Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của viên nén bào chế

2.2.3.1. Định lượng

 Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến (áp dụng trong các nghiên cứu bào chế)

- Hàm lượng ACV trong viên được xác định bằng phương pháp đo quang phổ

hấp thu ở bước sóng cực đại 252 nm.

 Phương pháp HPLC pha đảo (áp dụng trong nghiên cứu độổn định) - Thiết bị: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HP 1260 ALIGENT. - Điều kiện sắc ký:

Cột sắc ký: Cột ZORBAX SB C18, kích thước cột 4,6 × 150 mm, đường kính hạt nhồi 5 µm; bảo vệ cột ZORBAX 300 SB – C18 (4,6 × 12,5 mm, 5 µm).

Pha động: hỗn hợp dung dịch acid acetic 0,02M và methanol với tỷ lệ 97:3 (tt/tt).

Tốc độ dòng 1 ml/phút. Thể tích tiêm mẫu 20 µl.

Detector UV bước sóng 252 nm.

2.2.3.2. Đánh giá khả năng giải phóng ACV từ viên bào chế

Khả năng GPDC của viên ACV bào chếđược tiến hành trong các điều kiện sau: - Thiết bị cánh khuấy, tốc độ khuấy 50 ± 1 vòng/phút.

- Môi trường hoà tan: 900ml dung dịch acid chlohydric (HCl) 0,1M. - Nhiệt độ môi trường hoà tan: 37 ± 0,5oC.

- Thời gian thử nghiệm: 8 giờ.

- Lấy mẫu vào các thời điểm: 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ

- Định lượng: đo mật độ quang của dung dịch ở bước sóng 252nm, so sánh với mẫu ACV chuẩn có nồng độ 10g/ml.

Cách tính kết quả:

Nồng độ ACV chưa hiệu chỉnh ở lần hút thứ t được tính theo công thức:

Trong đó: Dto: Độ hấp thu của dung dịch thử

Co: Nồng độ dung dịch chuẩn (g/ml) Do: Độ hấp thu của dung dịch chuẩn  : Độ pha loãng ( = 5; 12,5; 25)

Nồng độ ACV sau khi hiệu chỉnh trong mẫu ở lần hút thứ t được tính theo công thức:

Trong đó: Ct: Nồng độ ACV hiệu chỉnh ở lần hút thứ t (g/ml) Cto: Nồng độ ACV chưa hiệu chỉnh ở lần hút thứ t (g/ml)

Vo: Thể tích dịch hoà tan đã hút (Vo = 10ml) V: Thể tích môi trường hoà tan (V = 900 ml)

Ct-1: Nồng độ ACV hiệu chỉnh ở lần lấy hút thứ t-1 (g/ml) % ACV giải phóng tại thời điểm t được tính theo công thức sau:

Trong đó: Ct: Nồng độ ACV hiệu chỉnh ở lần hút thứ t (µg/ml) m: Hàm lượng ACV trong viên bào chế (mg)

2.2.3.3. Đánh giá khả năng KDSH

 Đánh giá khả năng KDSH in - vitro

- Xử lý niêm mạc dạ dày thỏ: Sau khi giết thỏ bằng cách bơm không khí vào tĩnh mạch vành tai, ngay lập tức phẫu thuật cắt lấy dạ dày. Đem làm sạch bề mặt niêm mạc dạ dày bằng dung dịch nước muối sinh lý sao cho không làm mất lớp chất nhầy trên bề mặt. Niêm mạc được sử dụng ngay sau khi xử lý, cắt thành những miếng có diện tích 4 cm2 ( 2×2 cm).

- Thiết bị dùng để xác định lực KDSH được mô tả trong hình 2.8.

- Đánh giá lực KDSH: Gắn cố định niêm mạc dạ dày thỏ lên giá, làm ướt bề

mặt niêm mạc bằng một thể tích chính xác 0,1ml dung dịch HCl 0,1M sau đó đặt viên thuốc lên niêm mạc. Điều chỉnh cân thăng bằng. Tác động lên viên thuốc một lực 200g trong 1 phút. Cho nước trên buret nhỏ xuống cốc nhựa với tốc độ 3ml/phút

đến khi viên thuốc bị tách ra khỏi bề mặt niêm mạc dưới tác động của trọng lượng nước. Ghi lại khối lượng nước để xác định lực KDSH của viên thuốc. Lực KDSH tính cho 1cm2 diện tích bề mặt viên được tính theo công thức:

F (N/cm2) = 0,00981 ×

S m

Trong đó: S là diện tích bề mặt viên (cm2) được quét hình ảnh và xác định bằng phần mềm Image J 1.46.

Hình 2.8. Thiết bịđánh giá lực kết dính sinh học chế tạo từ cân Roberval

 Đánh giá khả năng KDSH in - vivo

- Người tình nguyện: DSCKII Lê Văn Thanh; giới tính: nam; tuổi: 48 – thành viên trong nhóm nghiên cứu.

- Phương pháp đánh giá: nội soi sau khi uống thuốc. Tiến hành nội soi tại Trung tâm chăm sóc sức khỏe cộng đồng, địa chỉ: 10 Lý Thường Kiệt - phường 11 - quận 10 - Tp Hồ Chí Minh, người thực hiện: BS. Đinh Đức Minh.

- Tiến hành: để có thể sơ bộ xác định khả năng KDSH của viên thuốc chúng tôi chọn thời điểm uống thuốc vào lúc nhu động dạ dày mạnh nhất sau khi ăn 2 giờ. Người tình nguyện ăn sáng lúc 7 giờ, uống thuốc lúc 9 giờ.

2.2.3.4. Đánh giá khả năng hút nước của viên thuốc

Viên thuốc được cho vào giỏ làm bằng thép không gỉ có kích thước mắt lưới 381m và cân xác định khối lượng ban đầu (W0). Sau đó giỏ thuốc được nhúng vào trong 100 ml nước cất ở nhiệt độ 25oC. Sau từng khoảng thời gian nhất định giỏ

thuốc được lấy ra, dùng giấy lọc thấm hết phần nước thừa trên bề mặt và cân xác

định khối lượng (Wt). Khả năng hút nước của viên thuốc được xác định theo công thức:

W0: Khối lượng ban đầu của viên thuốc.

2.2.3.5. Đánh giá khả năng nổi in - vitro

Viên thuốc được thả vào cốc chứa 100ml dung dịch HCl 0,1M. Thời gian từ khi thửđến khi viên thuốc bắt đầu nổi lên trên bề mặt môi trường được tính là thời gian tiềm tàng (tlag). Tổng thời gian viên thuốc nổi trên bề mặt môi trường là thời gian nổi (tnổi).

2.2.3.6. Các phương pháp đánh giá khác:

- Lực gây vỡ viên

- Độ đồng đều khối lượng, độ đồng đều hàm lượng... được thực hiện theo chuyên luận viên nén của DĐVN IV.

2.2.4. Phương pháp nghiên cứu độổn định viên nén ACV 200mg KDSH

- Đối tượng thử: 3 lô × 200 viên nén ACV 200 mg bào chế theo công thức tối ưu

được đóng lọ chất dẻo HDPE có nắp đậy. Mỗi lọđựng 40 viên. - Điều kiện bảo quản:

+ Điều kiện thực: 2 tháng.

+ Lão hóa cấp tốc: nhiệt độ 40 ± 2 0C, độẩm 75 ± 5 % trong 2 tháng

- Chỉ tiêu chất lượng khảo sát: hình thức viên, khối lượng, độ hòa tan, khả năng trương nở, khả năng kết dính sinh học…

2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu

 Thiết kế thí nghiệm và tối ưu hóa công thức

 Thiết kế thí nghiệm

Phần mềm Modde 8.0 được sử dụng để thiết kế thí nghiệm theo mô hình mặt hợp tử tại tâm rút gọn.

 Tối ưu hoá công thức

Ảnh hưởng của các biến đầu vào được đánh giá bằng phần mềm FormRules 2.0 Công thức tối ưu được xác định dựa trên mạng thần kinh nhân tạo bằng phần mềm INForm 3.1.

 Xử lý kết quả phân tích trong phòng thí nghiệm - Tính giá trị trung bình:

- Tính độ lệch chuẩn:

Error! Reference source not found.Error! Reference source not found.Error! Reference source not found.

- Tính độ lệch chuẩn tương đối:

Trong đó: n: số lần lặp lại thí nghiệm.

So sánh hai đồ thị giải phóng dược chất in vitro

f2được tính theo công thức:

                       100 1 1 lg 50 5 . 0 1 2 2 n i i i T R n f

Trong đóError! Reference source not found.: f2: chỉ số biểu hiện cho sự giống nhau của hai đồ thị.

i: số thứ tựđiểm lấy mẫu. n: sốđiểm lấy mẫu.

Ri và Ti: % ACV giải phóng tại thời điểm i của viên đối chiếu và viên bào chế.

Giá trị f2 trong khoảng từ 50 – 100 thì hai đồ thị được coi là giống nhau. Giá trị f2 càng lớn thì hai đồ thị càng giống nhau.

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Xây dựng phương pháp định lượng

3.1.1. Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến

 Tiến hành pha các dung dịch ACV có nồng độ từ 4 g/ml đến 14 g/ml và đo mật độ quang các dung dịch này ở bước sóng 252 nm. Kết quả thể hiện ở bảng 3.5 và hình 3.9.

Bảng 3.5. Mật độ quang (D) và nồng độ (C) của dung dịch ACV

C (g/ml) 4 6 8 10 12 14

D 0,192 0,261 0,348 0,443 0,529 0,618

Hình 3.9. Đồ thị đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa mật độ quang (D) và nồng độ (C) của dung dịch ACV trong môi trường HCl 0,1M.

Nhận xét: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa mật độ quang (D) và nồng độ (C) của dung dịch acyclovir trong môi trường HCl 0,1M là đường thẳng với hệ số tương quan R2 xấp xỉ bằng 1, chứng tỏ trong môi trường HCl 0,1M, mật độ quang phụ

thuộc tuyến tính vào nồng độ ACV trong khoảng khảo sát.

 Trong quá trình xây dựng công thức viên nén ACV 200mg KDSH, đều tiến hành bào chế song song hai mẫu viên. Mẫu chứa ACV và mẫu không chứa ACV (mẫu placebo) với cùng tỷ lệ các tá dược khác.

- Mẫu chứa ACV: Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng khoảng 100mg ACV sau đó pha dung dịch ACV trong HCl 0,1M có nồng độ khoảng 10 g/ml. Đo mật độ quang dung dịch này ở bước sóng 252 nm thu được giá trị DACV.

- Mẫu placebo: Tiến hành song song và tương tự như mẫu chứa ACV. Đo mật

độ quang dung dịch này ở bước sóng 252 nm thu được giá trị D0.

Kết quả đo mật độ quang của mẫu chứa ACV và mẫu placebo theo công thức viên tối ưu được thể hiện trong bảng 3.6.

Bảng 3.6. Mật độ quang của mẫu chứa acyclovir và mẫu placebo theo công thức viên tối ưu

STT 1 2 3 4 5 6 Trung bình

DACV 0,431 0,437 0,435 0,440 0,432 0,438 0,436 ± 0,004

D0 0,004 0,004 0,003 0,004 0,003 0,003 0,0035 ± 0,0005

(D0/DACV)×100 (%) 0,928 0,915 0,690 0,909 0,694 0,684 0,803 ± 0,125

Nhận xét: Tỷ lệ Error! Reference source not found. < 1% chứng tỏ tá dược trong công thức không có ảnh hưởng đến sự hấp thụ mât độ quang của ACV trong môi trường HCl 0,1M ở bước sóng 252 nm. Trong quá trình nghiên cứu, đều thực hiện đánh giá tương tự với các mẫu placebo khác. Kết quả đều cho thấy mật độ

quang của các mẫu này luôn < 1% so với mẫu chứa ACV xử lý trong cùng điều kiện. Vì vậy, có thể thấy trong môi trường HCl 0,1M sự hấp thụ mật độ quang của ACV không bị ảnh hưởng bởi các tá dược.

Kết luận : Có thể sử dụng phương pháp đo quang ở bước sóng 252 nm trong môi trường HCl 0,1M để định lượng ACV trong mẫu thử và trong môi trường hoà tan.

3.1.2. Phương pháp HPLC pha đảo

 Tính tương thích của hệ thống sắc kí: Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần trên một dung dịch chuẩn 10 µg/ml, với các điều kiện chạy sắc ký đã chọn, ghi lại các giá trị

về thời gian lưu, diện tích pic. Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của diện tích pic. Kết quảđược trình bày ở bảng 3.7

Lần đo Thời gian lưu tR (phút) Diện tích pic (mAU.s) 1 7,046 539,3 2 7,025 534,4 3 7,018 533,4 4 6.979 534,5 5 6.963 531,1 6 6.996 534,6 TB 7,0045 534,55 RSD (%) 0,44 0,5 Yêu cầu ≤ 2% ≤ 2%

Nhận xét: Các số liệu thu được cho thấy hệ thống sắc ký chọn lựa là tương thích cho việc định lượng ACV trong viên (RSD ≤ 2%).

 Độ chính xác: độ chính xác được khảo sát bằng sự lặp lại hàm lượng ACV xác

định trên 6 mẫu thử với lượng cân và điều kiện sắc ký đã chọn, kết quả được trình bày trong bảng 3.8.

Bảng 3.8. Khảo sát độ chính xác của phương pháp STT Lượng cân (g) Hàm lượng tìm thấy (%)

1 0,3402 104,83 2 0,3413 102,18 3 0,3407 103,25 4 0,3404 101,54 5 0,3426 100,09 6 0,3418 101,38 TB 0,3412 102,21 RSD (%) 1,61 Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp HPLC đã chọn có độ chính xác cao với độ lệch chuẩn tương đối nhỏ (1,61% < 2 %).

 Độ đúng: Thêm một lượng chính xác 30% chất chuẩn vào mẫu thửđã biết hàm lượng, xử lí mẫu và sắc kí theo điều kiện như trên. Kết quảđược trình bày ở bảng 3.9.

Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độđúng của hệ thống sắc ký STT Lượng

cân (g)

Lượng ACV chuẩn thêm vào

Hàm lượng thực (%) Hàm lượng tìm thấy (%) Tỷ lệ thu hồi (%) 1 0,3402 0,0301 134,83 132,74 98,45 2 0,3413 0,0301 132,07 131,87 99,85 3 0,3407 0,0301 133,21 135,58 101,78 4 0,3404 0,0301 131,51 130,7 99,38 5 0,3426 0,0301 130,09 133,77 102,83 6 0,3418 0,0301 131,42 132,76 101,02 TB (%) 100,55 RSD (%) 1,62

Nhận xét: Phương pháp HPLC có độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi 100,55%) với RSD là 1,62%, phù hợp với yêu cầu chung về đánh giá độ đúng trong phương pháp xác

định hàm lượng hoạt chất trong viên bằng HPLC.

 Tính tuyến tính: Xây dựng đường chuẩn: Tiến hành khảo sát khoảng nồng độ

từ 0,5g/ml đến 20g/ml với 6 mẫu chuẩn ACV pha trong pha động và định lượng bằng phương pháp HPLC. Kết quảđược trình bày ở bảng 3.10, hình 3.10.

Bảng 3.10. Tương quan giữa nồng độ acyclovir và diện tích pic STT Nồng độ ACV (g/ml) Diện tích pic (mAU.s) Kết quả thống kê 1 0,5 40,1 2 2 107,9 3 5 274,8 4 10 534,5 5 16 879,2 6 20 1088,7 Phương trình hồi quy: Y=54,226x+4,0149 R2 = 0,9997

Hình 3.10. Đường chuẩn acyclovir trong pha động

Nhận xét: giá trị R2 gần bằng 1 chứng tỏ trong khoảng nồng độ khảo sát có sự

tương quan tuyến tính giữa nồng độ ACV trong mẫu chuẩn với diện tích pic. Khoảng tuyến tính này phù hợp đểđịnh lượng ACV trong viên.

Kết luận: Trong nghiên cứu độ ổn định, hàm lượng ACV trong viên nén bào chế được định lượng bằng HPLC trên cột ZORBAX SB C18 (4,6×150 mm, 5 µm), bảo vệ cột ZORBAX 300 SB – C18 (4,6×12,5 mm, 5 µm), nhiệt độ phòng, pha

động acid acetic 0,02M/methanol (97:3), tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20 µm, λmax=252 nm. Phương pháp phân tích cho tính tương thích hệ thống cao (RSD < 2%), độ tuyến tính, độ chính xác và độ đúng đạt yêu cầu. Do đó, phương pháp này có thể áp dụng để xác định hàm lượng ACV trong viên nén bào chế.

3.2. Nghiên cứu phương pháp bào chế và các tá dược cơ bản của viên nén acyclovir kết dính niêm mạc đường tiêu hóa acyclovir kết dính niêm mạc đường tiêu hóa

Tiến hành bào chế các mẫu viên với thành phần thể hiện trong bảng 3.11. Các mẫu viên M1, M2, M3, M4, M5 được bào chế song song bằng 2 phương pháp dập thẳng và tạo hạt ướt, mỗi mẻ bào chế 100 viên.

Bảng 3.11. Công thức cho 1 viên khảo sát Mẫu viên STT Thành phần M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 1 ACV (mg) 200 200 200 200 200 200 200 200 200 2 CP 934P (mg) 140 - - - - 50 50 50 50 3 CP940P (mg - 140 - - - 4 HPMCK100M (mg) - - 140 - - 50 - 50 50 5 HPMCK4M (mg) - - - 140 - - 50 - - 6 Natri alginat (mg) - - - - 140 - - - - 7 Natri hydrocarbonat - - - 70 100 8 Lactose (mg) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 9 Avicel (mg) 232 232 232 232 232 272 272 202 172 10 Talc (mg) 7 7 7 7 7 7 7 7 7 11 Magnesi stearat (mg) 14 14 14 14 14 14 14 14 14 12 Aerosil (mg) 7 7 7 7 7 7 7 7 7

Đánh giá một sốđặc tính của mẫu viên bào chế thu được các kết quả sau:

3.2.1. Phương pháp bào chế

 Phương pháp xát hạt ướt:

- Các mẫu viên phải sử dụng một tỷ lệ lớn polyme KDSH có khả năng trương nở mạnh trong môi trường thân nước. Do đó, ngay từđầu chúng tôi đã định hướng dùng các tá dược dính khan nước như isopropanol, ethanol.

- CP 934P và CP 940P có thể hòa tan trong các tá dược dính này làm bột bết dính và vón cục, do đó không thể xát hạt qua rây.

- Natri alginat tạo được hạt nhưng không chắc, sau khi sấy hạt bị bở, khó liên kết. - Các tá dược HPMC K100M và HPMC K4M tạo được hạt. Tuy nhiên, hạt tạo thành rắn chắc làm cho viên nén bào chế có bề mặt xù xì, không nhẵn bóng. Khi

đánh giá khả năng trương nở, viên rã nhanh chóng sau 10 phút vì vậy khó có thể đáp ứng được yêu cầu giải phóng ACV kéo dài. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.13,hình 3.11.

 Phương pháp dập thẳng:

- CP 934P, CP 940P và natri alginat dễ hút ẩm, do đó ảnh hưởng đến khả năng