QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG

10 TCN 728 – 2006 BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN 10TCN TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 728-2006 QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG 10 TCN 728 – 2006 Hà Nội - 2006 TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 728 – 2006 QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG ngày (Ban hành kèm theo Quyết định số QĐ/BNN-KHCN tháng năm 2006 Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn) Phạm vi áp dụng Quy trình áp dụng cho cán thú y để chẩn đoán bệnh Tụ huyết trùng (Pasteurellosis) vi khuẩn Pasteurella multocida (P multocida) gây trâu, bò, lợn gia cầm Khái niệm Bệnh tụ huyết trùng (Pasteurellosis) bệnh truyền nhiễm cầu trực khuẩn Gram âm P multocida gây vật nuôi số động vật hoang dã Trên trâu, bò: Bệnh thường gặp thể nhiễm trùng máu, xuất huyết (Haemorragic Septicaemiae-HS) với đặc điểm đặc trưng trâu bò chết nhanh, tỷ lệ nhiễm tỷ lệ chết cao nước châu bệnh P multocida serotyp B:2 (theo hệ thống phân loại Carter Heddleston) gây 10 TCN 728 – 2006 Trên lợn: bệnh P multocida serotyp A, B D gây P multocida tác động chủ yếu tới máy hô hấp Serotyp B gây bệnh trầm trọng chỉ thấy nước Đông nam châu á, Trung quốc ấn độ Bệnh thường ghép với bệnh dịch tả lợn, phó thương hàn hoặc với bệnh viêm phổi truyền nhiễm Trên gia cầm (gà, vịt, ngan, chim cút): Bệnh thường thể thể nhiễm trùng huyết với tỷ lệ nhiễm bệnh tỷ lệ chết cao cũng có nhiều trường hợp mắc bệnh thể mạn tính Máy móc - dụng cụ - môi trường - hoá chất - nguyên liệu 3.1 Máy móc Dụng cụ - Tủ lạnh thường - Tủ ấm 370C - Tủ sấy khô - Lò vi sóng - Nồi hấp ướt (Autoclave) - Cân điện - Kính hiển vi - Buồng cấy - Bộ đồ mổ đại gia súc - Dụng cụ thuỷ tinh: Bình tam giác, ống đong, chai thuỷ tinh, đĩa lồng, ống nghiệm, pipet loại, lam kính - Các dụng cụ khác: nhiệt kế 43 0C, cối chày sứ, kéo, dao cắt, que cấy, đèn cồn, bút viết kính, thấm nước, không thấm nước, khăn hoặc giấy thấm mềm, bút đo pH, khay nhựa 96 lỡ tròn 3.2 Hố chất - Cồn Ethylic - Xylen - Thuốc thử Kovacs (phụ lục 4) - Natri hydroxyt - Natri bicarbonat - Nước cất - Dung dịch KOH - Dầu soi kính - PBS - Glutaraldehyt - Bộ thuốc nhuộm gram (phụ lục 1) - Bộ thuốc nhuộm gemsa (phụ lục 2) 3.3 Môi trường - Thạch máu bản (Blood agar base) - Thạch MacConkey - Nước thịt (Brain heart Infusion) BHI - Môi trường thạch nghiêng Kligler hay thạch TSI - Nước pepton - Thạch urê 3.4 Nguyên liệu - Máu bò, bê, cừu 10 TCN 728 – 2006 - Chuột bạch hoặc tho Huyết tối miễn dịch đặc hiệu chủng vi khuẩn tụ huyết trùng Hồng cầu cừu Phương pháp chẩn đoán Dựa vào đặc điểm bệnh sử, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích xét nghiệm vi khuẩn học phòng thí nghiệm để xác định bệnh Sơ đờ chẩn đốn bệnh (trang sau) Sơ đờ chẩn đoán bệnh tụ hút trùng KiĨm tra lâm sàng Xem bệnh sử Mổ khám Phân lập, giám định hoá Bệnhsinh phẩm Kiểm tra kính hiển vi Týp huyết Kiểm tra độc lực động vật thí nghiệm Tiêm truyền động vật thí nghiệm Kết luËn 10 TCN 728 – 2006 4.1 Đặc điểm dịch tễ - Động vật cảm nhiễm: trâu bò, lợn gia cầm mọi lứa tuổi đều có thể nhiễm bệnh nhiên động vật non mẫn cảm với bệnh động vật già - Bệnh có tính chất lây lan cục địa phương, từng vùng nhất định lây lan chủ yếu qua đường hô hấp - Bệnh thường phát có stress như: sự thay đổi về khí hậu đột ngột, điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng kém hoặc vận chuyển động vật 4.2 Triệu chứng lâm sàng bệnh tích 4.2.1 Trên trâu, bò  Triệu chứng lâm sàng: thường gặp thể cấp tính thể cấp tính vật chết nhanh từ vài giờ đến hai ngày từ xuất những triệu chứng lâm sàng sau: - Vật sốt, khó thở, có ho khan - Vật chảy nước dãi, chảy nước mũi nhiều - Phù vùng cổ có thể lan xuống yếm lên quanh đầu - Có triệu chứng thần kinh: dữ, điên cuồng - Có có tượng bụng chướng to  Bệnh tích - Tổ chức liên kết dưới da xuất huyết lấm tấm - Bắp thịt niêm mạc xuất huyết màu hồng tím - Hạch lâm ba xuất huyết lấm tấm - Khi bệnh khu trú hạch lâm ba: Hạch viêm, thuỷ thũng vùng xung quanh có lan tràn cả vùng - Khi bệnh khu trú ngực: xoang ngực, xoang bao tim chứa nước vàng Phổi viêm - Khi bệnh khu trú bụng xuất viêm phúc mạc, có chứa nước vàng xuất huyết hạch ruột, phủ tạng Trong trường hợp bệnh cấp tính thường bệnh tích điển hình 4.2.2 Trên lợn  Triệu chứng lâm sàng  Thể cấp tính - Lợn ủ rũ, ăn ít hoặc bo ăn, sốt - Con vật thở khó: có tiếng khò khè ướt phế quản, chảy nước mũi đặc, nhờn, đục, có có mủ - Mặt sưng, hầu sưng, thuỷ thũng lan rộng xuống cổ - Trên da nổi những chấm đo hoặc từng đám tím bầm vùng bụng, tai, bẹn - Bệnh tiến triển từ ngày đến vài ngày Tỷ lệ chết có thể đến 80% Nếu vật qua được thì bệnh chuyển sang thể mạn tính  Thể mạn tính - Vật thở khó, ho nhiều - Ỉa chảy - Da đo từng mảng, bong vảy - Niêm mạc miệng đóng màng giả - Bệnh tiến triển từ tuần đến tuần Vật gầy yếu dần rồi chết 10 TCN 728 – 2006  Bệnh tích  Thể cấp tính - Viêm phổi thuỳ: tụ máu từng đám, có nhiều vùng gan hoá thời điểm khác nhau, thẩm tương dịch đo nhạt, cắt thấy có vân - Khí quản, phế quản có bọt khí lẫn máu - Hạch phổi tụ huyết - Ngoại tâm mạc viêm, có nước ngoại xuất có lầy nhầy  Thể mạn tính - Phởi viêm có vùng gan hố, hoại tử màu vàng xám - Màng phổi dày dính vào lồng ngực - Phế quản viêm 4.2.3 Trên gia cầm  Triệu chứng lâm sàng - Thể qúa cấp tính: triệu chứng lâm sàng không rõ, chỉ thấy số lượng lớn gia cầm khoe mạnh bị chết đột ngột - Thể cấp tính: Gia cầm bệnh ủ rũ, bo ăn, chảy dịch nhầy từ miệng, ỉa chảy: phân màu sôcôla Vật khó thở, tím tái vật chết ngạt thở - Thể mãn tính: Viêm cục bộ: Mào, tích sưng, khớp xương sưng to, viêm kết mạc mắt Vật khó thở có ngoẹo cổ Thực tế rất khó có thể đưa được những đặc điểm đặc trưng của thể bệnh cấp tính va mãn tính riêng rẽ vì triệu chứng thường thể hiện xen lẫn, trung gian giữa hai thể bệnh  Bệnh tích - Thể qúa cấp tính: Bệnh tích không rõ ràng - Thể cấp tính: xác chết xung huyết nặng Có nhiều điểm lấm tấm xuất huyết phủ tạng Gan sưng có những điểm hoại tử nho màu trắng nằm rải rác - Thể mãn tính: bệnh tích thường mang tính chất cục Có ổ mủ nằm rải rác thể Phù phổi viêm phổi Viêm khớp cổ chân bàn chân hay khớp xương cánh chứa nhiều dịch màu xám đục hoặc có bã đậu Sưng tích 4.3 Chẩn đoán phòng thí nghiệm 4.3.1.Lấy mẫu - Dụng cụ lấy mẫu: lọ thuỷ tinh, bình tam giác hoặc túi nilon vô trùng - Mẫu bệnh phẩm + Bệnh phẩm lấy sau gia súc, gia cầm chết nhanh tốt phải được lấy vô trùng Bệnh phẩm máu tim, dịch xoang bao tim, phổi động vật chết nghi mắc bệnh Mỗi loại bệnh phẩm cho vào từng lọ hay túi nilon vô trùng riêng biệt đậy kín Nếu vật chết đã lâu, lấy mẫu bệnh phẩm xương ống + Tất cả loại bệnh phẩm phải được đưa vào phòng thí nghiệm không 1giờ Nếu phòng thí nghiệm xa, phải bảo quản điều kiện lạnh từ 0C đến 80C gửi về phòng xét nghiệm chậm nhất 24 gìơ sau lấy mẫu + Bệnh phẩm phải được gửi kèm theo phiếu xin xét nghiệm có ghi rõ triệu chứng, bệnh tích những thông tin về dịch tễ 4.3.2 Kiểm tra trực tiếp vi khuẩn từ bệnh phẩm qua kính hiển vi 4.3.2.1 Phết kính nhuộm tiêu bản 10 TCN 728 – 2006 - Từ tổ chức: cắt miếng nho phủ tạng (gan, lách, phổi) phết lên phiến kính sạch, để khô - Từ máu: lấy giọt máu nho lên phiến kính sạch sau đó dàn mong đều bằng phiến kính khác, để khô Cố định tiêu bản: tiêu bản đã để khô, nho cồn cố định (cồn Methanol) ngập tiêu bản, để khô rồi nhuộm Giemsa hay Gram (xem phụ lục1, 2) 4.3.2.2 Hình thái vi khuẩn Tiêu bản sau được nhuộm, để khô, xem kính hiển vi bằng vật kính dầu 100 X Nhuộm gram: vi khuẩn Pasteurella bắt màu hồng (màu vi khuẩn gram âm), lưỡng cực (hai đầu đậm hơn), có dạng cầu trực khuẩn hoặc đa hình thái: hình bầu dục, hình chấm tròn hoặc hình que.Vi khuẩn đứng rải rác từng hoặc từng đám, không thành chuỗi Vi khuẩn không có nha bào, lông, có giáp mô thành vòng sáng xung quanh vi khuẩn Nhuộm Giemsa: Vi khuẩn bắt màu tím, lưỡng cực 4.3.3 Tiêm truyền động vật thí nghiệm Động vật thí nghiệm chuột bạch, hoặc tho đóng vai trò “màng lọc sinh học” lọc vi khuẩn tạp nhiễm bệnh phẩm Máu, tuỷ xương hoặc phủ tạng đã được nghiền nát, hoà với nước muối sinh lý 0,9% theo tỷ lệ 1/10, tiêm cho chuột bạch (0,1ml đến 0,2ml), tho (1ml đến 2ml) vào dưới da, xoang phúc mạc hoặc tĩnh mạch Nếu P multocida còn sống sẽ làm chết vòng 24 giờ đến 36 giờ Lấy máu tim phủ tạng phết tiêu bản kiểm tra trực tiếp kính hiển vi tiến hành phân lập giám định vi khuẩn 4.3.4 Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Bệnh phẩm được cấy vào môi trường thạch máu, nước thịt, thạch Maconkey Nuôi cấy điều kiện hiếu khí, 37oC sau 24 giờ kiểm tra kết quả nuôi cấy Nếu mẫu bệnh phẩm lấy từ động vật đã chết lâu hoặc lấy không vô trùng thì tạp khuẩn sẽ phát triển lấn át việc phân lạp vi khuẩn Pasteurella sẽ rất khó khăn Tính chất mọc môi trường  Môi trường nước thịt thường hay BHI (Brain heart infusion): Pasteurella mọc môi trường nước thịt đục đều, lắc có vẩn nhẹ (vẩn sương mù) môi trường không có cặn đáy  Môi trường thạch máu - Khuẩn lạc P multocida có dạng: Dạng nhầy (M) kích thước to nhất, trắng xám khuẩn lạc nhầy, ướt Dạng (S) kích thước nho bóng, rìa nhẵn, mặt vồng Dạng xù xì (R) thường dẹt - P multocida không gây dung huyết thạch máu - Khuẩn lạc P multocida có mùi đặc trưng: mùi nước dãi khô  Môi trường thạch MacConkey: Vi khuẩn P multocida không mọc thạch MacConkey 4.3.5 Giám định vi khuẩn 4.3.5.1 Kiểm tra hình thái vi khuẩn từ môi trường nuôi cấy Lấy que cấy chấm vào khuẩn lạc đĩa thạch, hoà vào giọt nước sinh lý phiến kính hoặc lấy vòng que cấy canh trùng đã nuôi cấy vi khuẩn giàn mong phiến kính, để khô, rồi cố định tiêu bản ngọn lửa đèn cồn 10 TCN 728 – 2006 Tiêu bản sau đã được cố định, nhuộm bằng phương pháp Gram Xem tiêu bản vật kính dầu 100X Vi khuẩn bắt màu đo không nhìn rõ lưỡng cực tiêu bản nhuộm từ tổ chức hay máu, có dạng cầu trực khuẩn hoặc đa hình thái: hình bầu dục, hình chấm tròn hoặc hình que Vi khuẩn đứng rải rác, không thành chuỗi 4.3.5.2 Các phản ứng sinh hóa Bảng1: Một số dặc tính sinh hoá đặc trưng của vi khuẩn P multocida Tính chất P.multocida Dung huyết Mọc MacConkey urease Lactose H2 S Catalaza + Oxidaza + Indol + Glucose + Sucrose + Dương tính: + ; âm tính:  Giám định khả lên men đường glucose, lactose, sinh H2S - Dùng thạch nghiêng chế từ Kligler hoặc TSI: Thạch màu đo có phần: phần thạch đứng bên dưới để kiểm tra khả lên men đường glucose, sinh hơi, sinh H 2S, phần thạch nghiêng bên để kiểm tra khả lên men đường lactose - Lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy thẳng (chính giữa phần thạch đứng) sâu xuống đáy ống nghiệm, rút dần que lên cấy tiếp bề mặt nghiêng, nuôi cấy 37 0C điều kiện hiếu khí - Kiểm tra sau 24 giờ nuôi cấy: vi khuẩn không lên men đường Lactose nên mặt nghiêng có màu hồng, lên men đường Glucose làm môi trường phần thạch đứng (phần chân ống) có vàng Vi khuẩn Pasteurella không sinh H2S nên đáy ống nghiệm không có màu đen - Cấy khuẩn lạc nghi ngờ thẳng (chính giữa ống) sâu xuống đáy ống nghiệm Sau cấy xong để tủ ấm 370C  Giám định khả sinh Indol phân giải Ure - Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào môi trường nước peptone, nuôi cấy 370C - Kiểm tra sau 24 giờ nuôi cấy: Vi khuẩn làm sinh indol nên nho dung dịch Kowac lên mặt môi trường, lắc nhẹ, vòng màu đo tại nơi tiếp giáp giữa thuốc thử môi trường (dương tính) - Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào môi trường thạch ure: Vi khuẩn không phân giải urê nên môi trường vẫn giữ nguyên màu  Phản ứng Oxidaza Catalaza 10 TCN 728 – 2006 - Phản ứng Oxidaza: Tiến hành giấy có tẩm dung dịch 1% Tetrammethyl-P phenylene diamin hydrochloride Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch chà sát lên mặt giấy đã thấm thuốc thử Phản ứng dương tính xuất màu đen tím sau 30 giây - Phản ứng Catalaza: Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch đặt lên điểm phiến kính sạch Nho giọt dung dịch H 2O2 3% Phản ứng dương tính thấy có tượng sủi bọt 4.4 Thử độc lực động vật thí nghiệm Lấy khuẩn lạc sau đã được giám định hình thái, tính chất mọc mơi trường sinh hố cấy vào môi trường nước thịt, nuôi cấy tĩnh (không lắc) 37 C sau 24 giờ lấy 0,2 ml canh trùng tiêm cho hai chuột theo dõi bảy ngày: - Nếu cả hai chuột chết: vi khuẩn tụ huyết trùng có độc lực cao - Nếu chuột chết: vi khuẩn tụ huyết trùng có độc lực yếu - Nếu hai chuột chết không chết: vi khuẩn tụ huyết trùng không có độc lực 4.5 Định typ huyết thanh: có thể định typ huyết vi khuẩn tụ huyết trùng bằng phản ứng IHA, phòng thí nghiệm có đủ điều kiện để tiến hành phản ứng (xem phụ lục 3) Kết luận Dựa vào Bệnh sử 2.Triệu chứng lâm sàng Bệnh tích Kết quả chẩn đoán phòng thí nghiệm - Phân lập, giám định đặc tính sinh hoá - Kiểm tra độc lực động vật thí nghiệm KT BỘ TRƯỞNG THỨ TRƯỞNG Bùi Bá Bổng 10 TCN 728 – 2006 Phụ lục Phụ lục 1: Nhuộm gram Thuốc nhuộm a Dung dịch kết tinh tím Kết tinh tím 2,5g Nước cất 1000 ml b Dung dịch fuscin mẹ Fucsin kiềm 1g Cồn 96 C 10 ml Axit phenic kết tinh 5g Nước cất 100ml Pha loãng dung dịch mẹ theo tỉ lệ 1/10 với nước cất nhuộm c Dung dịch lugol Iodua kali 1g Iodua tinh thể 0,5g Nước cất 150 ml d Cồn axeton Cồn nguyên chất phần Axeton phần Cách nhuộm - Nho dung dịch tím lên tiêu bản: phút đến phút - Rửa nước nhanh, vẩy khô nước - Nho dung dịch lugol: để phút - Rửa nước nhanh, vẩy khô - Nho cồn Axeton - Rửa nước thật nhanh - Nho dung dịch fucsin loãng: để phút - Rửa nước 10 TCN 728 – 2006 - Thấm khô Sấy khô Xem kính bằng vật kính dầu - Vi khuẩn gram dương bắt màu tím - Vi khuẩn gram âm bắt màu đo Phụ lục 2: Nhuộm Giemsa Dùng để nhuộm tiêu bản máu Thuốc nhuộm Giemsa bột Glyxerin Cồn nguyên chất Cách nhuộm 1g 66ml 66ml - Tiêu bản máu làm xong cố định bằng cồn nguyên chất 10 phút rồi rửa bằng nước - Nho dung dịch Giemsa đã pha loãng (1/10, 1/20 ) cho ngập tiêu bản Để 20 phút đến cất 30 Phút Rửa nước nhanh Sấy khô (Không được thấm) Xem kính - Tế bào bạch cầu: bắt màu đo - Tế bào đa nhân: bắt màu đo tía - Bào tương: bắt màu xanh da trời hoặc hồng - Vi khuẩn: bắt màu xanh - Hạt nhiễm sắc: bắt màu đo Phụ lục 3: Định type kháng nguyên vỏ (capsular) bằng phản ứng IHA Chuẩn bị nguyên liệu: - Huyết tối miễn dịch chủng Tụ huyết trùng - Chế kháng nguyên: Giống vi khuẩn P multocida cần định type được nuôi môi trường thạch máu hoặc thạch Dextrose Starch Agar Sau 16 giờ đến 18 giờ nuôi cấy, rửa mặt thạch bằng dung dịch phosphat buffer solution (PBS) Huyễn dịch thu được được đun cách 10 10 TCN 728 – 2006 thuỷ 1000C vòng giờ, sau đó ly tâm 12000 vòng/phút để loại cặn Dịch nổi phía chính kháng ngun giáp mơ hồ tan - Cố định hồng cầu cừu (HCC): + Máu cừu được lấy cho vào bình tam giác có chứa Alsever với tỷ lệ 1:1 Tiến hành rửa hồng cầu ba lần bằng PBS với tỷ lệ PBS hồng cầu 1/10, ly tâm 2500 vòng/phút 10 phút Sau lần rửa cuối cùng, hoà kết tủa với PBS để tạo dung dịch 10% bảo quản 0C hộp có chứa đá vụn + Pha dung dịch glutaraldehyt 1% với PBS Hỗn dịch 10% hồng cầu cừu được trộn từ từ với thể tích tương đương dung dịch glutaraldehyt 1% hỗn dịch ủ 0C 30 phút với que khuấy tốc độ chậm + Ly tâm hỗn dịch với tốc độ 2000 vòng / phút 10 phút nhiệt độ phòng + Rửa hồng cầu bằng PBS lần trên, lần cuối lấy cặn hờng cầu hồ vào dung dịch PBS để tạo thành dung dịch hồng cầu 10% Hồng cầu đã cố định với glutaraldehyt (G-HCC) được bảo quản 4OC - Hấp phụ kháng nguyên lên hồng cầu + Trộn dung dịch 10% (G-HCC) với kháng nguyên chiết tách ủ hỗn dịch 37 OC vòng 2giờ + Tách hồng cầu bằng ly tâm 1500 v/p phút rửa lần với 10ml PBS mỗi lần Dùng dung dịch PBS có chứa 0,25% albumin huyết bò (BSA-PBS) thêm vào hồng cầu vừa li tâm để thu được dung dịch 0,5% hồng cầu Phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp Tiến hành phản ứng đĩa nhựa microtiter 96 giếng đáy chữ U ( gồm hàng x 12 cột) theo sơ đồ (trang sau) Thứ tự lỗ TN ĐC - Dung dịch PBS-0,25% BSA (l) Huyết tối miễn dịch đặc hiệu (l) Hồng cầu – kháng nguyên (l) Dung dịch PBS-0,25% BSA (l) Hồng cầu – kháng nguyên (l) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 10 11 12 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 11 10 TCN 728 – 2006 Dung dịch PBS-0,25% 50 50 ĐC BSA (l) Huyết tối miễn 50 + dịch đặc hiệu typ (l) Hồng cầu – Kháng 50 50 nguyên (của chủng THT chuẩn) (l) Chú thích ĐC + : Đối chứng dương ĐC - : Đối chứng âm TN : Thí nghiệm Các bước làm phản ứng: 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 - Pha loãng huyết dung dịch đệm PBS - 0,25% BSA theo bậc hai bằng cách dùng Micropipet cho vào mỗi giếng 50 l dung dịch PBS - 0,25% BSA, sau đó cho vào dãy giếng đầu phía bên trái bản nhựa mỗi giếng 50 l huyết tối miễn dịch chủng vi khuẩn Tụ huyết trùng đã biết (A, B, D, E) trộn đều ta được huyết pha loãng hai lần, tiếp đó hút từ dãy giếng đầu 50 l (huyết pha loãng bậc 2) chuyển sang dãy tiếp theo, cứ vậy dãy giếng cuối cùng hút từ dãy cuối bo 50 l - Dùng Micropipet hút vào mỗi giếng thí nghiệm 50 l hồng cầu gắn kháng nguyên - Lắc khay nhựa máy lắc khoảng 40 giây để trộn đều thành phần, để yên nhiệt độ phòng giờ rồi đọc kết quả lần một, sau đó để qua đêm đọc kết quả lần hai - Đánh giá phản ứng Dương tính: hồng cầu ngưng kết hình hoa hồng, mức độ ngưng kết được đánh sau: ++++ : hồng cầu ngưng kết rất đều, rìa xung quanh cuộn khía hoa hồng : điểm +++ : hồng cầu ngưng kết đều : điểm ++ : hồng cầu ngưng kết tương đối đều : điểm + : hồng cầu ngưng kết quanh đáy lỗ : điểm Phụ lục 4: Phản ứng sinh indol - Thuốc thử Kovacs a- Paradimetylaminobenzaldehyte 5g b- Amyl alcohol (cồn amyl) 75 ml 12 10 TCN 728 – 2006 c- HCL đặc 25 ml - Cách pha: cho Paradimetylaminobenzaldehyte vào cồn để vào nước ấm 50 0C đến 600C, lắc đều cho tan hoàn toàn đợi nguội, cho từ từ HCl đặc vừa cho vừa lắc Bảo quản thuốc thử nhiệt độ lạnh khoảng 40C - Tiến hành đánh giá phản ứng: Nho 0,2 ml đến 0,3 ml thuốc thử Kovacs vào môi trường đã nuôi cấy vi khuẩn, bề mặt môi trường có vòng màu đo phản ứng dương tính Không biến màu phản ứng âm tính 13 .. .10 TCN 728 – 2006 Hà Nội - 2006 TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 728 – 2006 QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG ngày (Ban hành... Bá Bổng 10 TCN 728 – 2006 Phụ lục Phụ lục 1: Nhuộm gram Thuốc nhuộm a Dung dịch kết tinh tím Kết tinh tím 2,5g Nước cất 100 0 ml b Dung dịch fuscin mẹ Fucsin kiềm 1g Cồn 96 C 10 ml Axit... bằng dung dịch phosphat buffer solution (PBS) Huyễn dịch thu được được đun cách 10 10 TCN 728 – 2006 thuỷ 100 0C vòng giờ, sau đó ly tâm 12000 vòng/phút để loại cặn Dịch nởi phía chính