PHƯƠNG PHÁP LẤY VÀ BẢO QUẢN MẪU NƯỚC

BÀI 01 PHƯƠNG PHÁP LẤY VÀ BẢO QUẢN MẪU NƯỚC Mục tiêu học tập: Sau học xong này, học viên có khả : Trình bày kỷ thuật lấy mẫu nước để phân tích vi sinh vật Trình bày kỷ thuật bảo quản mẫu nước thời gian vận chuyển phòng xét nghiệm để phân tích Thực quy trình lấy mẫu theo kỷ thuật 1.Giới thiệu chung : Lấy mẫu trình lấy phần coi đại diện vùng nước, nhằm kiểm tra đặc tính khác định nước 2.Kỷ thuật: 2.1.Kỷ Thuật lấy mẫu : 2.1.1.Dụng cụ lấy mẫu : - Chai lấy mẫu : Chai thủy tinh, nút mài rử sach tráng nước cất sấy vô khuẩn nhiệt độ khô 160oC nhiệt độ ướt 121oC 30 phút 1giờ, nên đựng hộp nhơm Kích thước chai tùy theo u cầu phân tích, khơng 200ml cho muchj đích kiểm tra chất lượng vệ sinh mặt vi khuẩn học, cần phân tích vi khuẩn gây bệnh, trường hợp dịch xảy chẳng hạn, cần lấy 1000ml - Bơng cồn, lửa, kẹp - Quang lấy mẫu dụng cụ thiết bị lấy mẫu độ sâu khác 2.1.2.Thao tác lấy mẫu : - Trước lấy mẫu cần có nhãn ghi rõ điạ điểm, thời gian , phương pháp lấy mẫu người lấy mẫu Mẫu khơng phân tích nế khơng rõ nguồn gốc mẫu -Tùy thuộc nguồn cung cấp nước , thao tác lấy mẫu có khác : + Có vịi nước : nước máy, giếng lắp bơm, … cần mở nước chảy hết cở vịng 2-3 phút Đóng vịi khử khuẩn kỷ vịi nước nhệt độ bơng cồn Mở lại cho chảy mạnh 1-2 phút điều chỉnh chảy vừa đủ để lấy mẫu vào chai mà không gây văn bắn xung quanh Mở giấy bọc đầu chai, nút chai cho không gây ô nhiễm mặt nút giấy để bao trở lại sau thực thao tác lấy mẫu - Khử khuẩn miệng chai hứng nước để trống chai khoảng 2-3 cm từ mặt nút chai trở xuống để tránh nhiễm trùng từ miệng nút chai để phân tích mẫu dễ dàng Sau chai điền đủ mẫu nước khử trùng miệng chai, nút chai, đóng nút nhanh bao miệng lại cẩn thận - Khơng có vịi nước: giếng khơi, ao, hồ, nơi tích chứa khác Dùng quang chai tốt sau lần lấy mẫu, cần khử trùng lại quang chai nhiệt độ cồn - Nếu khơng có quang chai, phải rửa tay xà phịng sẽ, lau cồn khử trùng tay Sau cầm gần đáy chai, dìm chai xuống nước, nhớ đặt chai nằm ngang chúc đầu ( tránh lấy nước mặt, xuống độ sâu khoảng 15-20 cm để ngang chai tạo dòng nước tự chảyvào miệng chai Các thao tác thực mô tả phân - Trường hợp không lấy trực tiếp, phải dùng xô, gàu múc đổ bỏ lần, lần thứ rót nhẹ vào chai, cho tay khơng làm nhiễm bẩn nước - Tại nơi tạo dòng chảy, sơng, suối cầm chai trên, dìm chai xuống nước, miệng chúc xi theo dịng xuống độ sâu cần thiết 15-20cm xoay nhẹ nhanh miệng chai hướng vào dịng chảy Các thao tác khác mơ tả Chú ý: Nếu nước khử trùng hóa chất chứa Clo cần trung hịa Clo dư sodium thiosulfate (chai 500-1000ml thêm 10ml Na2S2O3 0,1N) 2.1.3 Địa điểm, số lượng thời gian lấy mẫu: Nói chung chọn địa điểm, số lượng mẫu thời gian lấy mẫu cho đánh giá chất lượng vi khuẩn học tòan nguồn nước cung cấp đến người sử dụng - Nếu nước máy nhà máy cung cấp nước thành phố cần theo dõi chất lượng nước trước, sau xử lý, nhà máy khai thác nước từ nguồn nước bề mặt Trong hệ thống cung cấp nước thường theo dõi đường ống trực tiếp, đầu nguồn, nguồn cuối nguồn Không lấy mẫu nơi đường ống bị rò rỉ Thường lấy theo mùa năm, lấy mẫu cho mẫu đại diện, đủ để đánh giá chất lượng tòan hệ thống cung cấp nước - Nước sông suối: Thường lấy hai bên bờ dòng nơi đại diện cho nguồn cung cấp nước tới người dùng Chú ý điểm xả khu công nghiệp, đô thị không lấy gần bờ gần đáy, làm nước bẩn không đại diện nguồn nước lấy Lấy theo mùa khác năm - Nước ao, hồ, nước tích chứa thường lấy xung quanh trung tâm, điểm cung cấp nước tới người dùng 2.2 Bảo quản mẫu : Các mẫu sau lấy xong phải ghi lý lịch đầy đủ vận chuyển nhanh phòng xét nghiệm sớm tốt, nhiệt độ thay đổivà thời gian lưu mẫu ảnh hưởng tới số lượng vi trùng Nếu mẫu không phân tích vịng từ lấy mẫu phải dùng dụng cụ bảo quản lạnh phích đá, hịm lạnh để vận chuyển mẫu phịng thí nghiệm Duy trì nhiệt độ 10oC vịng 6giờ vận chuyển đến phịng thí nghiệm.Tốt phân tích mẫu vịng 24 BÀI 02 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ COLIFORM – ECOLI TRONG NƯỚC KỸ THUẬT MPN I PHẠM VI ÁP DỤNG Quy trình hướng dẫn định lượng Coliform , E.coli nước II TÀI LIỆU ÁP DỤNG - Tiêu chuẩn áp dụng: theo QCVN số 02/2009/QĐ-BYT , - QCVN 01/2009/BYT - Tiêu chuẩn ISO 9308-2 : 2000 III LẤY MẪU VÀ BẢO QUẢN MẪU Lấy mẫu dụng cụ vô trùng, sau lấy mẫu phải ghi lý lịch mẫu đầy đủ chuyển phòng xét nghiệm sớm tốt.Mẫu bảo quản thùng đá có nhiệt độ 1-5oC vòng 24 h sau lấy IV CẢNH BÁO VỀ AN TOÀN SỨC KHỎE 4.1.Thao tác với vi khuẩn gây bệnh cần thực tủ an toàn sinh học 4.2 Dùng găng tay, trang tiếp xúc với dịch vi khuẩn 4.3 Các thiết bị phịng thí nghiệm, bàn ghế cần tẩy uế lần tuần 4.4 Những cố tai nạn cần thơng báo với quản lý phịng thí nghiệm 4.5 Xem danh mục hóa chất , mơi trường ni cấy có chứa chất độc hại V KIỂM SỐT CHẤT LƯỢNG 5.1 Kiểm tra ghi nhiệt độ tủ nuôi cấy lần/ngày, nhiệt kế phải kiểm tra tính xác lần năm 5.2 Kiểm tra tính vơ khuẩn mơi trường ni cấy cách ủ môi trường 37oC, loại bỏ môi trường nhiễm khuẩn VI NGUYÊN TẮC Tiêu chuẩn để xác định Coliform Escherichia coli dựa vào sinh từ việc sử dụng glucose lên men lactose sinh acid 36 oC ± 1oC thời gian 24h đến 48h (Coliforms) 44 oC 44,5oC 2448h (Escherichia coli) Coliform chịu nhiệt * Coliforms tổng cộng trực khuẩn đường ruột, gram (-), hiếu khí kị khí tùy tiện, khơng có nha bào, có khả lên men đường lactose sinh hơi, sinh acid nhiệt độ 36oC ± 1oC 24-48h Những vi khuẩn tồn ruột người, súc vật ngoại cảnh gồm loại sau: - Escherichia coli - Klebsiela - Enterobacter - Citrobacter * Coliform chịu nhiệt: vi khuẩn giống coliform tổng cộng, có đặc tính lên men nhiệt độ 44oC ± 0,5oC 24-48h * Escherichia coli coliforms có nguồn gốc từ phân người động vật máu nóng, phát triển mơi trường lactose có muối mật thị màu nhiệt độ 44oC ± 0,5oC/24-48h Có khả thủy phân tryptophan môi trường sinh indol VII MÔI TRƯỜNG, THUỐC THỬ - Lauryl Sulfat Tryptose broth (LST broth) - Brilliant Green Bile Broth (BGB broth) - EC broth - Tryptone broth - Thuốc thử Kovac’s - Nước pepton - Thạch dinh dưỡng - Thuốc thử oxidase VIII.TIẾN HÀNH THỬ 8.1 Chuẩn bị môi trường thuốc thử (có phụ lục kèm theo) 8.2 Chuẩn bị mẫu dung dịch mẫu thử 8.2.1 Chuẩn bị mẫu Mẫu nước chưa xét nghiệm phải bảo quản 20 oC không ngày 8.2.2 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10-1 - Hút xác 1ml dung dịch mẫu thử cho sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước Peptone - Trộn thu dung dịch mẫu thử 10-1 8.2.3 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử mẫu 10-2, 10-3, 10-4,… - Hút xác ml dung dịch mẫu thử 10 -1 cho sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước Peptone 0,1% Trộn Thu dung dịch 10-2 - Tiếp tục làm tương tự vậy, ta thu dung dịch mẫu thử tương ứng 10-2, 10-3, 10-4,… A - Xác định tổng số Coliforms Các bước tiến hành: Bước 1: - Lấy ba ống môi trường LST Lactose broth nồng độ kép Dùng pipet vô trùng chuyển 10ml mẫu thử vào ống - Sau đó, lấy ba ống môi trường LST Lactose broth nồng độ đơn Dùng pipet vô trùng cho dịch pha lỗng - Để ống mơi trường LST Lactose broth tủ ấm nhiệt độ 36oC ± 1oC 24h ± 2h, khơng thấy sinh khí bị đục để thêm tủ ấm đến 48h ± 2h quan sát tiếp tượng (sinh khí đục) Bước 2: Phép thử khẳng định - Dùng vịng que cấy chuyển từ mơi trường LST Lactose broth có sinh đục vào ống môi trường BGBL.Đặt vào tủ ấm điểm nhiệt độ 36oC ± 1oC , 44o C 24h ± 2h khơng sinh khí giai đoạn ủ ấm đến 48h ± 2h Thử nghiệm oxidase: - Cấy chuyển từ BGBL sang thạch dinh dưỡng ủ 36oC ± 1oC 24h ± 2h - Nhỏ giọt thuốc thử oxidase lên miếng giấy lọc đĩa Petri - Bằng que cấy thủy tinh, tăm bơng que cấy có dây bạch kim (khơng phải Ni-Crom), dàn mỏng vi khuẩn từ thạch dinh dưỡng lên giấy lọc chuẩn bị sẵn - Quan sát thấy xuất màu xanh tím vịng 10 giây phản ứng dương tính Bước 3: Diễn giải kết 10 - Nếu mẫu giữ đông phải làm tan băng trước xét nghiệm 6.2.2 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10-1 - Cân xác 25g (hoặc 10g) mẫu thực phẩm chẩn bị hút xác 25ml (hoặc 10ml) mẫu thực phẩm lỏng cho vào chai chứa 225ml (hoặc 90 ml) nước đệm phosphat - Lắc 2-3 phút, thu dung dịch mẫu thử 10-1 6.2.3 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10-2, 10-3, 10-4,… - Hút xác ml dung dịch mẫu thử 10 -1 cho sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước đệm phosphate Trộn đều, thu dung dịch 10-2 - Tiếp tục làm vậy, ta thu dung dịch mẫu thử tương ứng 10 , 10-4 6.3 Các bước nuôi cấy Sau thực đồng mẫu pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp (đảm bảo tất ống độ pha loãng cuối cho kết âm tính), quy trình định lượng E.coli giả định tiến hành theo bước sau: Dùng pipet vô trùng chuyển vào ống nghiệm chứa canh thang Laury sufat nồng độ kép, ống 10ml huyền phù ban đầu (hoặc khác tùy theo nhận định) 16 Tiếp theo dùng pipet vô trùng chuyển vào ống nghiệm chứa canh thang Laury sufat nồng độ đơn, ống 1ml huyền phù ban đầu (hoặc khác tùy theo nhận định) Thực tương tự bước mẫu pha loãng Ủ tất ống nghiệm 37oC 24 Sau 24 giờ, ghi nhận tất ống có sinh Dùng que cấy vịng cấy chuyển dịch mẫu từ ống nghiệm sang ống nghiệm chứa canh thang EC tương ứng ủ 44 oC 24-48 Ghi nhận số ống sinh sau 24-48 tiếp tục dùng que cấy vòng cấy chuyển vòng canh khuẩn từ ống sinh vào ống nghiệm chứa nước pepton, ủ 44oC/ 48 để kiểm tra sinh indol Sau 48 giờ, thêm 0.5ml thuốc thử Kovacs vào ống chứa nước pepton, trộn kỹ kiểm tra sau phút Đọc kết quả: - Các ống cho kết dương tính ống có xuất vịng trịn màu đỏ bề mặt ống môi trường - Dựa vào ống nghiệm có E.coli dương tính độ pha lỗng mẫu, dùng bảng MPN thích hợp (bảng 3×3 tức ống) để tính mật độ vi sinh vật mẫu (nhân với hệ số pha loãng có) 17 VII QUẢN LÝ CHẤT THẢI: Tất môi trường nuôi cấy, sản phẩm chứa đựng vi khuẩn phải khử khuẩn nồi hấp áp suất trước loại bỏ 18 BÀI 04 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT A.MÔI TRƯỜNG ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM, E.COLI 1.Thuốc thử Kovac’s Thành phần: - 4-dimethylaminobenzaldehyde 5g - Amyl alcohol 75ml - Hydrochloric acid 25ml 2.Chất thị Methyl red: Thành phần: - Methyl red 0.1g - Ethanol 90% 300ml - Nước cất vừa đủ 500ml 3.Thuốc thử VP: Thành phần: Dung dịch 1: - -Naphtol 5g - Alcohol 100ml 19 Dung dịch 2: - KOH 40g - Nước cất vừa đủ 100ml 4.Đệm phosphate Dung dịch mẹ: - KH2PO4 - Nước cất vđ 34g 1000ml Pha chế: Chỉnh pH=7.2 NaOH Cho nước cất thể tích vừa đủ 1000ml Hấp tiệt trùng 121oC/15 phút Bảo quản lạnh Pha loãng trước sử dụng: Hút 1.25ml dung dịch mẹ vào chai thủy tinh lít Cho vào vừa đủ 1000ml nước cất Đổ vào chai 90ml 225ml ống nghiệm nắp vặn, ống ml Hấp tiệt trùng 121 oC/15 phút 5- Lauryl Tryptose (LST) broth Thành phần g/l: - Tryptose or trypticase 20g - Lactose 5g - K2HPO4 2.75g 20 - KH2PO4 2.75g - NaCl 5g - Sodium lauryl sulphate 0.1g - Nước cất 1000ml Pha chế: Cân 35,5 g mơi trường tổng hợp Hồ tan môi trường 1000ml nước cất cách đun nóng Phân phối 10ml mơi trường vào ống nghiệm có nắp 18x150mm (có ống Durham) Hấp tiệt trùng 121oC/15 phút 6-Brilliant Green Lactose Bile Broth Thành phần g/l: - Peptone 10g - Lactose 10g - Ox bile 20g - Briliant green 0.0133g - Nước cất 1000ml Pha chế: Cân 40g mơi trường tổng hợp Hồ tan mơi trường 1000ml nước cất cách đun nóng cho tan Phân phối 5ml mơi trường vào ống nghiệm có nắp 16x150mm (có ống Durham) Hấp tiệt trùng 121oC/15 phút 7.EC broth 21 Thành phần g/l: - Tryptose or trypticase 20g - Lactose 5g - Bile salt 1.5g - K2HPO4 4g - KH2PO4 1.5g - NaCl 5g - Nước cất 1000ml Pha chế: Cân 37g mơi trường tổng hợp Hồ tan mơi trường 1000ml nước cất cách đun nóng cho tan Phân phối 5ml môi trường vào ống nghiệm có nắp 18x150mm (có ống Durham) Hấp tiệt trùng 121 oC/15 phút 8.Levine’Eosin-Methylene Blue (L-EMB) agar: Thành phần g/l: - Peptone 10g - Lactose 5g - Saccharose 5g - K2HPO4 - Eosin Y 2g 0.065g 22 - Yellowish 0,4g - Methylene blue 0.07g - Agar 15g - Nước cất 1000ml Pha chế: Cân 36g mơi trường tổng hợp Hồ tan môi trường 1000ml nước cất cách đun sôi cho tan thạch Hấp tiệt trùng 121oC/15 phút Để nguội 45oC , đổ vào đĩa petri 15-18ml, để nguội cho đông tự nhiên, bảo quản lạnh dùng hai tuần 9.Tryptone broth: Thành phần: - Tryptose or trypticase 20g - Nước cất 1000ml Pha chế: Hồ tan mơi trường phân phối 5ml vào ống nghiệm có nắp vặn cở 16x125 16x150mm Hấp tiệt trùng 121oC/15 phút 10.MR-VP broth: Thành phần: - Peptone 5g - Glucose 5g - KH2PO4 5g 23 - Nước cất 1000ml Pha chế: Cân 17g mơi trường tổng hợp Hồ tan mơi trường nước cất nóng cho tan phân phối 4ml vào ống nghiệm có nắp vặn cở 13x100mm Hấp tiệt trùng 121oC/15 phút 11.Simmon Citrate agar: Thành phần: - Sodium citrate 2g - NaCl 5g - K2HPO4 1g - NH4H2PO4 1g - MgSO4 0.2g - Bromthymol blue 0.08g - Agar 15g - Nước cất 1000ml Pha chế: Cân 22,5g mơi trường tổng hợp Đun nóng nhẹ có lắc Để sơi 1-2 phút cho thạch tan Đổ vào ống nghiệm có nắp khoảng 1/3 Hấp tiệt trùng 121oC/15 phút Nghiêng thạch cịn nóng, để đơng tự nhiên nhiệt độ phịng 24 B MƠI TRƯỜNG XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ Thạch dinh dưỡng: Thành phần: - Beef extract 3g - Peptone 5g - Agar 15g - Nước cất vđ 1000ml PH=7 Pha chế: Cân 23g môi trường tổng hợp khô theo công thức Cho vào 1000ml nước cất đun nóng khuấy thạch tan hồn toàn, để nguội chỉnh pH=70,2 Đổ vào chai thủy tinh có nắp vặn 2/3 chai Hấp ướt 121oC/15 phút Lấy để nguội 45oC-50oC đổ vào hộp cấy mẫu Nếu khơng dùng bảo quản lạnh 2-8 oC hai tuần Trước dùng đun cách thuỷ làm tan thạch lị vi sóng, để nguội 45-50oC 2- Nước peptone Thành phần: 25 - Peptone 1g - NaCl 8,5g - Nước cất vđ 1000ml Pha chế: cân xác thành phần theo cơng thức Cho vào vừa đủ 1000ml nước cất, đun khuấy cho tan Đổ vào chai 90ml 225ml ống nghiệm nắp vặn, ống ml Hấp tiệt trùng 121oC/15 phút 3- Đệm phosphate: Thành phần: Dung dịch mẹ: - KH2PO4 - Nước cất vđ 34g 1000ml Pha chế: Chỉnh pH=7,2 NaOH Cho nước cất thể tích vừa đủ 1000ml Hấp tiệt trùng 121oC/15 phút Bảo quản lạnh Pha loãng trước sử dụng: Hút 1,25ml dung dịch mẹ vào chai thủy tinh lít Cho vào vừa đủ 1000ml nước cất Đổ vào chai 90ml 225ml ống nghiệm nắp vặn, ống ml Hấp tiệt trùng 121 oC/15 phút PHỤ LỤC : CÁC BÁO CÁO THỬ NGHIỆM I Báo cáo thử nghiệm vi sinh nước : 26 Chỉ tiêu : Coliform, E.coli : KHOA XÉT NGHIỆM BÁO CÁO THỬ NGHIỆM SỐ : Labo Vi Sinh Trang : Tên Mã số mẫu : Tên tiêu 10 Phương pháp Lượng mẫu : Ngày nhận mẫu : Total coliform ISO 9308-2:2000( E) 4.Ngày thực : Ngày hoàn tất: E.coli ISO 9308-2:2000( E) Người thực 7.Người kiểm tra: Trưởng Labo Ghi GHI CHÉP KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM VI SINH NƯỚC Total coliform, E.coli MÔI TRƯỜNG NỒNG ĐỘ KẾT QUẢ MPN/100ml Total Coliform/ 100ml BCP ( 37oC/24 h) ( LST) BGBL( 37oC/24 h) Oxidase EC broth( 44oC/24 h) Indol E.coli /100ml Chỉ tiêu Tổng số vi khuẩn hiếu khí : KHOA XÉT NGHIỆM BÁO CÁO THỬ NGHIỆM 27 SỐ : Labo Vi Sinh Trang : Tên Mã số mẫu : Tên tiêu Lượng mẫu : Ngày nhận mẫu : TS VKHK 4.Ngày thực : Ngày hoàn tất: Người thực 7.Người kiểm tra: Trưởng Labo 10 Phương pháp Ghi GHI CHÉP KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM VI SINH NƯỚC Tổng số vi khuẩn hiếu khí Mơi trường Nồng độ pha loãng Số khuẩn lạc Đĩa Số khuẩn lạc Đĩa Kết KL/g ml Nutrient agar (35oC/24-48h) II Báo cáo thử nghiệm vi sinh thực phẩm KHOA XÉT NGHIỆM BÁO CÁO THỬ NGHIỆM 28 SỐ :HDCV Labo Vi Sinh Tên Lượng mẫu : 4.Ngày thực : Người thực : Trang : Mã số mẫu : Ngày nhận mẫu : Ngày hoàn tất: 7.Người kiểm tra: Tên tiêu Total coliform E.coli Tổng số VKHK 10 Phương pháp Trưởng labo : GHI CHÉP KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM Total coliform, E.coli MÔI TRƯỜNG LST( 35oC/48 h ±2h) BGBL( 35oC/48 h±2h) EC broth( 45,5oC/48 h±2h) EMB (35oC / 24h) Indol(35oC / 24h) MR(35oC / 48h) VP(35oC / 24h-48h) Simon citrate (35oC / 24h-48h) NỒNG ĐỘ KẾT QUẢ MPN/g Total Coliform/ g E.coli /g 29 Tổng số vi khuẩn hiếu khí Mơi trường Nồng độ pha loãng Số khuẩn lạc Đĩa Số khuẩn lạc Đĩa Kết KL/g ml PCA (35 C/24-48h) o 30