2.1.1. Nguyên liệu
Bảng 2.4. Nguyên liệu nghiên cứu
STT Nguyên liệu Nguồn gốc TCCL
1 Acyclovir Trung Quốc USP
2 Acyclovir chuẩn VKN – Bộ Y Tế Chuẩn quốc gia
3 CP 934P Mỹ USP
4 CP 940P Mỹ USP
5 HPMC K4M Mỹ TCCS
6 HPMC K100M Mỹ TCCS
7 Natri alginat Trung Quốc BP
8 Lactose Trung Quốc Eur Ph.
9 Natri hydrocarbonat Trung Quốc BP
10 Avicel PH101 Trung Quốc USP
11 Talc Trung Quốc BP
12 Magnesi stearat Pháp Eur.Ph
13 Aerosil Trung Quốc USP
14 Methanol
15 Acid acetic băng Merck, Đức Dùng cho HPLC
16 Ethanol Trung Quốc TKHH
17 Acid chlohydric Trung Quốc TKHH
18 Natri hydroxyd Trung Quốc TKHH
2.1.2. Thiết bị
- Rây 180, 250 m
- Cân kỹ thuật SARTORIUS
- Cân phân tích SARTORIUS có độ chính xác 0,1 mg - Tủ sấy BINDER, HERAEUS
- Máy siêu âm ULTRASONIC LC 60H. - Thiết bị trộn lập phương ERWEKA - Máy dập viên KORSCH EKO.
- Máy hút ẩm EDISON ED – 12B.
- Máy đo lực gây vỡ viên ERWEKA TBH 200. - Máy đo độẩm SARTORIUS.
- Máy đo khối lượng riêng biểu kiến ERWEKA SVM. - Máy đo độ trơn chảy ERWEKA GWF.
- Máy đo pH EUTECH INSTRUMENTS pH 510. - Máy thử hòa tan ERWEKA DT 600.
- Máy đo quang phổ UV – VIS HITACHI U1800. - Máy lọc nén.
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HP 1260 ALIGENT. - Thiết bịđánh giá khả năng KDSH tự chế tạo từ cân kỹ thuật. - Micropipet và các dụng cụ thuỷ tinh.
- Tủ vi khí hậu CLIMACELL.
2.1.3. Động vật thí nghiệm
Động vật thí nghiệm được chọn là thỏ trắng trưởng thành, khoẻ mạnh, giống
đực, có trọng lượng từ 2,0 - 2,5 kg, được nuôi dưỡng trong điều kiện dinh dưỡng
đầy đủ, có kiểm soát, bỏđói qua ngày và được uống nước tự do trước khi tiến hành thí nghiệm.
2.2. Phương pháp nghiên cứu.
2.2.1. Phương pháp bào chế viên nén acyclovir kết dính sinh học
Viên nén ACV KDSH được bào chế theo phương pháp dập thẳng hoặc tạo hạt
ướt với các thành phần dự kiến: Dược chất ACV 200mg, polyme KDSH (natri alginat, CP 934P, CP 940P, HPMC K4M, HPMC K100M), tác nhân tạo khí (natri hydrocarbonat), lactose, Avicel PH 101, Aerosil, magnesi stearat, talc.
Hình 2.7. Sơđồ quy trình bào chế bằng phương pháp dập thẳng
2.2.2. Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của khối bột kép trước khi dập viên khi dập viên
2.2.2.1. Định lượng acyclovir
Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng khoảng 0,1g ACV cho vào bình định mức 100ml, thêm 60ml dung dịch NaOH 0,1M và siêu âm hòa tan trong 15 phút. Thêm dung dịch NaOH 0,1M vừa đủ đến vạch, lắc đều và lọc. Hút chính xác 15ml dịch lọc cho vào bình định mức 100ml, thêm 50ml nước và 5,8ml dung dịch HCl 2M, thêm nước vừa đủ đến vạch. Hút chính xác 5ml dung dịch trên cho vào bình định mức 50ml, thêm dung dịch HCl 0,1M vừa đủ đến vạch và lắc đều. Đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch thu được ở bước sóng hấp thụ cực đại 252nm, so sánh với mẫu ACV chuẩn có nồng độ 10 µg/ml.
Song song tiến hành với các mẫu placebo (không chứa dược chất), kết quả cho thấy mật độ quang của các mẫu này luôn < 1% so với mẫu chứa ACV xử lý trong cùng điều kiện.
2.2.2.2. Xác định khối lượng riêng biểu kiến và chỉ số nén của khối bột
Thể tích biểu kiến của khối bột được đo trên máy ERWEKA SVM. Một lượng bột có khối lượng xác định (m) được cho vào ống đong thể tích hình trụ. Thể tích
khối bột ban đầu là V0. Ống đong được gõ cho đến khi thể tích không thay đổi, đọc thể tích cuối cùng là V.
Khối lượng riêng của khối bột ban đầu:
Khối lượng riêng biểu kiến của khối bột sau khi gõ:
Chỉ số nén Carr của khối bột:
Error! Reference source not found.
2.2.2.3. Xác định độ trơn chảy
Tốc độ chảy của khối bột được đo trên máy ERWEKA GWF, với đường kính lỗ
phễu 12 mm. Tốc độ chảy được tính theo công thức: V = tgφ
Trong đó: V: tốc độ chảy (g/giây)
φ: góc giữa đường thẳng biểu diễn sự phụ thuộc của khối lượng bột chảy theo thời gian và trục hoành (trục thời gian)
2.2.2.4. Xác định hàm ẩm theo phương pháp mất khối lượng do sấy khô
Tiến hành trên cân xác định độẩm nhanh SARTORIUS. Cân chính xác khoảng 1g bột, rải đều vào đĩa cân, đặt nhiệt độ 105°C, theo dõi và đọc kết quả.
2.2.3. Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của viên nén bào chế
2.2.3.1. Định lượng
Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến (áp dụng trong các nghiên cứu bào chế)
- Hàm lượng ACV trong viên được xác định bằng phương pháp đo quang phổ
hấp thu ở bước sóng cực đại 252 nm.
Phương pháp HPLC pha đảo (áp dụng trong nghiên cứu độổn định) - Thiết bị: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HP 1260 ALIGENT. - Điều kiện sắc ký:
Cột sắc ký: Cột ZORBAX SB C18, kích thước cột 4,6 × 150 mm, đường kính hạt nhồi 5 µm; bảo vệ cột ZORBAX 300 SB – C18 (4,6 × 12,5 mm, 5 µm).
Pha động: hỗn hợp dung dịch acid acetic 0,02M và methanol với tỷ lệ 97:3 (tt/tt).
Tốc độ dòng 1 ml/phút. Thể tích tiêm mẫu 20 µl.
Detector UV bước sóng 252 nm.
2.2.3.2. Đánh giá khả năng giải phóng ACV từ viên bào chế
Khả năng GPDC của viên ACV bào chếđược tiến hành trong các điều kiện sau: - Thiết bị cánh khuấy, tốc độ khuấy 50 ± 1 vòng/phút.
- Môi trường hoà tan: 900ml dung dịch acid chlohydric (HCl) 0,1M. - Nhiệt độ môi trường hoà tan: 37 ± 0,5oC.
- Thời gian thử nghiệm: 8 giờ.
- Lấy mẫu vào các thời điểm: 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ
- Định lượng: đo mật độ quang của dung dịch ở bước sóng 252nm, so sánh với mẫu ACV chuẩn có nồng độ 10g/ml.
Cách tính kết quả:
Nồng độ ACV chưa hiệu chỉnh ở lần hút thứ t được tính theo công thức:
Trong đó: Dto: Độ hấp thu của dung dịch thử
Co: Nồng độ dung dịch chuẩn (g/ml) Do: Độ hấp thu của dung dịch chuẩn : Độ pha loãng ( = 5; 12,5; 25)
Nồng độ ACV sau khi hiệu chỉnh trong mẫu ở lần hút thứ t được tính theo công thức:
Trong đó: Ct: Nồng độ ACV hiệu chỉnh ở lần hút thứ t (g/ml) Cto: Nồng độ ACV chưa hiệu chỉnh ở lần hút thứ t (g/ml)
Vo: Thể tích dịch hoà tan đã hút (Vo = 10ml) V: Thể tích môi trường hoà tan (V = 900 ml)
Ct-1: Nồng độ ACV hiệu chỉnh ở lần lấy hút thứ t-1 (g/ml) % ACV giải phóng tại thời điểm t được tính theo công thức sau:
Trong đó: Ct: Nồng độ ACV hiệu chỉnh ở lần hút thứ t (µg/ml) m: Hàm lượng ACV trong viên bào chế (mg)
2.2.3.3. Đánh giá khả năng KDSH
Đánh giá khả năng KDSH in - vitro
- Xử lý niêm mạc dạ dày thỏ: Sau khi giết thỏ bằng cách bơm không khí vào tĩnh mạch vành tai, ngay lập tức phẫu thuật cắt lấy dạ dày. Đem làm sạch bề mặt niêm mạc dạ dày bằng dung dịch nước muối sinh lý sao cho không làm mất lớp chất nhầy trên bề mặt. Niêm mạc được sử dụng ngay sau khi xử lý, cắt thành những miếng có diện tích 4 cm2 ( 2×2 cm).
- Thiết bị dùng để xác định lực KDSH được mô tả trong hình 2.8.
- Đánh giá lực KDSH: Gắn cố định niêm mạc dạ dày thỏ lên giá, làm ướt bề
mặt niêm mạc bằng một thể tích chính xác 0,1ml dung dịch HCl 0,1M sau đó đặt viên thuốc lên niêm mạc. Điều chỉnh cân thăng bằng. Tác động lên viên thuốc một lực 200g trong 1 phút. Cho nước trên buret nhỏ xuống cốc nhựa với tốc độ 3ml/phút
đến khi viên thuốc bị tách ra khỏi bề mặt niêm mạc dưới tác động của trọng lượng nước. Ghi lại khối lượng nước để xác định lực KDSH của viên thuốc. Lực KDSH tính cho 1cm2 diện tích bề mặt viên được tính theo công thức:
F (N/cm2) = 0,00981 ×
S m
Trong đó: S là diện tích bề mặt viên (cm2) được quét hình ảnh và xác định bằng phần mềm Image J 1.46.
Hình 2.8. Thiết bịđánh giá lực kết dính sinh học chế tạo từ cân Roberval
Đánh giá khả năng KDSH in - vivo
- Người tình nguyện: DSCKII Lê Văn Thanh; giới tính: nam; tuổi: 48 – thành viên trong nhóm nghiên cứu.
- Phương pháp đánh giá: nội soi sau khi uống thuốc. Tiến hành nội soi tại Trung tâm chăm sóc sức khỏe cộng đồng, địa chỉ: 10 Lý Thường Kiệt - phường 11 - quận 10 - Tp Hồ Chí Minh, người thực hiện: BS. Đinh Đức Minh.
- Tiến hành: để có thể sơ bộ xác định khả năng KDSH của viên thuốc chúng tôi chọn thời điểm uống thuốc vào lúc nhu động dạ dày mạnh nhất sau khi ăn 2 giờ. Người tình nguyện ăn sáng lúc 7 giờ, uống thuốc lúc 9 giờ.
2.2.3.4. Đánh giá khả năng hút nước của viên thuốc
Viên thuốc được cho vào giỏ làm bằng thép không gỉ có kích thước mắt lưới 381m và cân xác định khối lượng ban đầu (W0). Sau đó giỏ thuốc được nhúng vào trong 100 ml nước cất ở nhiệt độ 25oC. Sau từng khoảng thời gian nhất định giỏ
thuốc được lấy ra, dùng giấy lọc thấm hết phần nước thừa trên bề mặt và cân xác
định khối lượng (Wt). Khả năng hút nước của viên thuốc được xác định theo công thức:
W0: Khối lượng ban đầu của viên thuốc.
2.2.3.5. Đánh giá khả năng nổi in - vitro
Viên thuốc được thả vào cốc chứa 100ml dung dịch HCl 0,1M. Thời gian từ khi thửđến khi viên thuốc bắt đầu nổi lên trên bề mặt môi trường được tính là thời gian tiềm tàng (tlag). Tổng thời gian viên thuốc nổi trên bề mặt môi trường là thời gian nổi (tnổi).
2.2.3.6. Các phương pháp đánh giá khác:
- Lực gây vỡ viên
- Độ đồng đều khối lượng, độ đồng đều hàm lượng... được thực hiện theo chuyên luận viên nén của DĐVN IV.
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu độổn định viên nén ACV 200mg KDSH
- Đối tượng thử: 3 lô × 200 viên nén ACV 200 mg bào chế theo công thức tối ưu
được đóng lọ chất dẻo HDPE có nắp đậy. Mỗi lọđựng 40 viên. - Điều kiện bảo quản:
+ Điều kiện thực: 2 tháng.
+ Lão hóa cấp tốc: nhiệt độ 40 ± 2 0C, độẩm 75 ± 5 % trong 2 tháng
- Chỉ tiêu chất lượng khảo sát: hình thức viên, khối lượng, độ hòa tan, khả năng trương nở, khả năng kết dính sinh học…
2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu
Thiết kế thí nghiệm và tối ưu hóa công thức
Thiết kế thí nghiệm
Phần mềm Modde 8.0 được sử dụng để thiết kế thí nghiệm theo mô hình mặt hợp tử tại tâm rút gọn.
Tối ưu hoá công thức
Ảnh hưởng của các biến đầu vào được đánh giá bằng phần mềm FormRules 2.0 Công thức tối ưu được xác định dựa trên mạng thần kinh nhân tạo bằng phần mềm INForm 3.1.
Xử lý kết quả phân tích trong phòng thí nghiệm - Tính giá trị trung bình:
- Tính độ lệch chuẩn:
Error! Reference source not found.Error! Reference source not found.Error! Reference source not found.
- Tính độ lệch chuẩn tương đối:
Trong đó: n: số lần lặp lại thí nghiệm.
So sánh hai đồ thị giải phóng dược chất in vitro
f2được tính theo công thức:
100 1 1 lg 50 5 . 0 1 2 2 n i i i T R n f
Trong đóError! Reference source not found.: f2: chỉ số biểu hiện cho sự giống nhau của hai đồ thị.
i: số thứ tựđiểm lấy mẫu. n: sốđiểm lấy mẫu.
Ri và Ti: % ACV giải phóng tại thời điểm i của viên đối chiếu và viên bào chế.
Giá trị f2 trong khoảng từ 50 – 100 thì hai đồ thị được coi là giống nhau. Giá trị f2 càng lớn thì hai đồ thị càng giống nhau.
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Xây dựng phương pháp định lượng
3.1.1. Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến
Tiến hành pha các dung dịch ACV có nồng độ từ 4 g/ml đến 14 g/ml và đo mật độ quang các dung dịch này ở bước sóng 252 nm. Kết quả thể hiện ở bảng 3.5 và hình 3.9.
Bảng 3.5. Mật độ quang (D) và nồng độ (C) của dung dịch ACV
C (g/ml) 4 6 8 10 12 14
D 0,192 0,261 0,348 0,443 0,529 0,618
Hình 3.9. Đồ thị đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa mật độ quang (D) và nồng độ (C) của dung dịch ACV trong môi trường HCl 0,1M.
Nhận xét: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa mật độ quang (D) và nồng độ (C) của dung dịch acyclovir trong môi trường HCl 0,1M là đường thẳng với hệ số tương quan R2 xấp xỉ bằng 1, chứng tỏ trong môi trường HCl 0,1M, mật độ quang phụ
thuộc tuyến tính vào nồng độ ACV trong khoảng khảo sát.
Trong quá trình xây dựng công thức viên nén ACV 200mg KDSH, đều tiến hành bào chế song song hai mẫu viên. Mẫu chứa ACV và mẫu không chứa ACV (mẫu placebo) với cùng tỷ lệ các tá dược khác.
- Mẫu chứa ACV: Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng khoảng 100mg ACV sau đó pha dung dịch ACV trong HCl 0,1M có nồng độ khoảng 10 g/ml. Đo mật độ quang dung dịch này ở bước sóng 252 nm thu được giá trị DACV.
- Mẫu placebo: Tiến hành song song và tương tự như mẫu chứa ACV. Đo mật
độ quang dung dịch này ở bước sóng 252 nm thu được giá trị D0.
Kết quả đo mật độ quang của mẫu chứa ACV và mẫu placebo theo công thức viên tối ưu được thể hiện trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Mật độ quang của mẫu chứa acyclovir và mẫu placebo theo công thức viên tối ưu
STT 1 2 3 4 5 6 Trung bình
DACV 0,431 0,437 0,435 0,440 0,432 0,438 0,436 ± 0,004
D0 0,004 0,004 0,003 0,004 0,003 0,003 0,0035 ± 0,0005
(D0/DACV)×100 (%) 0,928 0,915 0,690 0,909 0,694 0,684 0,803 ± 0,125
Nhận xét: Tỷ lệ Error! Reference source not found. < 1% chứng tỏ tá dược trong công thức không có ảnh hưởng đến sự hấp thụ mât độ quang của ACV trong môi trường HCl 0,1M ở bước sóng 252 nm. Trong quá trình nghiên cứu, đều thực hiện đánh giá tương tự với các mẫu placebo khác. Kết quả đều cho thấy mật độ
quang của các mẫu này luôn < 1% so với mẫu chứa ACV xử lý trong cùng điều kiện. Vì vậy, có thể thấy trong môi trường HCl 0,1M sự hấp thụ mật độ quang của ACV không bị ảnh hưởng bởi các tá dược.
Kết luận : Có thể sử dụng phương pháp đo quang ở bước sóng 252 nm trong môi trường HCl 0,1M để định lượng ACV trong mẫu thử và trong môi trường hoà tan.
3.1.2. Phương pháp HPLC pha đảo
Tính tương thích của hệ thống sắc kí: Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần trên một dung dịch chuẩn 10 µg/ml, với các điều kiện chạy sắc ký đã chọn, ghi lại các giá trị
về thời gian lưu, diện tích pic. Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của diện tích pic. Kết quảđược trình bày ở bảng 3.7
Lần đo Thời gian lưu tR (phút) Diện tích pic (mAU.s) 1 7,046 539,3 2 7,025 534,4 3 7,018 533,4 4 6.979 534,5 5 6.963 531,1 6 6.996 534,6 TB 7,0045 534,55 RSD (%) 0,44 0,5 Yêu cầu ≤ 2% ≤ 2%
Nhận xét: Các số liệu thu được cho thấy hệ thống sắc ký chọn lựa là tương thích cho việc định lượng ACV trong viên (RSD ≤ 2%).
Độ chính xác: độ chính xác được khảo sát bằng sự lặp lại hàm lượng ACV xác
định trên 6 mẫu thử với lượng cân và điều kiện sắc ký đã chọn, kết quả được trình bày trong bảng 3.8.
Bảng 3.8. Khảo sát độ chính xác của phương pháp