37 X14 QN Thô ráp, sợi khuẩn ty dài, đen 38 X15 QN Khô ráp xù xì, tròn, viề n xám, vôi hóa
3.1.2. Tuyển chọn bước đầu các chủng vi sinh vật phân lập được
Phụ phẩm nông nghiệp được tạo thành từ nhiều thành phần hữu cơ phức tạp như: xenlulo, hemixenlulo, lignin, tinh bột, protein... trong đó thành phần xenlulo thường có tỉ lệ lớn nhất. Do đó về lý thuyết, để xử lý hoàn toàn loại chất thải này cần phải có một tổ hợp VSV có khả năng phân giải tất cả các thành phần nêu trên, đặc biệt là phân giải xenlulo. Nhiều nhà khoa học như Nguyễn Xuân Thành (2003, 2005) và Đinh Hồng Duyên (2011) đã nhận thấy rằng: những vi sinh vật có hoạt tính enzyme xenlulaza cao cũng thường có cả hai loại enzyme proteaza, amylaza.
Điều này có ý nghĩa rất lớn trong việc giảm bớt kinh phí nghiên cứu trong phòng thí nghiệm.
Mặt khác, để chọn được những chủng vi sinh vật có khả năng phân giải xenlulo xử lí phụ phẩm nông nghiệp thì ngoài đánh giá hoạt tính enzyme xenlulaza và CMCaza cần thiết phải đánh giá bổ sung về thời gian mọc và kích thước khuẩn lạc. Vì vậy trong khuôn khổ luận văn, đã tiến hành đánh giá đồng thời 4 chỉ tiêu
trên để lựa chọn ra các chủng nổi trội nhất.
Từ 38 chủng VSV phân lập được ở trên, đã tiến hành đánh giá khả năng phân giải xenlulo, CMC, xác định thời gian mọc, kích thước khuẩn lạc. Theo phương pháp này thì chủng nào có vòng phân giải lớn sẽ có hoạt tính mạnh và ngược lại, chủng nào có vòng phân giải nhỏ thì hoạt tính yếu... Kết quảđược thể
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 43
Bảng 3.3. Một số đặc tính sinh học của 38 chủng vi sinh vật phân lập
STT Chủng VSV Hoạt tính enzyme (D - d ) (mm) Thời gian mọc (giờ) Kích thước K.lạc (mm) STT Chủng VSV Hoạt tính enzyme (D - d ) (mm) Thời gian mọc (giờ) Kích thước K.lạc (mm) X C X C 1 V1 14 10,3 36 4 20 V20 6 4,5 84 2 2 V2 12 10 36 4 21 V21 3,6 0 96 2 3 V3 5 6,5 48 2 22 V22 22 18 36 3 4 V4 18 14 36 4 23 V23 19 12 24 4 5 V5 28 23 24 4 24 X1 16,3 14 60 3 6 V6 8,3 3,5 36 3 25 X2 11 12 48 2 7 V7 5 13 24 2 26 X3 12 10 72 2 8 V8 17 15,3 32 3 27 X4 24 21,6 60 3 9 V9 29 25 24 5 28 X5 3 1 72 1 10 V10 15,6 9 48 4 29 X6 27,3 25 48 3 11 V11 2 1 96 3 30 X7 0 9,3 48 2 12 V12 3 12 48 1 31 X8 30 26 48 4 13 V13 10 3 72 2 32 X9 21 16 60 3 14 V14 25 21 48 4 33 X10 14 13,6 84 3 15 V15 22,5 15 24 3 34 X11 10,5 12 48 1 16 V16 17 15,3 84 3 35 X12 1 0 96 2 17 V17 12 8 84 3 36 X13 4 13 72 1 18 V18 16 16,5 72 2 37 X14 20 21 48 2 19 V19 4 1 48 3 38 X15 16,5 12 84 4
Chú giải: + d: Đường kính lỗđục (mm); + C: CMCaza; + D: Đường kính vòng phân giải lớn (mm); + X: Xenlulaza; + KH: Kí hiệu; + K.lạc: Khuẩn lạc; Kích thước khuẩn lạc được đo và lấy giá trị trung bình sau 5 ngày nuôi cấy.
Hoạt tính Xenlulaza
Hoạt tính enzyme là chỉ tiêu quan trọng nhất khi lựa chọn vi sinh vật. Bảng
3.3 cho thấy: tỉ lệ các chủng có hoạt tính xenlulaza rất cao, có 37 chủng có hoạt tính trên tổng số 38 chủng đã phân lập được, chiếm tỉ lệ 97,37%. Trong đó 100% số chủng vi khuẩn phân lập được có vòng phân giải và 93,33% số chủng xạ khuẩn
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 44 phân lập được có vòng phân giải. 4 chủng vi sinh vật bao gồm 2 chủng vi khuẩn
(V5, V9) và 2 chủng xạ khuẩn (X6, X8) có hoạt tính enzyme ngoại bào Xenlulaza
cao nhất, lần lượt là: 28mm; 29mm và 27,3mm; 30mm. Kết quả trên khá gần với nghiên cứu của các tác giả Nguyễn Xuân Thành và Đinh Hồng Duyên (2005).
Hoạt tính CMCaza
Tiếp tục khảo sát hoạt tính CMCaza của các chủng VSV tuyển chọn, kết quả 36/38 chủng có hoạt tính, chiếm tỉ lệ 94,74%. 9 chủng VSV có hoạt tính <10mm, các chủng còn lại đều có hoạt tính từ 15 – 30mm. Cả 4 chủng VSV có hoạt tính enzyme xenlulaza cao nhất ở trên đều có hoạt tính enzyme CMCaza cao.
Một số điều nhận thấy qua bảng 3.3 là: luôn có một tỷ lệ nhất định vi sinh vật không xác định được hoạt tính dù vẫn có khả năng phát triển trên môi trường chuyên tính phân giải xenlulo, một số chủng VSV có hoạt tính CMCaza cao nhưng chưa chắc đã có hoạt tính xenlulaza cao và ngược lại. Điều này hoàn toàn phù hợp với kết quả luận án tiến sĩ của tác giảĐinh Hồng Duyên (2011). Bản chất
phức hệ xenlulaza bao gồm 3 enzyme chủ yếu: endoglucanaza hay CMCaza, endoglucanaza hay xenlubiahydrolaza và β-glucozidaza. Từng thành phần trong
phức hệ xenlulaza không có khả năng thủy phân hoàn toàn xenlulo tự nhiên mà cần có sự hiệp đồng của 3 thành phần (đã trình bày trong mục 1.3.2). Vì thế, việc
đánh giá hoạt tính phân hủy xenlulo tự nhiên là cần thiết để có thể tuyển chọn
được chính xác các chủng VSV triển vọng phân giải phụ phẩm nông nghiệp.
Thời gian mọc và kích thước khuẩn lạc
Để chọn ra được các chủng VSV phù hợp nhất, tiêu chí về thời gian mọc và kích thước khuẩn lạc cũng đóng vai trò quan trọng nhất định, liên quan trực tiếp tới tốc độ và khả năng cạnh tranh của các chủng VSV hữu ích với các chủng VSV ngoại lai không mong muốn. Kết quả thí nghiệm cho thấy, đa số các chủng xạ khuẩn và vi khuẩn phân lập đều là các chủng mọc nhanh, chỉ có 13/38 chủng mà thời gian mọc trên 72h (chiếm gần 33%) trong đó có 7/23 chủng vi khuẩn và 6/15 chủng xạ khuẩn. Có 4 chủng vi khuẩn mọc sớm nhất tại thời điểm trước và trong 24h đầu nuôi cấy (V5, V7, V9, V15, V23), 6 chủng xạ khuẩn mọc sớm nhất tại trước và trong 48h đầu nuôi cấy (X2, X6, X7, X8, X11, X14). Điều đó chứng tỏ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 45
hầu hết các chủng xạ khuẩn đều mọc chậm hơn so với vi khuẩn ở giai đoạn 3 – 5 ngày đầu.
Kích thước khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn thay đổi từ 1 – 5 mm, kích thước khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn thay đổi trong khoảng hẹp hơn (từ 1 – 4mm). Tiếp tục nhận thấy bốn chủng VSV được đánh giá cao nhất về hoạt tính enzyme (V5, V9 và X6, X8) đều có kích thước khuẩn lạc khá lớn, lần lượt nhận giá trị trung bình 4mm, 5mm, 3mm và 4mm.
Như vậy, trên cơ sởđánh giá 4 chỉ tiêu cơ bản của các chủng VSV phân lập (ưu tiên 2 chỉ tiêu đầu) là hoạt tính CMCaza, hoạt tính xenlulaza, thời gian mọc và kích thước khuẩn lạc đã chọn được 4 chủng VSV triển vọng gồm hai chủng vi
khuẩn V5, V9 và hai chủng xạ khuẩn X6, X8 để tiếp tục sàng lọc bước tiếp theo.