TRƢỜ NG ĐAI
KHOA HOC
MỞ ĐẦU
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
3. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài
4. Địa điểm thực hiện đề tài
5. Đóng góp mới của đề tài
6. Ứng dụng thực tiễn của đề tài
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.2. Tình hình nhiễm HIV-1
1.1.3. Sinh bệnh học của nhiễm HIV-1
1.1.4. Phƣơng pháp điều trị HIV/AIDS
1.2. PROTEASE HIV-1 VÀ ỨNG DỤNG
1.2.1. Cấu tạo protease HIV-1
Hình 1.5. Mô hình cấu trúc của protease HIV-1 (Tie, 2006)
Hình 1.6. Cấu trúc kẹp trong trung tâm hoạt động của protease HIV-1
1.2.2. Hoạt tính phân cắt cơ chất của protease HIV-1
Bảng 1.1. Trình tự các vị trí cắt của protease HIV-1 trên protein gag và gag-pol
1.2.3. Các phƣơng pháp xác định hoat độ protease HIV-1
1.2.4. Chức năng sinh học của protease HIV-1
1.2.5. Nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch protease HIV-1
1.2.6. Các đôt biến kháng thuốc ức chế protease HIV-1
Các phương pháp xét nghiệm kháng thuốc
Cơ chế kháng thuốc
Sự lây truyền các chủng HIV-1 kháng thuốc
Các đột biến kháng thuốc ở HIV-1
Bảng 1.2. Các đột biến trong gen mã hóa protease HIV-1 liên quan đến
1.2.7. Ứng dụng các thành tựu nghiên cứu protease HIV-1
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.2. Các hoá chất, nguyên liệu khác
2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2. Tách chiết và định lƣợng DNA plasmid
2.3.3. Định lƣợng protein
2.3.4. Tổng hơp
2.3.5. Nhân bản đoan
2.3.6. Nhân dòng trực tiếp đoan gen mã hóa protease HIV-1 vào vector
2.3.7. Giải trình tự các đoạn gen mã hóa protease HIV-1
2.3.8. Thiết kế vector biểu hiên
Cắt vector nhân dòng mang đoạn gen mã hóa protease HIV-1 và vector biểu hiện bằng enzyme giới hạn
Tinh sạch sản phẩm cắt giới hạn bằng kit thôi gel của Bioneer
Gắn gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện
Nuôi cấy tế bào vi khuẩn E. coli BL21 và thu protein tổng số trong phân đoạn dịch chiết và kết tủa tế bào
2.3.9. Sắ c ký protein qua cột ái lực Ni-agarose hoặc His-bind
2.3.10. Kiểm tra độ tinh sạch của protein bằng điên polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE)
Bảng 2.1. Thành phần gel cô và gel tách acrylamide trong SDS-PAGE
2.3.11. Kiểm tra sự có mặt của protease HIV -1 bằng thẩm tá ch miên (Western blotting)
2.3.12. Xác định protein bằng hệ thống phân tích khối phổ
2.3.13. Xác định hoạt độ protease HIV -1 bằng phƣơng pháp đo khả năng thủy phân cơ chất đặc hiệu
Hình 2.1. Nguyên tắc xác định hoạt độ của protease HIV-1 sử dụng cơ chất huỳnh quang
Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng đo hoạt độ protease HIV-1 sƣ̉ dụng kit SensoLyteTM 490 HIV-1 Protease Assay
Hình 2.2. Công thức hóa học của Nle (A) và Nph (B)
Hình 3.1. Điện di sản phẩm RT-PCR lồng các mẫu máu nhiễm và không nhiễm HIV
3.1.2. Nhân dòng gen mã hóa protease HIV-1 vào vector pCR2.1
Hình 3.2. Điện di gel agarose sản phẩm PCR kiểm tra kết quả biến nạp sử dụng cặp mồi pCR2.1-F/ pCR2.1-R (A) và cặp mồi HIV-F2/ HIV-R2 (B)
3.1.3. Xác định trình tự gen mã hóa protease HIV-1 và phát hiện các đột biến
Hình 3.3. So sánh trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 trong pCR2.1-Prot với trình tự gen tƣơng ứng của chủng CRF01_AE ở miền Bắc Việt Nam (AB519612)
Hình 3.4. So sánh trình tự axit amin của protease HIV-1 trong pCR2.1-Prot với trình tự axit amin của protease HIV-1 phân nhóm CRF01_AE của miền Bắc Việt Nam (AB519612)
Hình 3.5. So sánh trình tự các gen mã hóa protease HIV-1 từ các bệnh nhân khác nhau với đoạn gen tƣơng ứng của chủng CRF01_AE của miền Bắc Việt Nam (AB519612) và Trung Quốc (EU518273)
Bảng 3.1. Một số đột biến trong gen mã hoá protease HIV-1 phân lập tại Việt Nam
3.2. NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEASE HIV-1 TRONG E. COLI
3.2.1. Nghiên cứu biểu hiên
Hình 3.6. Điện di sản phẩm cắt vector pET28a và pCR2.1-Prot bằng EcoRI và
Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR kiểm tra vector pET 28a mang gen mã hóa cho protease HIV-1 với cặp mồi T7-F/T7-R
Hình 3.8. SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) các phân đoạn tinh sạch dic̣ h chiết tế bào E. coli BL21 (DE3) plysS mang pET28a- Prot qua cột Ni-agarose
Hình 3.9. SDS-PAGE kiểm tra độ sạch của protease HIV-1 biểu hiện trên pET28a-Prot sau khi sắc ký qua cột Ni-agarose và cột DE-52 cellulose
Hình 3.10. Hoạt tính cắt cơ chất tổng hợp của protease HIV-1 biểu hiện ở pET28a
3.2.2. Nghiên cứu biểu hiên pET43a
Hình 3.11. Trình tự mồi HIV-F3 và HIV-Rv3 để biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 trên hai hệ thống vector pET32a và pET43a
Hình 3.12. So sánh trình tự đoạn gen mã hóa cho protease HIV-1 sau khi gắn thêm trình tự tự cắt và đƣợc nhân dòng vào vector pGEM-T (pGEM-Prot) với trình tự đoạn gen tƣơng ứng trong vector pCR2.1- Prot
Hình 3.13. Trình tự gen mã hóa protease HIV-1 trong vector pET32a-Prot (A) và pET43a-Prot (B)
Hình 3.14. SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) dịch chiết và tủa tế bào BL21 (DE3) plysS mang pET32a-Prot vàBL21 (DE3) plysS mang pET43a-Prot
Hình 3.15. Kiểm tra độ tinh sạch của protease HIV-1 biểu hiện trên hệ thống pET32a-Prot bằng SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) sau khi sắc ký qua cột His-bind
Hình 3.16. Hoạt tính cắt cơ chất tổng hợp của protease HIV-1 tái tổ hợp biểu hiện trên pET32a-Prot sau khi đã tinh sạch qua cột His-bind
3.2.3. Cải tiến quy trình biểu hiện protease HIV-1 trong pET32a và pET43a ở
HIV-R4:
HIV-R5:
Hình 3.17. Trình tự các mồi ngƣợc HIV-Rv4 và HIV-Rv5 để cải tiến biểu hiện protease HIV-1
Hình 3.18. Trình tự các đoạn gen mã hóa protease HIV -1 trong cá c vector pET32a-Prot-HA-His (A), pET32a-Prot-TEV-HA-His (B), pET43a-
Hình 3.19. SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra sự biểu hiện
3.2.4. Xây dƣng quy trình tinh sạch protease HIV-1 tái tổ hợp
Hình 3.20. SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra mức độ hòa tan protease HIV-1 trong phân đoạn tủa tế bào ở các nồng độ urea khác nhau
Hình 3.21. SDS-PAGE kiểm tra độ tinh sạch của protease biểu hiện trên hệ thống pET32a-Prot-HA và sắc ký qua cột His-bind
Hình 3.22. Sắc ký đồ tinh sạch protease HIV-1 trong dịch hòa tan tủa tế bào
Hình 3.23. SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) các phân đoạn sắc ký dịch hòa tan tủa tế bào chứa protease HIV-1 qua cột mono Q-sepharose
Hình 3.24. SDS-PAGE chế phẩm protease HIV-1 sau hồi tính
Hình 3.25. Hoạt tính cắt cơ chất tổng hợp đặc hiệu của protease HIV-1 tái tổ hợp đã tinh sạch
Bảng 3.2. Tóm tắt các bƣớc tinh sạch protease HIV-1 tái tổ hợp
3.3. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE HIV-1 TÁI TỔ HỢP
Hình 3.26. Nhiệt độ hoạt động tối thích (A) và độ bền với nhiệt (B) của protease HIV-1 tái tổ hợp
Hình 3.27. pH hoạt động tối thích của protease HIV-1 tái tổ hợp
3.3.3. Một số tính chất động học của protease HIV-1 tái tổ hợp
Hình 3.28. Đồ thị sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng thủy phân cơ chất tổng hợp của protease HIV-1 tái tổ hợp vào nồng độ cơ chất
3.3.4. Ảnh hƣởng của các hợp chấ t khác nhau lên hoat tái tổ hợp
KẾT LUẬN
KIẾN NGHỊ
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
II. Tài liệu Tiếng Anh
MỤC LỤC
DANH
Trang
DANH MUC CÁC HÌNH
DANH MUC
LỜ I CAM ĐOAN
NGHIÊN CỨU
LỜI CẢ M ƠN
PHỤ LỤC 2
PHỤ LỤC 3
PHỤ LỤC 4
PHỤ LỤC 5