnh nhân chảy máu kết hợp với viêm.
Mặt khác, cao methanol có tác dụng làm giảm tính thấm thành mạch nhiều nhất (58,14% ở thời điểm sau 1 giờ, 41,67% ở thời điểm sau 5 giờ ) so với lô chứng (p < 0,01). Điều này càng giúp chúng tôi khẳng định, cao chiết methanol có tác dụng tốt nhất trong tất cả các cao chiết.
Tác dụng co mạch của bẹ móc trên hệ mạch tai thỏ cô lập
Từ các nghiên cứu đi trước cho thấy, cao nước bẹ móc có tác dụng làm co mạch trên mô hình tai thỏ cô lập. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục sử dụng mô hình này để đánh giá tác dụng co mạch của cao chiết khác từ bẹ móc. Trong các cao chiết, cao methanol cho tác dụng cầm máu và giảm tính thấm thành mạch tốt nhất. Do đó, chúng tôi lựa chọn cao methanol và cao nước để làm thí nghiệm này.
Tai thỏ được cô lập khỏi cơ thể sẽ mất sự điều hòa của cơ chế thần kinh và thể dịch đối với hệ mạch [18]. Do đó, khi cho thuốc chạy qua hệ mạch, thuốc sẽ thể hiện tác dụng trực tiếp lên hệ mạch, có thể gây co mạch hoặc giãn mạch [33] thể
hiện qua lượng dịch thoát ra khỏi mạch trong thời gian nhất định. Thuốc có tác dụng co mạch sẽ có tác dụng cầm máu.
Kết quả cho thấy, với cao nước bắt đầu từ nồng độ 0,1% làm giảm số giọt chảy ra ở tĩnh mạch rìa tai thỏ so với ban đầu có ý nghĩa thống kê (p < 0,001). Tác dụng này tăng theo sự tăng nồng độ của cao bẹ móc, với các nồng độ từ 0,1% đến 2% đã làm giảm số giọt chảy ra từ rìa tĩnh mạch tai thỏ từ 10,1% đến 43%.
Cao methanol bắt đầu từ nồng độ 0,05% làm giảm số giọt chảy ra ở tĩnh mạch rìa tai thỏ so với ban đầu có ý nghĩa thống kê (p < 0,01). Tác dụng này tăng theo sự tăng dần nồng độ của cao bẹ móc, với các nồng độ từ 0,05% đến 1% đã làm giảm số giọt chảy ra từ rìa tĩnh mạch tai thỏ từ 10,0% đến 75,7%, tăng nồng độ lên 1,5% và 2% cũng không làm thay đổi số giọt chảy ra từ tĩnh mạch tai thỏ.
Như vậy, có thể thấy cao methanol có tác dụng gây co mạch mạnh hơn rất nhiều so với cao nước (p < 0,05). Cao methanol thể hiện tác dụng co mạch từ nồng độ 0,05%; còn cao nước đến nồng độ 0,1% mới thể hiện. Cao methanol với nồng độ 1% đã làm co mạch tối đa, có tăng thêm nồng độ cao cũng không làm tăng tác dụng co mạch.
Từ kết quả của các thí nghiệm về tác dụng theo hướng cầm máu của các cao chiết khác nhau từ bẹ cây móc, chúng tôi nhận thấy cao chiết methanol cho tác dụng cầm máu và giảm tính thấm thành mạch tốt nhất trong số các cao chiết vì vậy chúng tôi tiếp tục tiến hành chiết phân đoạn và đánh giá tác dụng cầm máu trên các phân đoạn này.
3.2.3. Tác dụng cầm máu đường uống của các phân đoạn cao chiết methanol từ bẹ móc bẹ móc
Với các tác dụng đã nghiên cứu ở trên, chúng tôi dự đoán liên quan đến thành phần flavonoid trong bẹ móc do một số flavonoid có tác dụng sinh học làm giảm tính thấm thành mạch do ức chế enzym hyaluronidase. Để nghiên cứu tác dụng của thành phần này, chúng tôi tiến hành chiết phân đoạn cao chiết methanol với dãy dung môi có độ phân cực tăng dần n - hexan, chloroform, ethylacetat, nước (qui trình chiết ở hình 2.1). Phương pháp này đã được sử dụng trong một số nghiên
cứu về hợp chất flavonoid [17], [22]. Nguyên tắc của phương pháp là do các chất tan có độ phân cực tương tự dung môi sẽ được dung môi hòa tan. Do vậy, các dung môi trên có độ phân cực khác nhau cũng sẽ hòa tan các chất khác nhau. Chúng tôi dự đoán flavonoid toàn phần có thể sẽ nằm ở phân đoạn ethylacetat. Để bước đầu khẳng định tác dụng cầm máu của nhóm chất này trong bẹ móc, khóa luận tiến hành nghiên cứu tác dụng trên thời gian chảy máu đuôi chuột của tất cả các phân đoạn.
Kết quả thu được cho thấy, phân đoạn n - hexan, cloroform, nước không làm giảm thời gian chảy máu so với lô chứng (p > 0,05), phân đoạn ethylacetat và cao methanol toàn phần làm giảm thời gian chảy máu lần lượt là 33,44% và 50,18% so với lô chứng (p < 0,05). Mặt khác sự làm giảm thời gian chảy máu giữa phân đoạn ethylacetat và cao methanol toàn phần là tương đương nhau (p > 0,05). Kết quả này cho thấy phân đoạn ethylacetat có tác dụng cầm máu tương đương với cao toàn phần. Như vậy có thể khẳng định rằng, thành phần có tác dụng cầm máu chủ yếu tan trong dung môi ethylacetat và chúng tôi cho rằng tác dụng này là do nhóm chất flavonoid bởi tanin là hợp chất rất phân cực, tan tốt trong các dung môi phân cực, ít tan trong dung môi phân cực yếu [3] trong đó có ethylacetat, nếu có tan tanin sẽ nằm ở phân đoạn nước. Tuy nhiên đây mới chỉ là nhận định ban đầu, cần có những nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học để xác định cấu trúc hợp chất có tác dụng cầm máu.
Tóm lại, các nghiên cứu đi trước đã cho thấy bẹ móc có tác dụng cầm máu rõ rệt trên động vật bình thường và động vật gây rối loạn đông máu[13], [14]. Điều này mở ra hướng sử dụng bẹ móc làm thuốc cầm máu trên người bình thường có tổn thương dẫn đến chảy máu hoặc trên các bệnh nhân đang điều trị huyết khối phải sử dụng các thuốc chống đông máu kéo dài làm tăng nguy cơ xuất huyết. Khóa luận này đã xác định được dung môi chiết cho tác dụng theo hướng cầm máu tốt nhất của bẹ cây móc là dung môi methanol. Trong các phân đoạn từ cao chiết methanol, phân đoạn ethylacetat cho tác dụng cầm máu tốt nhất. Điều này sẽ mở đường cho việc sản xuất ra các sản phẩm từ bẹ móc có chất lượng cao, giúp bệnh nhân không cần phải sử dụng dược liệu dưới dạng cao thuốc hay dược liệu khô tán bột do vậy hàm
lượng hoạt chất chính xác và ổn định hơn; không phải uống với lượng lớn thuốc; bảo quản dễ dàng hơn.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Qua kết quả thực nghiệm, khóa luận xin đưa ra một số kết luận như sau:
1.1. Về định tính thành phần hóa học:
Trong bẹ móc có chứa các nhóm chất sau: flavonoid, tanin, đường khử, acid hữu cơ.
1.2. Về tác dụng các cao chiết khác nhau từ bẹ cây móc
1.2.1. Tác dụng cầm máu