SEMINAR CNSH NN Cao học Bách Khoa HCM Khóa 2020: CRISPR Cas9 và tiếp cận Tin Sinh Học

CRISPRCas9: CRISPR là 1 công nghệ đã được ứng dụng để chuyển gene ở nhiều loài động thực vật. Lợi thế của CRISPR là có tính đặc hiệu cao, dễ thiết kế phản ứng và có thể được coi là 1 cơ chế tái tổ hợp tự nhiên nên ít bị vướng hàng rào pháp lý về GMO. Ứng dụng cho cây lúa chịu bạc lá. Ngoài ra chúng ta cũng sẽ đề cập 1 chút về phần tin sinh hỗ trợ thiết kế gRNA.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TPHCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC NÔNG NGHIỆP CHUYỂN GEN CHỐNG BẠC LÁ Ở LÚA SUPER BASMATI BẰNG CÔNG NGHỆ CRISPR – CAS GVHD: PGSTS LÊ THỊ THỦY TIÊN HV : NGUYỄN VÕ MINH TRUNG 1/3/22 HV : LÊ THỊ HỒNG NGÂN 1/3/22 ĐẶT VẤN ĐỀ • TỔNG QUAN • VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP • KẾT QUẢ • BÀN LUẬN • NỘI DUNG ĐẶT VẤN ĐỀ Gạo Basmat: Hạt dài Trồng chủ yếu Ấn Độ Pakistan Có loại trắng nâu Nổi tiếng khắp giới hương vị, mùi thơm lợi ích tuyệt vời cho sức khỏe 1/3/22 ĐẶT VẤN ĐỀ 1/3/22 ĐẶT VẤN ĐỀ Vấn đề sản xuất lúa gạo - Tình hình tiêu thụ tăng nhanh so với sản xuất - Do ảnh hưởng biến đổi khí hậu - Sự quay trở lại số bệnh lúa (bạc lá, đạo ôn …) 1/3/22 ĐẶT VẤN ĐỀ Một bệnh lúa gây thiệt hại đáng kể: Bệnh bạc 1/3/22 TỔNG QUAN 1/3/22 Bệnh bạc Vi khuẩn gây bệnh bạc Cơ chế gây bệnh Cơng cụ chỉnh sửa BỆNH BẠC LÁ • • • Được phát lần Nhật Bản Năm 1974: Ezuka xác định Xanthomonas Oryzae Trở nên phổ biến vùng trồng lúa khắp giới vào cuối thập kỷ 60 đến đầu thập kỷ 80 kỷ trước • 1/3/22 Hiện lại có xu hướng quay trở lại BỆNH BẠC LÁ Triệu chứng Vết bệnh mép lá, mút lan dần vào phiến lan thẳng xuống gân chính; có bắt bắt đầu phiến Vết bệnh lan rộng theo đường gợn sóng thẳng, mô bệnh tái xanh, vàng lục, cuối cháy khô có màu nâu xám 1/3/22 Xanthomonas oryzae pv Oryzae (Xoo) Phân loại Giới: Bacteria Ngành: Proteobaceria Lớp: Gammaproteobaceria Bộ: Xanthomonodales Họ: Xanthomonodaceae Chi: Xanthomonas 1/3/22 10 THIẾT KẾ CẤU TRÚC gRNA Bảng 2: Trình tự gRNA nhắm mục tiêu EBE vùng promoter gen OsSWEET 1/3/22 41 Cấu trúc Cas với gRNA Cas 9: 4100 bp gRNA: 273 bp Việc chèn đoạn gRNA làm gián đoạn vị trí cắt BsaI, nên cắt không cho đoạn 400bp, điều chứng tỏ diện gRNA cấu trúc 1/3/22 42 Hạt TẠO MÔ SẸO Tách vỏ EtOH 70%; NaClO 5.25% Khủ trùng Nước cất Rửa Mt: MS, vitamin, 2,4 - D Nuôi cấy Mô sẹo 1/3/22 43 BIẾN NẠP VÀO PHƠI • Mơ sẹo có khả tạo phôi 28 ngày tuổi chọn lọc ni cấy mơi trường 0,25 M mannitol • Các cấu trúc với gRNA Cas9 xác nhận lần phủ hạt vàng μm • • PP chuyển gen: sung bắn gen.  Đối với gRNA, khoảng 4.000 mô sẹo biến nạp.  1/3/22 44 TÁI SINH – CHỌN LỌC • • Điều kiện nuôi cấy: 28–30 ° C/ 24 giờ, tối, vơ trùng.  • • Sau 15 ngày, chúng lại chuyển sang môi trường chọn lọc mới, 30 ngày • • • Sau 24 giờ, mơ sẹo biến đổi chuyển sang môi trường chọn lọc với 50 mg / L hygromycin.   Các mơ sẹo cịn sống chuyển sang giai đoạn tiền tái sinh sau mơi trường tái sinh.  Các tái sinh chuyển sang môi trường tạo rễ.  Sau rễ phát triển, chúng chuyển vào đất giữ nhà kính với điều kiện kiểm sốt.  Sau 15 ngày, chuyển sang chậu lớn để phát triển đến độ chín sau thu hoạch hạt 1/3/22 45 KIỂM TRA ĐỘT BIẾN CỦA THỂ TÁI SINH Để xác nhận diện Cas9 gRNA cassette, DNA chiết xuất từ tất phát triển thông qua nuôi cấy mô phương pháp CTAB.  Khuếch đại PCR, kiểm tra đột biến T7 Endonuclease assay Tất đoạn promoter OsSWEET chuyển gen giải trình tự Sanger 1/3/22 46 1/3/22 47 XÂM NHIỄM • • • Các dịng chỉnh sửa gen xâm nhiễm dịng Xoo (có gen AvrXa7) phổ biển thơng bằn cách cấy vào Tất dịng cấy Xoo, ni trồng nhà kính 30oC; 85% rH Sau 14 ngày nuôi cấy, tính tốn % nhiễm bệnh bạc lá: %DLA 1/3/22 Neg SB-E1 SB-E2 Wild type SB-E3 SB-E4 IR-24 1.14% 10.12 14.39 48.48 40.06 41.15 88.47 48 HỌ OsSWEET14 CẢM ỨNG BỞI Xoo Để kiểm tra biểu gen OsSWEET 14 sau chỉnh sửa có hay khơng bị cảm ứng Xoo: Tiến hành xâm nhiễm dòng: - SB (ko xâm nhiễm) SB (xâm nhiễm) SB-E2 SB-E3 SB-E4 Mẫu thu hoạch kiểm tra sau 24 ủ, thực lặp lại lần lấy trung bình Kết quả: Chỉ có dịng SB-EB2 có biểu gen OsSWEET14 không đáng kể 1/3/22 49 KIỂU HÌNH Khơng có khác biệt kiểu hình tự nhiên chỉnh sửa gen (về độ dài rễ, hay cành non) 1/3/22 50 BÀN LUẬN 1/3/22 51 - Có nhiều tiếp cận khác để cải thiện tính kháng bệnh bạc lúa, có việc đưa vào nhiều gen kháng bệnh để tăng phổ kháng bệnh - Tuy nhiên với đời giống với với nhiều gen kháng xuất chủng Xoo mới, khắc phục gen kháng - Cách tiếp cận báo: thay tích hợp nhiều gen kháng gây đột biến gen cảm ứng kích thích việc lây nhiễm vi khuẩn 1/3/22 52 Kết thu • • • 1/3/22 Phát triển dòng chỉnh sửa EBE promoter gen OsSWEET14 Mỗi dịng chỉnh sửa có khả kháng lại TALE tương ứng Trong dịng có dịng SB-E1; SB-E2 thành cơng việc hạn chế biểu gen OsSWEET14 (Một nguyên nhân kích thích lây nhiễm.) Tuy nhiên hiệu khơng cao: 9% (so với 51%, sử dụng kỹ thuật TALENS) 53 Đề xuất • Cần thêm nhiều nghiên cứu sử dụng công cụ CRISPR/Cas đối tượng Super Basmati, gen lại họ OsSWEET • Các đột biến gen mẫn cảm phải tiếp tục quan sát thêm để xem xét khác biệt/ thay đổi so với tự nhiên 1/3/22 54 CÁM ƠN CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE 1/3/22 55 ... 43 BIẾN NẠP VÀO PHƠI • Mơ sẹo có khả tạo phôi 28 ngày tuổi chọn lọc nuôi cấy mơi trường 0,25 M mannitol • Các cấu trúc với gRNA Cas9 xác nhận lần phủ hạt vàng μm • • PP chuyển gen: sung bắn gen.