NGHIÊN cứu sự BIẾN đổi HÌNH THÁI tế bào RONG nâu dưới tác DỤNG của một số điều KIỆN hóa lý SINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÌNH DƢƠNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN CNSH TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI TẾ BÀO RONG NÂU DƢỚI TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN HÓA LÝ SINH GVHD: TS.NCVS ĐẶNG XUÂN CƢỜNG SVTH: LA THỊ HÀ TIÊN MSSV: 14070019 LỚP: 17SH01 BÌNH DƢƠNG - 2018 TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÌNH DƢƠNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC LA THỊ HÀ TIÊN NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI TẾ BÀO RONG NÂU DƢỚI TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN HÓA LÝ SINH LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN CNSH GVHD: TS.NCVC ĐẶNG XUÂN CƢỜNG BÌNH DƢƠNG - 2018 LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu, Lãnh đạo Khoa Công nghệ Sinh học – Trƣờng Đại học Bình Dƣơng tạo điều kiện tốt cho em trình học tập Trƣờng; Xin gửi lời cám ơn chân thành tới Thầy Hồng Ngọc Cƣờng tồn thể Q Thầy Cơ - Trƣờng Đại học Bình Dƣơng giúp đỡ truyền đạt cho em kiến thức quý báu từ môn học; Xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới Thầy Đặng Xuân Cƣờng, Thầy Võ Duy Triết Viện Nghiên cứu Ứng dụng tận tình dạy; xin cảm ơn Cán bộ, Viên chức – Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang tạo điều kiện để em hồn thành Khóa luận; Cuối cùng, xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới Gia đình tồn thể bạn bè ln kề vai sát cánh bên tơi hồn cảnh Bình Dương, ngày… tháng…năm 2018 SINH VIÊN LA THỊ HÀ TIÊN i MỤC LỤC Mục Trang LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .vii DANH MỤC HÌNH ix TÓM TẮT LUẬN VĂN xv CHƢƠNG MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TỔNG QUAN VỀ RONG BIỂN 2.1.1 Rong Biển 2.1.2 Phân bố ngành rong biển giới 2.1.3 Sản lượng rong Biển giới 2.1.4 Ứng dụng rong biển 2.2 TỔNG QUAN VỀ RONG NÂU 2.2.1 Rong Nâu 2.2.2 Tình hình phân bố sản lượng rong Nâu Việt Nam 10 2.2.3 Hình thái cấu tạo tế bào rong Nâu 12 2.2.3.1 Hình thái rong Nâu 12 2.2.3.2 Cấu tạo hình thái tế bào rong Nâu 15 2.2.4 Thành phần hóa học rong Nâu 20 2.2.5 Hoạt chất hoạt tính sinh học rong Nâu 22 2.2.5.1 Phlorotannin 22 2.2.5.2 Fucoidan 24 2.2.5.3 Alginate 26 2.2.6 Ứng dụng rong Nâu 26 ii 2.3 CÁC YẾU TẾ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HÌNH THÁI CỦA TẾ BÀO RONG NÂU 28 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 3.1 NGUYÊN LIỆU 30 3.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 30 3.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 3.3.1 Phương pháp phân tích 30 3.3.1.1 Định lượng hàm lượng phlorotannin 30 3.3.1.2 Xác định hoạt tính chống oxy hóa tổng 30 3.3.1.3 Xác định hoạt tính khử sắt 31 3.3.2 Bố trí thí nghiệm 31 3.3.2.1 Bố trí thí nghiệm tổng quát 31 3.3.2.2 Khảo sát tác động yếu tố vật lý (thời gian) lên hình thái tế bào, hàm lượng phlorotannin hoạt tính chống oxy hóa 33 3.3.2.3 Khảo sát tác động yếu tố vật lý (nhiệt độ) yếu tố sinh học (enzyme) lên hình thái tế bào, hàm lượng phlorotannin hoạt tính chống oxy hóa 34 3.3.2.4 Khảo sát tác động yếu tố vật lý (tỷ lệ dung mơi ngun liệu) yếu tố hóa học (ethanol) lên hình thái tế bào, hàm lượng phlorotannin hoạt tính chống oxy hóa 35 3.3.2.5Khảo sát tác động yếu tố hóa học (pH) lên hình thái tế bào, hàm lượng phlorotannin hoạt tính chống oxy hóa 36 3.3.2.6Khảo sát tác động yếu tố vật lý (thời gian) yếu tố hóa học (ethanol) lên hình thái tế bào, hàm lượng phlorotannin hoạt tính chống oxy hóa 38 3.3.3Phân tích liệu 39 3.3.4Phương pháp quan sát kính hiển vi 39 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 4.1 NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI TẾ BÀO RONG NÂU DƢỚI TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN HÓA LÝ SINH 40 4.1.1Sự thay đổi hình thái tế bào rong nâu qua thời gian (tácđộng vật lý) 40 iii 4.1.1.1Hình thái tế bào rong sau ngâm 1h, nhiệt độ thường DM/NL 40/1 41 4.1.1.2Hình thái tế bào rong sau ngâm 2h nhiệt độ thường, tỷ lệ DM/NL 40/1 42 4.1.1.3Hình thái tế bào rong sau ngâm 3h nhiệt độ thường, tỷ lệ DM/NL 40/1 43 4.1.1.4Hình thái tế bào rong sau ngâm 5h nhiệt độ thường, tỷ lệ DM/NL 40/1 44 4.1.1.5Hình thái tế bào rong sau ngâm 8h nhiệt độ thường, tỷ lệ DM/NL 40/1 45 4.1.1.6Hình thái tế bào rong sau ngâm 12h nhiệt độ thường, tỷ lệ DM/NL 40/1 46 4.1.1.7Hình thái tế bào rong sau ngâm 24h nhiệt độ thường, tỷ lệ DM/NL 40/1 47 4.1.2Sự thay đổi hình thái tế bào rong nâu tác dụng enzyme (tác dụng sinh học) thay đổi nhiệt độ (tác dụng vật lý) 49 4.1.2.1Sargassum oligocystum 49 4.1.2.2Sargassum poligocystum 56 4.1.3Sự ảnh hưởng thời gian đến tế bào rong Nâu môi trường cồn 63 4.1.3.1Ngâm cồn 1h 63 4.1.3.2Ngâm cồn 2h 64 4.1.3.3Ngâm cồn 3h 65 4.1.3.4Ngâm cồn 4h 66 4.1.3.5Ngâm cồn 5h 67 4.1.3.6Ngâm cồn 6h 68 4.1.3.7Ngâm cồn 7h 69 4.1.3.8Ngâm cồn 8h 70 iv 4.1.4Sự thay đổi hình thái tế bào rong Nâu môi trường cồn thay đổi tỷ lệ dung môi dung dịch (DM/NL) 72 4.1.4.1Tỷ lệ dung môi nguyên liệu 10/1 72 4.1.4.2Tỷ lệ dung môi nguyên liệu 20/1 73 4.1.4.3Tỷ lệ dung môi nguyên liệu 30/1 74 4.1.4.4Tỷ lệ dung môi nguyên liệu 40/1 75 4.1.4.5Tỷ lệ dung môi nguyên liệu 50/1 76 4.1.5Sự ảnh hưởng pH mơi trường đến hình thái tế bào rong Nâu trình chiết tách hoạt chất sinh học phlotannin 78 4.1.5.1Môi trường pH 78 4.1.5.2Môi trường pH 79 4.1.5.3Môi trường pH 80 4.1.5.4Môi trường pH 81 4.1.5.5Môi trường pH 82 4.1.5.6Môi trường pH 84 4.1.5.7Môi trường pH 85 4.1.5.8Môi trường pH 86 4.1.5.9Môi trường pH 10 87 4.2 ĐÁNH GIÁ HÀM LƢỢNG PHLOROTANNIN, HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA VÀ HOẠT TÍNH KHỬ SẮT CỦA CÁC DỊCH CHIẾT THI ĐƢỢC Ở TỪNG ĐIỀU KIỆN TÁC ĐỘNG KHÁC NHAU 89 4.2.1Sargassum polycystum 89 4.2.1.1Khảo sát tác động yếu tố vật lý (thời gian) đến hàm lượng phlorotannin, hoạt tính chống oxy hóa hoạt tính khử Fe 89 4.2.1.2Khảo sát tác động yếu tố vật lý (nhiệt độ) yếu tố sinh học (enzyme) đến hàm lượng phlorotannin, hoạt tính chống oxy hóa hoạt tính khử Fe 92 4.2.1.3Khảo sát tác động yếu tố vật lý (tỷ lệ dung mơi ngun liệu) yếu tố hóa học (ethanol) đến hàm lượng phlorotannin, hoạt tính chống oxy hóa hoạt tính khử sắt 95 v 4.2.1.4Khảo sát tác động yếu tố hóa học (pH) đến hàm lượng phlorotannin, hoạt tính chống oxy hóa hoạt tính khử Fe 97 4.2.1.5Khảo sát tác động yếu tố vật lý (thời gian) yếu tố hóa học (ethanol) đến hàm lượng phlorotannin, hoạt tính chống oxy hóa hoạt tính khử Fe 100 4.2.2Sargassum oligocystum 102 4.2.2.1Khảo sát tác động yếu tố vật lý (thời gian) đến hàm lượng phlorotannin, hoạt tính chống oxy hóa hoạt tính khử Fe 102 4.2.2.2Khảo sát tác động yếu tố vật lý (nhiệt độ) yếu tố sinh học (enzyme) đến hàm lượng phlorotannin, hoạt tính chống oxy hóa hoạt tính khử Fe 105 4.2.2.3Khảo sát tác động yếu tố vật lý (tỷ lệ dung môi nguyên liệu) yếu tố hóa học (ethanol) đến hàm lượng phlorotannin, hoạt tính chống oxy hóa hoạt tính khử sắt 108 4.2.2.4Khảo sát tác động yếu tố hóa học (pH) đến hàm lượng phlorotannin, hoạt tính chống oxy hóa hoạt tính khử Fe 110 4.2.2.5Khảo sát tác động yếu tố vật lý (thời gian) yếu tố hóa học (ethanol) đến hàm lượng phlorotannin, hoạt tính chống oxy hóa hoạt tính khử Fe 113 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 116 5.1 KẾT LUẬN 116 5.2 ĐỀ NGHỊ 116 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DM : dung môi NL: ngun liệu TA: hoạt tính chống oxy hóa tổng vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Diện tích rong Nâu mọc tự nhiên số tỉnh 12 viii Laurencia obtusa F, M Indonesia Laurencia papillosa Ag Kenya, Philippines Laurencia pinnitifida F Portugal Liththamnion corallioides Ag France, Ireland, UK Mastocarpus papillatus C Chile Mastocarpus stellatus C Portugal, Spain F Ireland Mazzaella splendens A, F Canada Meristotheca papulosa F Japan Meristotheca procumbens F South Pacific Islands Nemalion vericulare F Korea Palmaria hecatensis F Canada Palmaria mollis F Canada Palmaria palmate F Canada, France, Iceland, Ireland, Phymatolithon calcareum Ag UK, US France, Ireland, UK Porphyra spp F Israel, New Zealand, UK Porphyra abbottae F Alaska, Canada Porphyra acanthophora F Brazil Porphyra atropurpurae F, M Indonesia Porphyra columbina F Argentina, Chile, Pure Porphyra crispate F Thailand, Vietnam Porphyra fallax F Canada 131 Porphyra haitanensis F China Porphyra kuniedae F Korea Porphyra leucostica F Portugal Porphyra perforate F Canada Porphyra psuedolanceolata F Canada Porphyra seriata F Korea Porphyra spiralis F Brazil Porphyra suborbiculata F Korea, Vietnam Porphyra tenera F Japan, Korea Porphyra torta F Alaska, Canada Porphyra umbilicalis F France, US Porphyra vietnamensis F Thailand Porphyra yezoensis F China, Japan, Korea Pterocladia capillacea A Portugal F Korea Scinaia moniliformis F Philippines Scinaia spp F Myanmar Pterocladia lucida A New Zealand Phaeophyta Alaria crassifolia F Japan Alaria fitulosa Ag, F Alaska Alaria marginata F Canada Alaria esculenta F Iceland, Ireland, US 132 Ascophyllum nodosum Ag France, Canada,, China, Iceland, US Al Ireland, Norway, UK Cladosiphon okamuranus F Japan Cystoseira barbata Al Egypt Desmarestia spp RoK Alaska Durvillaea antarctica F Chile Durvillaea potatorum Al Australia Ecklonia cava F Japan Ecklonia maxima Ag South Africa Ecklonia stolonifera F Korea Egregia menziesii F Canada Fucus spp Ag France Fucus gardneri Ag Canada F RoK Alaska Al Ireland F France Al Ireland Co Ireland F France, Portugal Hizikia fusiformis F Japan, Korea Hydroclathrus clathratus Ag Philippines F Bangladesh, Philippines F Japan Fucus serratus Fucus vesiculosus Laminaria angustata 133 Laminaria bongardiana F RoK Alaska Laminaria diabolica F Japan Laminaria digitata Al France, Ireland F Ireland Laminaria groenlandica F Canada Laminaria hyperborean Al Ireland, Norway, Spain, UK Laminaria japonica Al China F China, Japan, Korea Laminaria longicruris F US Laminaria longgissina F Japan Laminaria ochroleuca Al Spain Laminaria octotensis F Japan Laminaria religiosa F Japan, Korea Laminaria saccharina F Alaska, Canada, Ireland RoK Alaska Laminaria setchelli F Canada Laminaria schinzii Ag South Africa Lessonia nigrescens Al Chile, Peru Lessonia trabeculari Al Chile Macrocystis intergrifolia Al Peru Rok Alaska, Canada Ag Australia Al Chile, Mexico, Peru, US Macrocystis pyrifera 134 F Argentina Rok Alaska, US Nemacystis decipiens F Japan Nereocystis luetkaena Ag Alaska, Canada F US Pelvetia siliquosa F Korea Postelsia spp F US Sargassum aquifolium F Indonesia Sargassum crassifolium Al Vietnam F Thailand Ag Brazil, Vietnam Al Vietnam F Bangladesh, Hawaii, Malaysia, Sargassum spp Myanamar, Thailand, Vietnam M Brazil, Vietnam Sargassum filipendula F Egypt Sargassum gramminifolium Al Vietnam Sargassum henslowianum Al Vietnam Sargassum horneri F Korea Sargassum ilicifolium Al India Sargassum mcclurei Al Vietnam 135 Philippines, Sargassum myriocystum Al India Sargassum oligocystum F Thailand Sargassum polycystum F Indonesia, Thailand Al, M Vietnam Al Vietnam F, M Indonesia Sargassum wightii Al India Sargassum vachelliannum Al Vietnam Turbinaria spp Ag Vietnam Sargassum siliquosum M Philippines Turbinaria conoides Al India (Al) Turbinaria decurrens Al India Turbinaria ornate Al India Turbinaria pinnitifida F Australia, Korea Turbinaria peterseniana F Korea Trong F Food A Agar C Carageenan Al Alginate M Medicine 136 China, France, Japan, RoK Roe on Kelp Ag Agricultural P Paper 137 Phụ lục 2: Sản lƣợng sản phẩm rong biển giới GENERA COUNTRY TOTAL CULTURED Codium Korea 0.15 0.15 Caulerpa Philippines 810 810 Enteromorpha Japan 1,400 1,400 Korea 1.038 1,038 Monostroma Japan 1,250 1,250 Ulva Japan 1,500 Chlorophyta Rhodophyta Chondrus Euchuema Gelidiella Canada 10,000 France 1,260 Ireland Japan 500 Portugal 30 Spain 300 US 120 China 300 300 Indonesia 13,447 13,447 Kiribati 396 396 Madagascar 500 Malaysia 800 800 Philippines 10,102 10,102 138 Gelidium India 232 Chile 1,144 China 300 France 1,800 Japan 5,714 Madagascar 300 Mexico 1,200 Morocco 6950 Portugal 900 South Africa 139 Spain 326 Argentina 22 Chile 6,389 Mexico 200 Gloiopeltis Japan 900 Gracilaria Argentina 2,276 Chile 68,436 34218 China 300 300 India 215 Indonesia 13,447 Mexico 205 Namibia 835 Peru 194 Gigartina 139 900 13,447 South Africa 439 Thailand 200 US Vietnam 2,000 Ireland, Chile 5,606 Kappahycus Philippines 30,306 Mastocarpus Spain 600 Ireland Portugal 70 Canada 100 Ireland Argentina Chile China 30,165 30,165 Japan 60,000 60,000 Korea 40,449 40,449 New Zealand 50 Portugal 300 France 600,000 Ireland 1,000 UK 200,000 Palmaria Porphyra Pterocladia Maerl (t ww) Phaeophyta Ascopylum Canada 2,500 140 200 2,000 30,306 China 3,000 France 1,700 Iceland 4,400 Ireland 8,999 Norway 6,632 UK 3,500 US 280 Cladosiphon Japan 1,500 Durvillaea Australia 4,000 Chile 464 Ecklonia South Africa 350 Fusus France Ireland 80 Portugal 0.04 Hizakia Korea 7,497 Laminaria Canada 0.48 China 644,464 France 12,000 Ireland 523 Japan 32,000 24,000 Korea 6,117 4,588 Norway 34,000 Scotland 1,000 141 1,500 6,297 644,464 South Africa 350 Spain 40 Lessonia UK 1,000 Nereocystis Chile 24,754 Argentina 20 Australia 14 Chile 2,510 Mexico 8,800 US 14,721 Alaska 20 Canada India 2,249 Philippines 5,000 Vietnam 400 India 307 Australia China 20,000 Japan 18,310 18,310 Korea 83,398 83,398 Alaska 175 Canada 35 US 11 Undari Roe on Kelp Total 142 Chlorophytes 5,998 4,498 Rhodophytes 1,042,507 237,029 Phaeaophytes 956,954 792,122 Grand 2,005,459 1,033,650 143 Phụ lục 3: Xác định hàm lƣợng phlorotannin dịch chiết Hàm lƣợng phlorotannin đƣợc xác định theo phƣơng pháp so màu, thuốc thử FolinCiocalteus đo bƣớc sóng 750nm a) Nguyên lý Oxy hóa tồn lƣợng phlorotannin dịch chiết dung dịch FolinCiocalteus (hỗn hợp acid phosphotungstic acid phosphomolyblic) Các acid bị khử thành Vonfam (W8O23) oxit moliden (W08O23) có màu vàng b) Dụng cụ hóa chất Dụng cụ: - Máy quang phổ UV-VIS - Pipet - Ống nghiệm Hóa chất: - Dung dịch phloroglucinol 0,1% (C6H6O3 0,1%) làm chất chuẩn - Dung dịch Folin- Ciocalteus - Na2CO3 10% c) Tiến hành Lấy 100µl mẫu với 900µl nƣớc cất cộng thêm 1ml Folin- Ciocalteus đƣợc pha loãng đến nồng dộ 10% vào ống nghiệm, giữ phút Tiếp theo thêm vào 2ml Na2CO3 10% trộn giữ 90 phút bóng tối, sau đo độ hấp thụ bƣớc sóng 750nm Tính tốn xác định hàm lƣợng phlorotannin mẫu 144 Phụ lục 4: Xác định hoạt tính chống oxy hóa tổng a) Nguyên lý Chống oxy hóa tổng đƣợc xác định theo phƣơng pháp phosphomolybdenum Phƣơng pháp dựa việc giảm hóa trị Mo (VI)-MO (V) hợ chất chống oxy hóa hình thành sau dung dịch phosphate màu xanh (phức hợp Mo (V) pH acid) b) Dụng cụ hóa chất Dụng cụ: - Máy quang phổ UV-VIS - Pipet - Ống nghiệm Hóa chất: - Dung dịch H2SO4 0,6M - Sodium phosphate 28mM - Ammonium Molybdate 4mM - Acid ascorbic c) Tiến hành Lấy 100µl mẫu bổ sung 900µl nƣớc cất thêm 3ml dung dịch A (H2SO4 0,6M, sodium phosphate 28mM ammonium Molybdate 4mM) Hỗn hợp đƣợc giữ 90 phút 950C.Sau đo bƣớc sóng 695nm với chất chuẩn acid ascorbic Cách pha đƣờng chuẩn pha dung dịch acid ascorbic 1mg/1ml sau lấy 10 µl , 20 µl , 30 µl, 40 µl, 50 µl, 60 µl, 70 µl, 80 µl, 90 µl, 100 µl, bổ sung nƣớc cất tƣơng ứng cho đủ 1ml sau thêm 3ml dung dịch A vào giữ 90 phút 950C Sau đo bƣớc sóng 695nm Với kết đo đƣợc vẽ đƣờng chuẩn đƣa phƣơng trình So sánh kết mẫu chiết với đƣờng chuẩn có hàm lƣợng tƣơng ứng acid ascorbic 145 ... 40 4.1 NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI TẾ BÀO RONG NÂU DƢỚI TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN HÓA LÝ SINH 40 4.1. 1Sự thay đổi hình thái tế bào rong nâu qua thời gian (tác? ?ộng vật lý) ... khóa luận ? ?Nghiên cứu biến đổi hình thái tế bào rong nâu dƣới tác động số điều kiện hóa lý sinh? ?? đƣợc thực khóa luận tập trung trình bày biến đổi hình thái tế bào điều kiện tác động hóa lý sinh. .. đƣợc biến đổi hình thái tế bào rong nâu dƣới tác động số điều kiện hóa lý sinh Đối tƣợng nghiên cứu Hình thái tế bào rong nâu, hàm lƣợng phlorotannin hoạt tính chống oxy hóa điều kiện tác động hóa