Khảo sát sự hiện diện của các mrna bart (rpms1, a73 và barf0) mã hóa cho epstein barr virus liên quan đến ung thư vòm họng trên cộng đồng người việt nam nghiên cứu khoa học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC mRNA BART (RPMS1, A73 VÀ BARF0) MÃ HÓA CHO EPSTEIN-BARR VIRUS LIÊN QUAN ĐẾN UNG THƯ VÒM HỌNG TRÊN CỘNG ĐỒNG NGƯỜI VIỆT NAM TP HCM, tháng năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC mRNA BART (RPMS1, A73 VÀ BARF0) MÃ HÓA CHO EPSTEIN-BARR VIRUS LIÊN QUAN ĐẾN UNG THƯ VÒM HỌNG TRÊN CỘNG ĐỒNG NGƯỜI VIỆT NAM Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Hoàng Nhật Minh Khoa: Công Nghệ Sinh Học Thành viên: Nguyễn Thị Thùy Trang Ngô Văn Tài Hà Thị Phương Trinh GVHD: ThS Lao Đức Thuận TP HCM, tháng năm 2018 Nghiên cứu khoa học i MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH ẢNH iv DANH MỤC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii ĐẶT VẤN ĐỀ .1 UNG THƯ VÀ UNG THƯ VÒM HỌNG .2 1.1 Ung thư 1.2 Ung thư vòm họng 1.2.1 Giải phẫu vòm mũi họng .2 1.2.2 Sơ lược ung thư vòm họng 1.2.3 Tình hình ung thư vòm họng giới Việt Nam 1.2.4 Nguyên nhân gây ung thư vòm họng EPSTEIN-BARR VIRUS .7 2.1 Tổng quan Epstein-Barr Virus (EBV) 2.2 BamHI-A rightward transcripts (BARTs) 2.3 mRNA RPMS1 2.4 mRNA A73 10 2.5 mRNA BARF0 11 KĨ THUẬT PCR, RT-PCR REALTIME-PCR .12 3.1 Kỹ thuật PCR 12 3.2 Kỹ thuật Reverse Transcription PCR (RT-PCR) .13 3.3 Kỹ thuật Realtime-PCR 14 3.3.1 Định nghĩa 14 3.3.2 Biểu đồ khuếch đại Realtime-PCR .15 VẬT LIỆU .17 1.1 Danh mục phần mềm trang web sử dụng: .17 1.2 Mẫu thí nghiệm 18 1.3 Thiết bị 18 1.4 Hoá chất 18 1.4.1 Hoá chất cần thiết cho quy trình tách chiết 18 1.4.2 Hoá chất cần thiết cho quy trình PCR điện di .18 1.4.3 Hố chất cần thiết cho quy trình tách chiết RNA chuyển đổi cDNA 18 SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh Nghiên cứu khoa học ii PHƯƠNG PHÁP 19 2.1 Chọn lọc trích xuất liệu .19 2.2 Phân tích thống kê tổng hợp 19 2.3 Thu nhận đánh giá thông số vật lý độ đặc hiệu cặp mồi mRNA BARTs 19 2.4 Quy trình nghiên cứu thực nghiệm 20 2.4.1 Tách chiết RNA tổng số kit GeneJET RNA Purification Kit (Thermofisher) .20 2.4.2 Chuyển RNA tổng số thành cDNA SensiFAST™ cDNA Synthesis Kit (Bio line) 22 2.4.3 2.5 Sử dụng phương pháp Realtime-PCR khuếch đại trình tự mục tiêu 22 Phân tích kết thực nghiệm .22 KẾT QUẢ KHẢO SÁT IN SILICO CƠ SỞ DỮ LIỆU .24 1.1 Kết trích xuất liệu .24 1.2 Kết thống kê tổng quan cơng trình nghiên cứu 25 1.3 Tần số phát mRNA BARTs 27 1.4 Phương pháp phát mRNA BARTs 30 1.5 Các loại mẫu sử dụng để phát mRNA BARTs 30 1.6 Phân tích tổng hợp (meta-analysis) mối tương quan tỉ lệ phát mRNA BARTs loại mẫu .31 1.7 Phân tích mối tương quan tỉ lệ phát mRNA BARTs với loại mẫu thông qua biểu đồ 33 ĐÁNH GIÁ CÁC THÔNG SỐ VẬT LÝ VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA CÁC CẶP MỒI .35 2.1 Thu nhận trình tự cặp mồi mRNA BARTs 35 2.2 Kết kiểm tra thông số vật lý cặp mồi 36 2.3 Kết kiểm tra độ đặc hiệu mồi 40 2.3.1 Kiểm tra độ đặc hiệu bắt cặp mồi Annhyb 40 2.3.2 Kết kiểm tra độ đặc hiệu mồi BLAST 44 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM .48 3.1 Kết khuếch đại mRNA BARTs 48 3.1.1 Kết khuếch đại trình tự mRNA BARF0 48 3.1.2 Kết khuếch đại mRNA RPMS1 52 SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh Nghiên cứu khoa học iii 3.1.3 Kết khuếch đại mRNA A73 57 3.1.4 Kết khuếch đại mRNA GAPDH 61 3.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ 65 3.2.1 Kết phân tích thống kê tần số phát mRNA BARTs .65 3.2.2 Phân tích biểu mRNA BARTs .70 3.2.3 Phân tích mối tương quan yếu tố nguy tỉ lệ nhiễm UTVH mẫu nghiên cứu 75 KẾT LUẬN 78 1.1 Kết khảo sát in silico .78 1.2 Kết thực nghiệm .78 KIẾN NGHỊ 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 PHỤ LỤC .85 SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh iv Nghiên cứu khoa học DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình vẽ minh hoạ giải phẫu khu vực đầu cổ người Hình 1.2 Sự phân bố tỉ lệ mắc UTVH năm 2002 nam nữ Hình 1.3 Biểu đồ cột thể tỉ lệ nhiễm UTVH tử vong châu Á Hình 1.4 Sơ đồ thể yếu tố nguy gây UTVH Hình 2.1 a) Sơ đồ gen EBV dạng vòng; b) Sơ đồ gen EBV dạng thẳng Hình 2.2 Con đường tín hiệu Notch tế bào 10 Hình 2.3 Sơ đồ thể mối quan hệ đường tín hiệu RACK1 11 Hình 3.1 Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) 13 Hình 3.2 Kỹ thuật reverse transcription PCR (RT-PCR) 14 Hình 3.3 Biểu đồ khuếch đại Realtime-PCR 16 Hình 3.4 Chu trình nhiệt cho phản ứng chuyển đổi cDNA 22 Hình 4.1 Sơ đồ mơ tả quy trình chọn lọc cơng trình nghiên cứu cho phân tích tổng hợp 24 Hình 4.2 Trung bình trọng số phát mRNA BARTs 29 Hình 4.3 Biểu đồ phễu thể tần số phát mRNA BARTs mẫu mô 34 Hình 4.4 Biểu đồ rừng thể tần số phát mRNA BARTs mẫu mô 34 Hình 5.1 Chu trình nhiệt khuếch đại cDNA phương pháp Realtime-PCR 39 Hình 5.2 Kết Annhyb cặp mồi BARF-LLW5 BARF-2 .40 Hình 5.3 Kết Annhyb cặp mồi RPMS1-5 RPMS1-6 41 Hình 5.4 Kết Annhyb cặp mồi Exon5-7 Exon3B-5 42 Hình 5.5 Kết Annhyb cặp mồi GAPDH-F GAPDH-R 43 Hình 5.6 Kết BLAST mồi mRNA BARF-LLW5 BARF-2 44 Hình 5.7 Kết BLAST mồi mRNA RPMS1-5,6 45 Hình 5.8 Kết BLAST cặp mồi mRNA Exon5-7 Exon3B-5 .46 Hình 5.9 Kết BLAST mô tả cặp mồi GAPDH-F, R 47 Hình 5.10 Kết BLAST cặp mồi GAPDH-F, R 47 Hình 6.1 Biểu đồ khuếch đại mRNA BARF0 15 mẫu bệnh 49 Hình 6.2 Đường cong nhiệt độ nóng chảy mRNA BARF0 15 mẫu bệnh 50 Hình 6.3 Đỉnh nhiệt độ nóng chảy mRNA BARF0 15 mẫu bệnh 50 Hình 6.4 Kết điện di sản phẩm Realtime-PCR mRNA BARF0 15 mẫu bệnh 51 Hình 6.5 Kết giải trình tự BLAST sản phẩm khuếch đại mRNA BARF0 51 Hình 6.6 Kết gióng cột trình tự sản phẩm mRNA BARF0 52 Hình 6.7 Biểu đồ khuếch đại mRNA RPMS1 15 mẫu bệnh 53 Hình 6.8 Đường cong nhiệt độ nóng chảy mRNA RPMS1 15 mẫu bệnh 54 Hình 6.9 Đỉnh nhiệt độ nóng chảy mRNA RPMS1 15 mẫu bệnh 54 Hình 6.10 Kết điện di sản phẩm Realtime-PCR mRNA RPMS1 15 mẫu bệnh 55 Hình 6.11 Kết giải trình tự BLAST sản phẩm khuếch đại mRNA RPMS1 56 Hình 6.12 Kết gióng cột trình tự sản phẩm mRNA RPMS1 57 Hình 6.13 Biểu đồ khuếch đại mRNA A73 mẫu bệnh mẫu lành 58 SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh Nghiên cứu khoa học v Hình 6.14 Đỉnh nhiệt độ nóng chảy mRNA A73 mẫu bệnh mẫu lành 58 Hình 6.15 Kết điện di sản phẩm Realtime-PCR mRNA A73 mẫu bệnh mẫu lành 59 Hình 6.16 Kết giải trình tự BLAST sản phẩm khuếch đại mRNA A73 60 Hình 6.17 Kết gióng cột trình tự sản phẩm mRNA A73 60 Hình 6.18 Biểu đồ khuếch đại mRNA GAPDH 13 mẫu lành 61 Hình 6.19 Đỉnh nhiệt độ nóng chảy mRNA GAPDH 13 mẫu lành 62 Hình 6.20 Đường cong nhiệt độ nóng chảy mRNA GAPDH 13 mẫu lành 62 Hình 6.21 Kết điện di sản phẩm Realtime-PCR mRNA GAPDH 13 mẫu lành 63 Hình 6.22 Kết giải trình tự BLAST sản phẩm khuếch đại mRNA GAPDH 64 Hình 6.23 Kết gióng cột trình tự sản phẩm mRNA GAPDH 64 Hình 7.1 Biểu đồ cột thể tính tương quan mức độ biểu mRNA BARTs mẫu bệnh so với mẫu lành 74 Hình 7.2 Biểu đồ thể mối tương quan độ tuổi tần số phát mRNA BARTs 76 SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh vi Nghiên cứu khoa học DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Các nghiên cứu mRNA BARTs liên quan đến nhiều loại ung thư khác giới 25 Bảng 1.2 Các công trình tần số phát mRNA BARTs dịng tế bào 27 Bảng 1.3 Các cơng trình tần số phát mRNA BARTs mô sinh thiết 28 Bảng 1.4 Kết trung bình trọng số mRNA BARTs 28 Bảng 1.5 Phương pháp sử dụng để phát định lượng mRNA BARTs 30 Bảng 1.6 Các loại mẫu sử dụng nghiên cứu 30 Bảng 1.7 Phân tích tính tương quan việc phát ba loại mRNA BARTs với mẫu mô liên quan đến EBV 31 Bảng 1.8 Phân tích tính tương quan việc phát ba loại mRNA BARTs với mẫu dịng tế bào ni cấy liên quan đến EBV 32 Bảng 2.1 Các cặp mồi BARTs sử dụng nghiên cứu 36 Bảng 2.2 Bảng thông số vật lý mồi mRNA BARTs 37 Bảng 2.3 Giá trị nhiệt độ bắt cặp thời gian kéo dài phản ứng 39 Bảng 3.1 Kết phân tích thống kê phát mRNA BARTs 65 Bảng 3.2 Kết phân tích thống kê kết hợp mRNA BARF0 theo nhóm 68 Bảng 3.3 Giá trị định lượng mRNA BARTs mẫu bệnh 70 Bảng 3.4 Giá trị định lượng mRNA BARTs mẫu lành 71 Bảng 3.5 Giá trị tính tốn biểu mRNA công thức 2-∆∆Ct 73 Bảng 3.6 Phân tích thống kê mối tương quan giới tính tần số phát mRNA BARTs 75 Bảng 3.7 Phân tích thống kê mối tương quan độ tuổi tần số phát mRNA BARTs 76 SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh vii Nghiên cứu khoa học DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ASR Age-Specific Rate BART BamHI-A rightward transcript BLAST Basic Local Alignment Search Tool Bp Base pair CBF1 C-repeat/DRE binding factor cDNA Complementary DNA CDS Coding sequence Cq Quantification cycle CSL CBF1, Suppressor of Hairless, Lag-1 DNA Deoxyribonucleic acid EBER Epstein-Barr virus encoded small RNA EBV Epstein-Barr Virus GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase HLA Human leukocyte antigen IARC International Agency for Research on Cancer IDT Integrated DNA Technologies IgA Immunoglobulin A LCLs Lymphoblastoid cell lines mRNA Messenger ribonucleic acid NCBI National Center for Biotechnology Information ORF Open Reading Frame PCR Polymerase chain reaction RACK1 Receptor for activated C kinase1 RefSeq Reference Sequence RNA Ribonucleic acid SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh viii Nghiên cứu khoa học Realtime-PCR PCR thời gian thực RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction Ta Annealing temperature Tm Melting temperature UTR Untranslated region UTVH Ung thư vòm họng WHO World Health Organization SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh Nghiên cứu khoa học 74 Kết tính tốn tần số biểu mRNA BARTs cho thấy: giá trị 2-∆∆Ct mRNA RPMS1, BARF0, A73 4,51; 7,19 4,59 Có nghĩa việc xuất mRNA RPMS1, mRNA BARF0 người chuẩn đoán nhiễm UTVH sẽ biểu tương ứng gấp 4,51; 7,19 4,59 lần người lành Qua khẳng định thêm việc nhiễm mRNA BARTs sẽ làm tăng cao khả gây ung thư người bệnh Hình 7.1 Biểu đồ cột thể tính tương quan mức độ biểu mRNA BARTs mẫu bệnh so với mẫu lành Chú thích: dấu * thể khơng có khác biệt mức độ biểu mẫu bệnh mẫu lành Tần số biểu mRNA BARTs cịn thể qua Hình 7.1 cách tính tốn dựa giá trị trung bình cộng (MEAN) với sai số chuẩn (SEM) tỉ lệ phát mRNA mục tiêu Kết phân tích sai số chuẩn mRNA RPMS1, BARF0 A73 2,03; 0,76 0,26 Có nghĩa mức biểu mRNA RPMS1 mẫu bệnh so với mẫu lành giao động từ 4,51 – 6,54 lần, tương tự với mRNA BARF0 7,19 – 7,95 lần 4,59 – 4,85 lần mRNA A73 Ngoài biểu đồ thể tương đồng mRNA GAPDH mẫu bệnh mẫu lành với giá trị sai số chuẩn mRNA GAPDH thấp (xấp xỉ 0,02) gen giữ SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh Nghiên cứu khoa học 75 nhà, biểu mức độ ổn định tế bào Kết có ý nghĩa nghiên cứu với mức ý nghĩa p < 0,0001 3.2.3 Phân tích mối tương quan yếu tố nguy tỉ lệ nhiễm UTVH mẫu nghiên cứu Bảng 3.6 Phân tích thống kê mối tương quan giới tính tần số phát mRNA BARTs Giới tính Nam Nữ Mẫu bệnh Dương tính Âm tính Dương tính Âm tính 24 (80%) (0%) (26,67%) (6,67%) 16 (20%) (0%) (53,33%) (13,33%) Tổng p-value Mẫu lành 30 30 (100%) (100%) p = 0,228 Giá trị p-value phân tích mối tương quan giới tính tần số phát mRNA BARTs mẫu bệnh mẫu lành lớn 0,05 khơng có ý nghĩa nghiên cứu Thiết nghĩ có lẽ chênh lệch tỉ lệ nam/nữ mẫu mô sinh thiết mẫu lành (ở mẫu bệnh nam giới chiếm 80% mẫu lành nữ giới chiếm 66,67%) Sự sai lệch lựa chọn (selection bias) bắt nguồn chọn mẫu từ ban đầu, gây sai số hệ thống (systematic bias) cho việc phân tích mối tương quan giới tính tỉ lệ phát Tuy nhiên, thấy nghiên cứu thu nhận mẫu cách ngẫu nhiên tỉ lệ mẫu bệnh nam giới cao hơn, tương tự tỉ lệ mẫu dịch phết lành đa số nữ giới Có thể nói từ ban đầu tỉ lệ nhiễm EBV có liên quan mật thiết đến giới tính trước thống kê nghiên cứu chứng minh UTVH nam giới cao nữ giới (tỉ lệ mắc UTVH nam giới cao gấp – lần so với nữ giới, GLOBOCAN 2012 [47]) SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh Nghiên cứu khoa học 76 Bảng 3.7 Phân tích thống kê mối tương quan độ tuổi tần số phát mRNA BARTs Giới tính nhỏ 20 tuổi từ 20 – 40 tuổi từ 40 – 60 tuổi lớn 60 tuổi Mẫu bệnh Dương tính Âm tính Dương tính Âm tính 0 (3,33%) (0%) (0%) (3,33%) (23,33%) (0%) (30%) (3,33%) 14 13 (46,67%) (0%) (43,33%) (10%) (26,67%) (0%) (6,67%) (3,33%) Tổng p-value Mẫu lành 30 30 (100%) (100%) p = 0,01 Hình 7.2 Biểu đồ thể mối tương quan độ tuổi tần số phát mRNA BARTs SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh Nghiên cứu khoa học 77 Biểu đồ cho thấy có mối tương quan chặt chẽ tần số phát mRNA BARTs với yếu tố nguy khảo sát độ tuổi, giá trị p-value < 0,05 mức có ý nghĩa Cụ thể có đến 54/60 (90%) mẫu dương tính với ba mRNA BARTs mẫu bệnh mẫu lành, cịn lại 6/60 (10%) mẫu âm tính Có phân bố rõ rệt nhóm tuổi với mức độ nhiễm UTVH Cụ thể nhóm 20 tuổi có tỉ lệ nhiễm thấp, tăng dần theo nhóm tuổi, cao nhóm 40 – 60 tuổi giảm xuống nhóm lớn 60 tuổi Sự chênh lệch xảy sai lệch chọn mẫu nghiên cứu (số mẫu nhóm 40 – 60 tuổi chiếm gần phân nửa số lượng mẫu) Tuy nhiên điều không đáng kể mục tiêu nghiên cứu khảo sát tần số phát đánh giá biểu mRNA BARTs Do coi kết sai lệch xảy nghiên cứu (random bias) chấp nhận Ngoài ra, muốn nghiên cứu cách xác yếu tố ảnh hưởng cần phải thực lượng mẫu lớn lấy ngẫu nhiên cộng đồng dân sinh SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh Nghiên cứu khoa học CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh Nghiên cứu khoa học 78 KẾT LUẬN 1.1 Kết khảo sát in silico Qua tiến hành khảo sát in silico phương pháp thống kê tổng hợp dựa nghiên cứu đồn hệ cơng trình nghiên cứu thu thập sau chọn lọc trích xuất liệu, nhận thấy rằng: (1) RT-PCR phương pháp sử dụng để phát mRNA mục tiêu; (2) Loại mẫu nghiên cứu dịng tế bào ni cấy mẫu mơ sinh thiết; (3) Tỉ lệ phát mRNA BARTs cao đạt 97% kết hợp phát ba mRNA RPMS1, BARF0 A73 mẫu mô sinh thiết; (4) Chưa có nghiên cứu thực số lượng lớn mẫu quần thể dân sinh Do đó, nghiên cứu tạo sở lý thuyết vững để hướng đến việc phát mRNA RPMS1, BARF0 A73 mẫu mô sinh thiết dịch phết từ người bệnh người lành Việt Nam phương pháp RT-PCR Realtime-PCR Đây dạng nghiên cứu ca bệnh – chứng mức độ phân tử biểu họ gen BARTs (RPMS1, BARF0 A73) cộng đồng người Việt Nam Thu nhận, đánh giá thông số vật lý cặp mồi dùng để khuếch đại mRNA BARTs xây dựng quy trình phát hiện, định lượng mRNA mục tiêu phương pháp Realtime-PCR 1.2 Kết thực nghiệm Tiến hành phân tích 30 mẫu mơ sinh thiết UTVH 30 mẫu lành từ tình nguyện viên, ghi nhận tần số phát mRNA RPMS1, BARF0, A73 28/30 (93,33%); 21/30 (70%) 22/30 (73,33%) mẫu bệnh 20/30 (66,67%); 11/30 (36,67%); 7/30 (76,67%) mẫu lành Phân tích kết dựa nghiên cứu ca bệnh – chứng cho thấy tần số phát mRNA RPMS1, BARF0, A73 28/30 (93,33%); 21/30 (70%) 22/30 (73,33%) mẫu bệnh 20/30 (66,67%); 11/30 (36,67%); 7/30 (76,67%) mẫu lành Thống kê thực nghiệm cho thấy giá trị tỉ suất chênh, nguy tương đối mức độ phù hợp RPMS1, BARF0 A73 OR = (95%CI = 1,38 – 35,48), RR = 1,4 (95%CI = 1,07 – 1,83), κ = 0,27 mRNA RPMS1; OR = 4,03 (95% SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh Nghiên cứu khoa học 79 CI = 1,37 – 11,84), RR = 1,91 (95% CI = 1,13 – 3,23), κ = 0,33 mRNA BARF0 OR = 9,04 (95% CI = 2,80 – 29,13), RR = 3,14 (95% CI = 1,59 – 6,22), κ = 0,5 cho mRNA A73 Việc sử dụng kết hợp hai mRNA RPMS1 A73 làm tăng độ nhạy độ xác cao kiểm tra mRNA riêng lẻ, với tần số phát 30/30 (100%) mẫu bệnh 22/30 (73,33%) mẫu lành; tỉ suất chênh từ tăng vượt mức (OR = 23,04; 95%CI = 1,26 – 40,39; p < 0,05) Phân tích thống kê nghiên cứu đồn hệ cịn cho thấy có tương quan tỉ lệ nhiễm mRNA BARTs với độ tuổi người nhiễm, với giới tính chọn mẫu ngẫu nhiên Qua suy đốn tỉ lệ nhiễm UTVH nam giới cao nữ giới độ tuổi 40 – 60 tuổi sẽ có tỉ lệ nhiễm EBV nhiều Bằng cách áp dụng công thức 2-∆∆Ct Livak, nghiên cứu chứng minh mức độ biểu mRNA RPMS1, BARF0, A73 người bệnh tăng 4,51; 7,19 4,59 lần so với người lành Vì khẳng định việc có mặt EBV tế bào có khả làm gia tăng mức độ nhiễm UTVH Qua đó, việc nghiên cứu mục tiêu mRNA BARTs thể tiềm mạnh mẽ cho việc đánh giá biểu gen virus suy đoán phiên mã BARTs kích hoạt giúp trì giai đoạn nhiễm tiềm tan EBV khởi đầu cho trình sinh ung tăng sinh khối u, hình thành mạch,… hay chí di đến vùng khác người chuẩn đoán nhiễm UTVH Kết nghiên cứu cho thấy việc phát định lượng mRNA BARTs (RPMS1, BARF0 A73) dấu chứng sinh học tiềm cho việc chẩn đoán, tiên lượng UTVH người Việt Nam tảng cho việc phát triển hướng nghiên cứu chuyên sâu KIẾN NGHỊ Có thể nhận thấy qua thống kê nghiên cứu giới, số lượng mẫu lành dùng để nghiên cứu cịn chưa có nghiên cứu thực số lượng lớn mẫu quần thể dân cư Do cần mở rộng cỡ mẫu thí nghiệm quần thể lớn, kể bệnh nhân UTVH lẫn người lành để đưa nhận định khách quan biểu mRNA BARTs người nhiễm cộng đồng người Việt Nam SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh Nghiên cứu khoa học 80 Nghiên cứu xác định biến thể vị trí 155391 (G > A) mẫu nghiên cứu mRNA RPMS1 sau mang giải trình tự đối chiếu với gen chủng EBV hoang dã (NC_007605) Feng cộng (2015) phân tích tổng hợp từ 1109 ca bệnh 2052 ca lành nghiên cứu Trung Quốc cho thấy biến thể SNP G155391A có liên quan chặt chẽ với UTVH có khả ảnh hưởng đến trình sinh ung bệnh nhân [23] Ngoài ra, nghiên cứu Shen (2015) Zhang (2007) xác định lượng lớn mẫu nghiên cứu có biến thể A157154C hai biến thể với tần suất thấp G159188C G159209C cộng đồng dân cư Trung Quốc so sánh với chủng EBV B95.8 [23, 74] Do đề xuất sử dụng phương pháp RealtimePCR hay PCR để tiếp tục nghiên cứu biến thể RPMS1 A73 cộng đồng người Việt Nam BARTs cấu tạo từ micro RNA (miR-BARTs) tìm thấy với tần suất cao hầu hết tế bào biểu mô nhiễm EBV [16] Các miR-BARTs1–22 với số tương ứng cho thứ tự mà chúng khám phá, cho ngắm mục tiêu đến gen khác (LMP-1, E-cadherin, PTEN, DICER, TOMM22, IPO7, ) từ làm biến đổi đường dẫn truyền tín hiệu liên quan đến tăng sinh, apoptosis, di căn,… tế bào, tạo thuận lợi cho phát triển ung thư Do miRNA khám phá khoảng thời gian gần nên nghiên cứu miRNA-BARTs dành quan tâm lớn từ nhà khoa học giới Vì việc phân tích mối liên hệ họ gen BARTs với UTVH cộng đồng người Việt Nam tiếp tục thực SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh Nghiên cứu khoa học 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Website [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] http://cebp.aacrjournals.org/content/15/10/1765#ref-137, (c) http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_population.aspx, (c) http://globocan.iarc.fr/Pages/online.aspx, (c) http://www.iarc.fr/en/media-centre/pr/2013/, (c) http://www.who.int/cancer/en/, (c) https://www.cancer.gov/about-cancer/understanding/what-is-cancer, (c) https://www.cancer.gov/types/head-and-neck/head-neck-fact-sheet, (c) Vân, P H., (2009),"PCR real-time PCR: Các vấn đề áp dụng thường gặp," (A), Nhà Xuất Bản Y Học, pp 1-9 Al-Mozaini, M et al., (2009),"Epstein–Barr virus BART gene expression," Journal of General Virology, vol 90, no 2, pp 307-316 Armstrong, R W et al., (2000),"Nasopharyngeal carcinoma in Malaysian Chinese: occupational exposures to particles, formaldehyde and heat," International journal of epidemiology, vol 29, no 6, pp 991-998 Barber, R D et al., (2005),"GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues," Physiological genomics, vol 21, no 3, pp 389395 Bell, A I et al., (2006),"Analysis of Epstein–Barr virus latent gene expression in endemic Burkitt's lymphoma and nasopharyngeal carcinoma tumour cells by using quantitative realtime PCR assays," Journal of General Virology, vol 87, no 10, pp 2885-2890 Brennan, B., (2006),"Nasopharyngeal carcinoma," Orphanet Journal of Rare Diseases, vol 1, no 1, p 23 Brink, A A et al., (1997),"Multiprimed cDNA synthesis followed by PCR is the most suitable method for Epstein-Barr virus transcript analysis in small lymphoma biopsies," Molecular and cellular probes, vol 11, no 1, pp 39-47 Brooks, L et al., (1993),"Transcripts from the Epstein-Barr virus BamHI A fragment are detectable in all three forms of virus latency," Journal of virology, vol 67, no 6, pp 31823190 Cai, L et al., (2015),"Epstein–Barr virus-encoded microRNA BART1 induces tumour metastasis by regulating PTEN-dependent pathways in nasopharyngeal carcinoma," Nature communications, vol 6, p 7353 Chen, H.-L et al., (1992),"Transcription of BamHI-A region of the EBV genome in NPC tissues and B cells," Virology, vol 191, no 1, pp 193-201 Chen, H et al., (1999),"Expression of Epstein-Barr virus BamHI-A rightward transcripts in latently infected B cells from peripheral blood," Blood, vol 93, no 9, pp 3026-3032 Chiang, A K et al., (1996),"Nasal NK‐and T‐cell lymphomas share the same type of Epstein‐ Barr virus latency as nasopharyngeal carcinoma and Hodgkin's disease," International journal of cancer, vol 68, no 3, pp 285-290 de Jesus, O et al., (2003),"Updated Epstein–Barr virus (EBV) DNA sequence and analysis of a promoter for the BART (CST, BARF0) RNAs of EBV," Journal of general virology, vol 84, no 6, pp 1443-1450 Deacon, E et al., (1993),"Epstein-Barr virus and Hodgkin's disease: transcriptional analysis of virus latency in the malignant cells," Journal of Experimental Medicine, vol 177, no 2, pp 339-349 Einhorn, E., (2013),"The scaffolding protein RACK1: multiple roles in human cancer," BioSciences Master Rev., vol SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh Nghiên cứu khoa học [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] 82 Feng, F.-T et al., (2015),"A single nucleotide polymorphism in the Epstein-Barr virus genome is strongly associated with a high risk of nasopharyngeal carcinoma," Chinese journal of cancer, vol 34, no 3, p 61 Fries, K L et al., (1997),"Identification of a novel protein encoded by the BamHI A region of the Epstein-Barr virus," Journal of virology, vol 71, no 4, pp 2765-2771 Fuentes-Pananá, E M et al., (2000),"Regulation of the Epstein-Barr virus C promoter by AUF1 and the cyclic AMP/protein kinase A signaling pathway," Journal of virology, vol 74, no 17, pp 8166-8175 Gilligan, K et al., (1991),"Expression of the Epstein-Barr virus BamHI A fragment in nasopharyngeal carcinoma: evidence for a viral protein expressed in vivo," Journal of virology, vol 65, no 11, pp 6252-6259 Goldsmith, D et al., (2002),"HLA associations with nasopharyngeal carcinoma in Southern Chinese: a meta‐analysis," Clinical Otolaryngology, vol 27, no 1, pp 61-67 Guha, N et al., (2007),"Oral health and risk of squamous cell carcinoma of the head and neck and esophagus: results of two multicentric case-control studies," American journal of epidemiology, vol 166, no 10, pp 1159-1173 Higgins, J P et al., (2003),"Measuring inconsistency in meta-analyses," BMJ: British Medical Journal, vol 327, no 7414, p 557 Jang, B.-G et al., (2011),"Expression of BamHI-A rightward transcripts in Epstein-Barr virusassociated gastric cancers," Cancer research and treatment: official journal of Korean Cancer Association, vol 43, no 4, p 250 Kalla, M and W Hammerschmidt, (2012),"Human B cells on their route to latent infection– early but transient expression of lytic genes of Epstein-Barr virus," European journal of cell biology, vol 91, no 1, pp 65-69 Karran, L et al., (1992),"Expression of a family of complementary-strand transcripts in Epstein-Barr virus-infected cells," Proceedings of the National Academy of Sciences, vol 89, no 17, pp 8058-8062 Kieff, E., (1996),"Epstein-Barr virus and its replication," Virology Kienzle, N et al., (1999),"Epstein-Barr virus-encoded RK-BARF0 protein expression," Journal of virology, vol 73, no 10, pp 8902-8906 Kusano, S and N Raab-Traub, (2001),"An Epstein-Barr virus protein interacts with Notch," Journal of virology, vol 75, no 1, pp 384-395 Lee, M.-A et al., (1999),"Genetic evidence that EBNA-1 is needed for efficient, stable latent infection by Epstein-Barr virus," Journal of virology, vol 73, no 4, pp 2974-2982 Li, A et al., (2005),"Transcriptional expression of RPMS1 in nasopharyngeal carcinoma and its oncogenic potential," Cell Cycle, vol 4, no 2, pp 303-308 Lin, C.-T et al., (1997),"The mechanism of Epstein-Barr virus infection in nasopharyngeal carcinoma cells," The American journal of pathology, vol 150, no 5, p 1745 Lin, J.-H et al., (2007),"Dysregulation of HER2/HER3 signaling axis in Epstein-Barr virusinfected breast carcinoma cells," Journal of virology, vol 81, no 11, pp 5705-5713 Littman, A J and T L Vaughan, (2009), "Cancers of the nasal cavity and paranasal sinuses," in Cancer epidemiology and prevention: Oxford University Press Liu, X et al., (2013),"Visual detection and evaluation of latent and lytic gene expression during Epstein-Barr virus infection using one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification," International journal of molecular sciences, vol 14, no 12, pp 23922-23940 Livak, K J and T D Schmittgen, (2001),"Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2− ΔΔCT method," methods, vol 25, no 4, pp 402-408 Mayne, S T et al., (2009), "Cancers of the oral cavity and pharynx," in Cancer epidemiology and prevention: Oxford University Press SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh Nghiên cứu khoa học [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] 83 Mimi, C Y and J.-M Yuan, "Epidemiology of nasopharyngeal carcinoma," in Seminars in cancer biology, 2002, vol 12, no 6, pp 421-429: Elsevier Mori, R et al., (2008),"Both β‐actin and GAPDH are useful reference genes for normalization of quantitative RT‐PCR in human FFPE tissue samples of prostate cancer," The Prostate, vol 68, no 14, pp 1555-1560 Mueller, N et al., (1996),"Viruses," Cancer Epidemiology and Prevention, Ed, vol 2, pp 503602 Parkin, D M and C S Muir, (1992),"Cancer Incidence in Five Continents Comparability and quality of data," IARC scientific publications, no 120, pp 45-173 Patterson, R L et al., (2004),"RACK1 binds to inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptors and mediates Ca2+ release," Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol 101, no 8, pp 2328-2332 Peng, H et al., (2016),"The important role of the receptor for activated C kinase (RACK1) in nasopharyngeal carcinoma progression," Journal of translational medicine, vol 14, no 1, p 131 Prasad, U., (1979),"Fossa of Rosenmuller and nasopharyngeal carcinoma," The Medical journal of Malaysia, vol 33, no 3, p 222 Raab-Traub, N et al., (1991),"Epstein-Barr virus infection in carcinoma of the salivary gland," Journal of virology, vol 65, no 12, pp 7032-7036 Rychlik, W et al., (1990),"Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro," Nucleic acids research, vol 18, no 21, pp 6409-6412 Sadler, R H and N Raab-Traub, (1995),"Structural analyses of the Epstein-Barr virus BamHI A transcripts," Journal of virology, vol 69, no 2, pp 1132-1141 Schmittgen, T D and B A Zakrajsek, (2000),"Effect of experimental treatment on housekeeping gene expression: validation by real-time, quantitative RT-PCR," Journal of biochemical and biophysical methods, vol 46, no 1-2, pp 69-81 Shanmugaratnam, K and L H Sobin, (1993),"The World Health Organization histological classification of tumours of the upper respiratory tract and ear," Cancer, vol 71, no 8, pp 2689-2697 Smith, P R et al., (2000),"Structure and coding content of CST (BART) family RNAs of EpsteinBarr virus," Journal of virology, vol 74, no 7, pp 3082-3092 Sugawara, Y et al., (1999),"Detection of Epstein–Barr virus (EBV) in hepatocellular carcinoma tissue: a novel EBV latency characterized by the absence of EBV-encoded small RNA expression," Virology, vol 256, no 2, pp 196-202 Sugiura, M et al., (1996),"Transcriptional analysis of Epstein-Barr virus gene expression in EBV-positive gastric carcinoma: unique viral latency in the tumour cells," British journal of cancer, vol 74, no 4, p 625 Tao, Q et al., (1998),"Epstein-Barr virus (EBV) in endemic Burkitt's lymphoma: molecular analysis of primary tumor tissue," Blood, vol 91, no 4, pp 1373-1381 Tao, Q et al., (2006),"Epstein-Barr virus (EBV) and its associated human cancers–genetics, epigenetics, pathobiology and novel therapeutics," Front Biosci, vol 11, no 2, pp 2672-2713 Thornburg, N J et al., (2004),"Identification of Epstein-Barr virus RK-BARF0-interacting proteins and characterization of expression pattern," Journal of virology, vol 78, no 23, pp 12848-12856 van Beek, J et al., (2003),"In vivo transcription of the Epstein–Barr virus (EBV) BamHI-A region without associated in vivo BARF0 protein expression in multiple EBV-associated disorders," Journal of general virology, vol 84, no 10, pp 2647-2659 Van Gorp, J et al., (1996),"Expression of Epstein-Barr virus encoded latent genes in nasal T cell lymphomas," Journal of clinical pathology, vol 49, no 1, pp 72-76 SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh Nghiên cứu khoa học [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] 84 Vaughan, T L et al., (1996),"Nasopharyngeal cancer in a low-risk population: defining risk factors by histological type," Cancer Epidemiology and Prevention Biomarkers, vol 5, no 8, pp 587-593 Wang, F et al., (1990),"Epstein-Barr virus nuclear antigen transactivates latent membrane protein LMP1," Journal of virology, vol 64, no 7, pp 3407-3416 Webster-Cyriaque, J and N Raab-Traub, (1998),"Transcription of Epstein–Barr virus latent cycle genes in oral hairy leukoplakia," Virology, vol 248, no 1, pp 53-65 Weng, A P and J C Aster, (2004),"Multiple niches for Notch in cancer: context is everything," Current opinion in genetics & development, vol 14, no 1, pp 48-54 Yamamoto, T and K Iwatsuki, (2012),"Diversity of Epstein–Barr virus BamHI-A rightward transcripts and their expression patterns in lytic and latent infections," Journal of medical microbiology, vol 61, no 10, pp 1445-1453 Young, L et al., (1989),"Identification of a human epithelial cell surface protein sharing an epitope with the C3d/epstein‐barr virus receptor molecule of B lymphocytes," International journal of cancer, vol 43, no 5, pp 786-794 Young, L S and A B Rickinson, (2004),"Epstein–Barr virus: 40 years on," Nature Reviews Cancer, vol 4, no 10, p 757 Yuan, J M et al., (2000),"Preserved foods in relation to risk of nasopharyngeal carcinoma in Shanghai, China," International journal of cancer, vol 85, no 3, pp 358-363 Zeng, Y.-X and W.-H Jia, "Familial nasopharyngeal carcinoma," in Seminars in cancer biology, 2002, vol 12, no 6, pp 443-450: Elsevier Zhang, J et al., (2001),"Epstein-Barr virus BamHi-a rightward transcript-encoded RPMS protein interacts with the CBF1-associated corepressor CIR to negatively regulate the activity of EBNA2 and NotchIC," Journal of virology, vol 75, no 6, pp 2946-2956 Zhang, L et al., (2007),"Correlation of Epstein-Barr virus A73 gene polymorphisms to susceptibility to nasopharyngeal carcinoma," Ai zheng= Aizheng= Chinese journal of cancer, vol 26, no 10, pp 1047-1051 SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh 85 Nghiên cứu khoa học PHỤ LỤC Phụ lục Danh sách mẫu mô bệnh phẩm thí nghiệm từ bệnh viện Chợ Rẫy STT Kí hiệu Tên bệnh nhân Giới tính Năm sinh Độ tuổi Loại mẫu T5 Hoàng Trọng L Nam 1979 39 mô T6 Ngô Phương Đ Nữ 1980 38 mô T7 Huỳnh Cương Q Nam 1958 60 mô T8 Nguyễn Văn O Nam 1955 63 mô T9 Nguyễn Văn D Nam 1972 46 mô T12 Huỳnh Kim S Nam 1970 48 mô T17 Đinh Quốc T Nam 1973 45 mô T20 Nguyễn Văn Đ Nam 1946 72 mô T25 Trần Văn C Nam 1979 39 mô 10 T26 Mai Đức T Nữ 1974 49 mô 11 T27 Thạch K Nam 1954 64 mô 12 T28 Lê Văn M Nam 1954 66 mô 13 T30 Nguyễn Công T Nam 1977 41 mô 14 T36 Nguyễn Văn H Nam 1971 47 mô 15 T39 Pha P Nam 1956 62 mô 16 T41 Trần Quảng N Nam 1971 47 mô 17 T42 Nguyễn Ngọc D Nữ 1967 51 mô 18 T43 Phạm Bá B Nam 1999 19 mô 19 T44 Võ Danh L Nam 1956 62 mô 20 T46 Trương Văn K Nam 1979 39 mô 21 T47 Nguyễn Trọng H Nam 1985 33 mô 22 T49 Trần Thị P Nam 1941 77 mô 23 T51 Võ Tâm T Nam 1959 59 mô SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh 86 Nghiên cứu khoa học 24 T83 Lê Thị Huỳnh L Nữ 1958 60 mô 25 T84 Lê Thị Y Nữ 1959 59 mô 26 T87 Trần Văn T Nam 1998 20 mô 27 T88 Nguyễn T Nam 1993 25 mô 28 T89 Phùng A H Nam 1970 48 mô 29 T90 Bùi Văn H Nam 1963 55 mô 30 T91 Lưu Thị M Nữ 1945 73 mô Phụ lục Danh sách mẫu dịch phết lành thí nghiệm từ bệnh viện Chợ Rẫy STT Kí hiệu Tên bệnh nhân Giới tính Năm sinh Độ tuổi Loại mẫu L1 Nguyễn Thị Ngọc H Nữ 1999 19 dịch phết L2 Đỗ Thị H Nữ 1963 55 dịch phết L4 Trần Thị Lệ H Nữ 1967 51 dịch phết L5 Nguyễn Thị Mộng H Nữ 1978 40 dịch phết L6 Đỗ Văn V Nam 1961 57 dịch phết L7 Võ Quốc T Nam 1996 22 dịch phết L8 Phó Băng H Nam 1994 24 dịch phết L9 Nguyễn Văn T Nam 1972 46 dịch phết L10 Đoàn Thị T Nữ 1965 53 dịch phết 10 L11 Lê Thị Ngọc M Nữ 1986 32 dịch phết 11 L12 Nguyễn Văn Q Nam 1992 26 dịch phết 12 L13 Nguyễn Thị H Nữ 1982 36 dịch phết 13 L14 Nguyễn Anh T Nam 1982 36 dịch phết 14 L16 Võ Thị G Nữ 1982 36 dịch phết 15 L17 Sơn Thị K Nữ 1945 73 dịch phết 16 L18 Nguyễn Thị Kim H Nữ 1972 46 dịch phết 17 L19 Phan Thị L Nữ 1949 69 dịch phết SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh 87 Nghiên cứu khoa học 18 L20 Hồ Văn Ô Nam 1947 71 dịch phết 19 L21 Trương Văn L Nam 1976 42 dịch phết 20 L22 Trần Thị Thanh T Nữ 1977 41 dịch phết 21 L23 Dương Văn E Nam 1966 52 dịch phết 22 L24 Đinh Hữu V Nam 1982 36 dịch phết 23 L25 Nguyễn Thị M Nữ 1966 52 dịch phết 24 L26 Đỗ Thị Diễm T Nữ 1987 31 dịch phết 25 L27 Khê Thị G Nữ 1966 52 dịch phết 26 L30 Nguyễn Thị C Nữ 1971 47 dịch phết 27 L32 Lương Thị Bích T Nữ 1994 24 dịch phết 28 L38 Đoàn Văn L Nữ 1967 51 dịch phết 29 L39 Nguyễn Thị H Nữ 1975 43 dịch phết 30 L40 Trần Thị Kim H Nữ 1962 56 dịch phết SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh ... QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Thông tin chung: - Tên đề tài: KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC mRNA BART (RPMS1, A73 VÀ BARF0) MÃ HÓA CHO EPSTEIN- BARR VIRUS LIÊN QUAN ĐẾN UNG THƯ VÒM HỌNG TRÊN CỘNG ĐỒNG... Chợ Rẫy, Việt Nam với tên đề tài: “KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC mRNA BART (RPMS1, BARF0 VÀ A73) MÃ HOÁ CHO EPSTEIN- BARR VIRUS LIÊN QUAN ĐẾN UNG THƯ VÒM HỌNG TRÊN CỘNG ĐỒNG NGƯỜI VIỆT NAM? ?? SVTH:... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC mRNA BART (RPMS1, A73 VÀ BARF0) MÃ HÓA CHO EPSTEIN- BARR