Nghiên cứu thành phần và hoạt tính sinh học của lipid trong một số loài rong biển ở việt nam TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Phạm Thu Huế NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LIPID TRONG MỘT SỐ LOÀI RONG BIỂN Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa học hợp chất thiên nhiên Mã số: 44 01 17 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2021 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Trần Thị Thanh Vân Người hướng dẫn khoa học 2: TS Lê Tất Thành Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi …… ……, ngày …… tháng … năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Nghiên cứu hóa học hợp chất thiên nhiên từ sinh vật biển có rong biển hướng nghiên cứu quan trọng kỉ 21 Với tổng số khoảng 1000 lồi tìm thấy vùng biển Việt Nam, rong biển trở thành đối tượng kinh tế quan trọng nước ta Ngoài nghiên cứu tạo nhiều sản phẩm có giá trị từ rong biển alginate, carrageenan, fucoidan, năm gần hướng nghiên cứu lipid rong biển nhận nhiều quan tâm tác dụng chúng bệnh xương khớp, tim mạch não Các axit béo không no đa nối đôi axit arachidonic (AA), axit eicosapentaenoic (EPA), axit docosahexaenoic (DHA) hợp chất lipid phân cực rong biển monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) có tác dụng kháng u, kháng viêm, ức chế DNA-polymerase HIV Hiện nay, với góp sức thiết bị nghiên cứu đại sắc kí lỏng hiệu cao kết nối phổ khối phân giải cao (HPLCHRMS), khoa học giới đạt tiến lớn việc xác định dạng phân tử lipid phân cực mà không cần phân lập hợp chất riêng biệt Trên giới đến có số lồi rong biển nghiên cứu công bố dạng phân tử lipid phân cực Tại Việt Nam, lipid rong biển nghiên cứu hóa sinh túy theo cách truyền thống Tiếp cận hướng nghiên cứu đại lipid phân cực, góp phần tạo sở khoa học để sử dụng hiệu nguồn lợi rong biển gắn kết việc công bố liệu khoa học với việc khẳng định chủ quyền biển đảo toàn vẹn lãnh thổ Việt Nam, thực đề tài luận án“Nghiên cứu thành phần hoạt tính sinh học lipid số loài rong biển Việt Nam” 2 Mục tiêu nghiên cứu luận án Tiếp cận hướng nghiên cứu đại, xây dựng liệu điều tra rong biển Việt Nam, trợ giúp cho lĩnh vực phân loại rong biển tìm hiểu mối tương quan đa dạng sinh học đa dạng hóa học Tạo sở khoa học để định hướng bảo tồn, nuôi trồng sử dụng hiệu nguồn lợi rong biển Gắn kết việc công bố kết nghiên cứu với việc khẳng định chủ quyền biển đảo toàn vẹn lãnh thổ Việt Nam Nội dung nghiên cứu luận án Nghiên cứu sàng lọc lipid axit béo 60 mẫu 50 loài rong biển thuộc ngành rong Đỏ, rong Nâu rong Lục Xác định dạng phân tử lipid phân cực hai loài chọn lọc thu vùng đảo xa bờ đặc thù Việt Nam Côn Đảo Quần đảo Trường Sa Khảo sát hoạt tính sinh học in vitro phân đoạn lipid từ hai loài lựa chọn CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan rong biển Giới thiệu vai trò rong biển hệ sinh thái biển, phân loại phân bố rong biển Việt Nam Giới thiệu hai chi Lobophora, Halimeda nghiên cứu thành phần hóa học 1.2 Lipid rong biển Giới thiệu chung lipid lipid rong biển, lớp chất lipid, nghiên cứu giới nước lipid rong biển 1.3 Phổ khối phân giải cao nghiên cứu lipid phân cực Giới thiệu hệ thống thiết bị LCMS-IT-TOF ứng dụng nghiên cứu lipid phân cực CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu 60 mẫu rong biển 50 loài, 14 họ thuộc ngành rong Đỏ, Nâu Lục thu vùng biển từ Quảng Ninh đến Khánh Hoà 02 đảo xa bờ Côn Đảo, Trường Sa -Việt Nam 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp thu bảo quản mẫu Theo “Quy trình Điều tra Tài ngun Mơi trường biển - Phần Sinh học Hóa Mơi trường” 2.2.2 Phương pháp phân lập, chiết tách lipid, axit béo 2.2.2.1 Phương pháp chiết tách xác định hàm lượng lipid tổng Chiết lipid tổng theo phương pháp E.G Bligh W.J Dyer 2.2.2.2 Phương pháp phân tích thành phần hàm lượng lớp chất lipid lipid tổng Theo phương pháp phân tích hình ảnh mỏng Sorbfil TLC Videodensitometer, Krasnodar, Nga 2.2.2.3 Phương pháp phân tích thành phần hàm lượng axit béo Xác định thành phần, hàm lượng axit béo sắc kí khí (GC, GC-MS) theo phương pháp Carreau & Dubacq 2.2.3 Phương pháp phân tích cấu tử Phần mềm SAS-JMP Statistical discovery Pro 13:2:1 69 sử dụng để phân tích cấu tử (PCA) 2.2.4 Phương pháp xác định dạng phân tử lipid phân cực Việc xác định hàm lượng cấu trúc dạng phân tử thực theo phương pháp HPLC-HRMS Imbs cộng (2015, 2017, 2019) Sikorskaya cộng (2018) hệ thống LCMSIT-TOF (Shimadzu, Nhật Bản) 2.2.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học 2.2.5.1 Hoạt tính bẫy gốc tự do: theo phương pháp Kumar, 2013 2.2.5.2 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định: theo phương pháp Vlietinck A.J., 1998 Vanden Berghe, 1991 2.2.5.3 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư: thực dòng tế bào ung thư SRB theo phương pháp Monks A, 2011 2.2.5.4 Hoạt tính kháng viêm: xác định qua khả ức chế sản sinh NO tế bào RAW 264.7 bị kích LPS, theo phương pháp Liao H, 2014 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM Các mẫu tiến hành nghiên cứu theo sơ đồ chung sau: Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu chung 3.1 Chiết tách xác định hàm lượng lipid tổng 3.2 Xác định thành phần hàm lượng axit béo 3.3 Xác định thành phần hàm lượng lớp chất lipid tổng 3.4 Xác định dạng phân tử lipid phân cực Q trình phân tích thực chế độ ion hóa phun mù điện tử (ESI) nhận dạng đồng thời tín hiệu ion dương âm Quá trình quét thực phạm vi m/z từ 100-1200 Các dạng phân tử riêng lẻ lipid phân cực phát cách so sánh với tiêu chuẩn xác thực phần mềm xử lý Shimadzu LCMS Phần trăm dạng phân tử nhóm chất phân lớp lipid tính diện tích peak ion âm [M-H]-, riêng dạng phân tử PC, MGDG, DGDG, xác định diện tích peak ion dương [M+H]+ hay [M+Na]+ Xác định nhóm chất lipid phân cực theo thời gian lưu (bảng 3.1, hình 3.2) liệu phổ khối phân giải cao (HRMS) 158 dạng phân tử lipid phân cực từ loài Lobophora sp 64 dạng phân tử lipid phân cực từ loài Halimeda incrassata Lamx Bảng 3.1 Khoảng thời gian lưu nhóm chất Phân lớp Nhóm chất Phospholipid PA PG PC Thời gian 3,5-5,6 5,4-6,8 7,5-11,5 lưu (phút) Glycolipid Betaine lipid PI MGDG DGDG SQDG DGTS DGTA 16,5-20 2,5-3,5 8,5-14 3,5-5,5 4,5-7 10-16 Hình 3.2 Thời gian lưu nhóm chất sử dụng cột Diol CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Nghiên cứu sàng lọc lipid axit béo rong biển 4.1.1 Hàm lượng lipid tổng lớp chất lipid - Hàm lượng lipid tổng 60 mẫu rong biển phần lớn dao động khoảng 0,35 - 0,58% (tính theo khối lượng tươi) Một số mẫu có hàm lượng cao vượt trội 29KT (1,7%), 18KT (1,6%), 10A (1,49%), 9A (1,34%), 33KT (1,1%) 1KT (1,06%) Hàm lượng, thành phần lipid tổng mẫu rong biển phụ thuộc vào chất sinh học loài, điều kiện sinh trưởng thời gian thu mẫu - Kết phân tích lipid Sorbfil TLC Videodensitometer cho thấy đa số lipid rong biển gồm lớp chất: lipid phân cực (Pol), sterol (ST), axit béo tự (FFA), triacylglycerol (TG), hydrocacbon sáp (HW), Pol TG có hàm lượng cao 4.1.2 Thành phần hàm lượng axit béo 4.1.2.1 Thành phần hàm lượng axit béo ngành rong Đỏ Kết phân tích 20 mẫu ngành rong Đỏ xác định 30 axit béo có mạch cacbon từ C12 đến C22 Bảng 4.4 Giá trị tham số đo lường xu hướng tập trung axit béo Tham số SFA MUFA PUFA Trung bình 50,17 20,66 39,50 54,92 61,52 64,32 23,39 9,58 19,48 21,97 27,66 45,51 19,93 4,73 8,36 12,97 26,56 63,89 Min Q1 Trung vị Q3 Max n-3 (ω3) 11,19 2,17 4,56 6,94 10,76 44,86 n-6 (ω6) 7,76 0,83 2,99 3,72 14,21 24,42 n-9 (ω9) 15,51 6,01 11,67 13,29 20,05 29,48 PUFA /SFA 0,54 0,09 0,15 0,22 0,70 3,09 ω3/ ω6 3,88 0,48 0,89 1,32 1,78 44,41 Theo WHO giá trị PUFA/SFA > 0,4: thực phẩm lành giá trị ω3/ω6 > 0,1: tốt cho sức khỏe Một số mẫu ngành rong Đỏ đáng lưu ý: + Lồi Palisada parvipapillata (mẫu 23KT) có hàm lượng PUFA, ω6 số PUFA/SFA cao nhất, hàm lượng ω3 cao thứ + Loài Hypnea panosa (mẫu 12KT) có hàm lượng ω3, DHA (43,69%) số ω3/ω6 cao nhất, hàm lượng PUFA số PUFA/SFA cao thứ 4.1.2.2 Thành phần hàm lượng axit béo ngành rong Nâu Kết phân tích 31 mẫu ngành rong Nâu xác định 30 axit béo có mạch cacbon từ C12 đến C22 Bảng 4.5 Giá trị tham số đo lường xu hướng tập trung axit béo Tham số SFA Trung bình 50,26 19,62 38,59 45,63 54,97 87,69 Min Q1 Trung vị Q3 Max MUFA PUFA 24,52 4,87 19,87 24,64 28,27 45,21 21,54 0,00 11,86 20,82 28,31 59,98 n-3 (ω3) 9,56 0,00 3,16 9,42 12,52 34,15 n-6 (ω6) 11,00 0,00 4,21 9,36 16,51 28,48 n-9 (ω9) 17,17 3,80 13,75 17,73 19,87 29,28 ω3/ ω6 2,04 0,00 0,48 0,63 1,45 26,43 PUFA /SFA 0,59 0,00 0,20 0,52 0,66 2,71 + Lồi Lobophora sp (mẫu 1KT) có PUFA ω3 cao nhất, ω6 số PUFA/SFA cao thứ + Lồi Sargassum polycystum (mẫu 20KT) có hàm lượng ω6 PUFA/SFA cao nhất, PUFA cao thứ ngành (AA đạt 27,12%) 4.1.2.3 Thành phần hàm lượng axit béo ngành rong Lục Kết phân tích mẫu ngành rong Lục xác định 28 axit béo Bảng 4.6 Giá trị tham số đo lường xu hướng tập trung axit béo Tham số SFA MUFA PUFA n-3 (ω3) n-6 (ω6) n-9 (ω9) PUFA /SFA ω3/ ω6 Trung bình 41.10 28.92 36.34 38.89 47.27 56.80 22.15 20.05 20.93 22.04 22.60 25.40 22.78 9.66 16.27 25.88 27.12 33.25 15.90 3.38 10.25 16.93 20.87 25.84 6.03 0.20 1.76 5.14 7.57 15.00 11.02 6.99 7.91 9.49 12.42 21.54 0.60 0.17 0.34 0.67 0.75 1.05 29.52 0.61 1.13 2.76 5.61 126.98 Min Q1 Trung vị Q3 Max Cần tiếp tục nghiên cứu sâu loài Halimeda incrassata Lamx (mẫu TSL) có hàm lượng PUFA ω6 cao nhất, ω3 số PUFA/SFA cao thứ ngành rong Lục 4.1.3 Ứng dụng liệu axit béo phân loại hoá học (Chemotaxonomy) ngành rong biển Việt Nam Phân tích PCA liệu axit béo xác định axit béo đặc trưng dấu phân loại hóa học theo ngành 50 mẫu rong biển nghiên cứu Hình 4.2 Đồ thị PCA 50 mẫu rong biển mặt phẳng chiều Các axit béo đặc trưng ngành rong Nâu C16:1n-7, C18:1n-9 C20:4n-6, ngành rong Đỏ C15:0, C16:0, C18:0 ngành rong Lục C18:1n-7 C18:3n-6 4.2 Xác định dạng phân tử lipid phân cực rong Nâu Lobophora sp 4.2.1 Xác định dạng phân tử phospholipid Phospholipid phân lớp lipid phân cực tế bào nhân chuẩn, đảm bảo tính bán thấm màng tế bào Trình bày dạng phân tử phospholipid cách xác định dạng phân tử có hàm lượng cao nhóm PA, PG, PC PI Dạng công thức cấu tạo nhóm chất phospholipid rong biển: 11 - Hàm lượng axit béo không no giảm dần theo trật tự MGDG>DGDG>SQDG - Các hợp chất SQDG 28:0 (14:0/14:0), 30:0 (14:0/16:0), 32:0 (14:0/16:0) thể hoạt tính kháng virut, kháng khuẩn, kháng kí sinh trùng Ngồi hợp chất MGDG 36:5 (16:0/20:5) SQDG 36:5 (16:0/20:5) với hàm lượng tương ứng 7,85% 2,3% có tác dụng ức chế hoạt động enzim polymerase terminal deoxynycleoridyl transferase (TdT) 4.2.3 Xác định dạng phân tử betaine lipid Betaine lipid thành phần màng sinh chất sinh tổng hợp lưới nội chất rong biển Khi thiếu phospholipid hay phosphat, chúng sử dụng để cung cấp vật liệu cho trình tổng hợp galactolipid số lồi rong biển Trình bày dạng phân tử betaine lipid cách xác định dạng phân tử có hàm lượng cao nhóm DGTS, DGTA Dạng cơng thức cấu tạo nhóm chất betaine lipid rong biển: Diacylglyceryl-N,N,Ntrimethylhomoserine (DGTS) Diaclyglycerylhydroxymethyl-N,N,Ntrimethyl-beta-alanine (DGTA) Chúng xác định 64 dạng phân tử betaine lipid gồm DGTS (27) DGTA (37) 12 Rt (phút) DGTS Diacyl % DGTS 4,85 28:0 19,21 4,73 30:1 4,49 4,76 30:0 32:3 4,58 32:2 4,37 32:1 14:0/14:0 14:0/16:1 14:1/16:0 14:0/16:0 14:0/18:3 14:0/18:2 16:0/16:2 14:0/18:1 16:0/16:1 4,16 32:0 4,22 34:2 Rt (phút) 1,34 9,71 3,25 4,78 DGTS 4,58 34:4 4,43 34:3 4,07 34:1 12,14 4,19 36:4 16:0/16:0 14:0/18:0 5,03 4,01 36:2 16:0/18:2 16:1/18:1 7,29 4,07 38:5 Diacyl % DGTS 16:0/18:4 14:0/20:4 16:1/18:3 14:0/20:3 16:1/18:2 16:0/18:3 16:0/18:1 16:0/20:4 18:1/18:3 18:1/18:1 16:0/20:2 18:0/18:2 18:1/20:4 16:0/22:5 5,20 5,15 12,20 3,39 4,76 1,52 Rt (phút) 6,71 6,50 6,59 DGTA Diacyl % DGTA Rt (phút) DGTA Diacyl % DGTA 28:0 30:1 32:3 1,73 3,06 2,60 5,72 5,51 36:4 32:1 10,12 5,18 36:1 6,32 6,89 6,53 32:2 34:6 34:5 9,89 0,57 3,67 5,84 5,54 5,33 38:6 38:5 38:4 6,05 34:3 5,04 5,21 38:3 6,20 5,48 34:4 34:1 9,02 10,20 5,81 34:2 6,38 36:6 0,88 4,82 6,56 6,23 5,81 5,69 38:1 40:10 40:9 40:8 40:7 5,27 35:1 0,47 5,39 40:6 6,02 36:5 1,83 5,21 40:5 16:0/20:4 16:0/20:3 18:1/18:2 18:0/18:1 16:0/20:1 18:2/20:4 18:1/20:4 18:1/20:3 18:0/20:3 18:1/20:2 18:1/20:0 20:4/20:6 20:4/20:5 20:4/20:4 20:3/20:4 20:2/20:4 20:3/20:3 20:1/20:4 20:2/20:3 6,17 5,96 14:0/14:0 14:0/16:1 14:0/18:3 14:0/18:1 16:0/16:1 14:0/18:2 14:0/20:6 14:0/20:5 14:0/20:3 16:0/18:3 14:0/20:4 16:0/18:1 16:0/18:2 14:0/20:2 16:0/20:6 16:0/19:1 17:0/18:1 16:0/20:5 7,47 36:3 7,39 1,40 1,63 2,13 1,03 0,68 0,20 0,49 0,52 1,45 1,72 0,98 0,44 DGTS cấu trúc đồng phân tiền chất sinh tổng hợp DGTA rong Nâu Do đó, tồn đồng thời 27 dạng phân tử DGTS 37 dạng phân tử DGTA loài rong Nâu Lobophora sp giải thích cách chuyển đổi phần từ DGTS sang DGTA, betaine lipid có tính lưỡng tính phospholipid chúng có nhóm amoni bậc bốn tích điện dương 13 cho có chức cấu trúc tương tự phospholipid nhiều loại rong biển 4.3 Xác định dạng phân tử lipid phân cực rong Lục Halimeda incrasata Lamx 4.3.1 Xác định dạng phân tử phospholipid Trình bày 07 dạng phân tử phospholipid nhóm PG (4), PI (3) cách xác định dạng phân tử có hàm lượng cao nhóm PG PI Rt (phút) PG Diacyl % PG Rt (phút) PI Diacyl % PI 6,99 32:2 16:1/16:1 7,81 18,09 32:0 16:0/16:0 52,03 7,08 34:4 16:1/18:3 6,76 17,39 34:0 16:0/18:0 17,66 6,72 34:3 16:1/18:2 61,02 16,68 36:4 16:0/20:4 30,31 6,54 34:2 16:0/18:2 24,41 Nhận xét: Trong phân lớp phospholipid loài rong Lục Halimeda incrassata Lamx gồm dạng phân tử nhóm PI PG, khơng có xuất nhóm PC, PE PS… lồi rong Lục khác cơng bố trước đây, lồi rong có khả tổng hợp CaCO3 cao (35-45%) ngang san hô 4.3.2 Xác định dạng phân tử glycolipid Trình bày 40 dạng phân tử glycolipid nhóm MGDG (12), DGDG (11), SQDG (17) cách xác định dạng phân tử có hàm lượng cao nhóm Rt (phút) MGDG 3,11 3,02 2,92 30:2 30:1 30:0 3,14 32:4 2,96 32:2 Diacyl 14:1/16:1 14:0/16:1 14:0/16:0 16:1/16:3 14:1/18:3 16:1/16:1 14:0/18:2 % MGDG Rt (phút) 1,34 10,34 3,70 10,58 20,26 10,04 4,31 9,51 9,12 9,71 DGDG 30:0 32:2 32:1 32:0 34:2 Diacyl 14:0/16:0 14:0/18:2 16:0/16:1 14:0/18:1 16:0/16:0 14:0/18:0 16:0/18:2 % DGDG 23,26 4,37 6,19 38,84 5,91 14 Rt (phút) MGDG 2,78 3,21 3,08 2,91 2,81 32:0 34:6 34:5 34:3 36:4 Rt (phút) SQDG 14,99 14,69 14,09 14,78 13,77 13,35 12,63 14,43 28:0 30:1 30:0 32:3 32:1 32:0 33:0 34:4 Diacyl 16:0/16:0 16:3/18:3 16:3/18:2 16:1/18:2 16:0/20:4 Diacyl 14:0/14:0 14:0/16:1 14:0/16:0 16:0/16:3 16:0/16:1 16:0/16:0 16:0/17:0 16:0/18:4 % MGDG Rt (phút) 4,22 9,23 9,86 8,78 18,83 8,57 2,31 Rt (phút) 7,69 % SQDG 13,83 2,54 13,59 1,05 12,72 29,47 12,27 1,89 13,81 4,26 13,38 36,58 12,03 0,48 14,31 0,82 13,68 DGDG 34:1 34:0 36:1 SQDG 34:3 34:2 34:1 34:0 36:5 36:4 36:1 42:11 42:10 Diacyl 16:0/18:1 16:0/18:0 16:0/20:1 18:0/18:1 Diacyl 16:0/18:3 16:0/18:2 16:0/18:1 16:0/18:0 16:0/20:5 16:0/20:4 16:0/20:1 20:5/22:6 20:4/22:6 % DGDG 11,42 9,15 0,87 % SQDG 2,50 2,19 3,52 2,51 2,10 4,69 0,46 1,26 3,68 Nhận xét: Một số nghiên cứu khác cho thấy, hợp chất SQDG 32:0 30:0 (diacyl tương ứng 16:0/16:0 14:0/16:0) thể hoạt tính kháng virut, kháng khuẩn Nghiên cứu Wang cộng ra, SQDG 32:0 (16:0/16:0) có hoạt tính kháng virut HSV (antiviral) Vì hai dạng phân tử có hàm lượng cao lớp chất SQDG lồi rong Lục Halimeda incrassata Lamx với hàm lượng tương ứng 36,58% 29,47% nên phân lớp glycolipid cho tiềm hoạt tính kháng virut tốt 4.3.3 Xác định dạng phân tử betaine lipid Từ HPLC-HRMS, lipid phân cực mẫu rong Lục H incrassata Lamx xác định 17 dạng phân tử betaine lipid diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine (DGTS) Rt (phút) DGTS 5,16 4,83 5,07 4,68 4,44 4,92 4,71 28:0 30:0 32:3 32:1 32:0 34:4 34:3 Diacyl % DGTS Rt (phút) DGTS Diacyl 14:0/14:0 14:0/16:0 14:0/18:3 16:0/16:3 14:0/18:1 16:0/16:1 16:0/16:0 6,57 18,26 5,71 4,15 15,22 6,60 12,56 4,32 4,26 4,47 4,14 4,47 3,99 34:1 34:0 36:4 36:1 38:6 38:1 16:0/18:1 16:0/18:0 16:0/20:4 16:0/20:1 16:0/22:6 16:0/22:1 % DGTS 10,38 1,29 9,18 7,02 1,95 1,11 15 Ví dụ cách xác định dạng phân tử đặc trưng cho nhóm chất phân lớp phospholipid, glycolipid betaine lipid lipid phân cực rong biển • Xác định dạng phân tử PI 34:1 có Rt =19,04 phút hàm lượng cao 44,09% phân lớp phospholipid rong Nâu Lobophora sp Trên phổ MS- có tín hiệu mạnh ion [M-H]- giá trị m/z 835,5283 (hình 4.6-b) Ion [M-H]- m/z 835,5283 có cơng thức [C43H79O13P]-, tính tốn 835,5221, khác 0,00620 lựa chọn để bắn phá tiếp MS2- Trên MS2- (hình 4.6-c) tín hiệu m/z 297,0334 ion bán phân tử có inositol [C9H14O9P]- nhóm acyl Sự phân mảnh quan trọng việc xác định dạng phân tử PI Các tín hiệu m/z 255,2338 tương ứng với anion axit béo 16:0 [C16H31O2]-, m/z 281,2471 tương ứng với anion axit béo 18:1 [C18H33O2]-, m/z 391,2226 tín hiệu ứng với ion [M-H]- bị đồng thời phân tử axit béo 18:1 [C18H34O2] inositol [C6H10O5], m/z 409,2304 mảnh ion [C19H38O7P]- ion [M-H]- bị đồng thời phân tử keten axit béo 18:1 [C18H32O] inositol [C6H10O5], m/z 417,2373 tín hiệu ion [C21H38O6P]- [M-H]- bị đồng thời phân tử axit béo 16:0 [C16H32O2] inositol [C6H10O5], m/z 553,2744 [C25H46O11P]- tín hiệu ion [M-H]- bị phân tử axit béo 18:1 [C18H34O2], m/z 571,2832 [C25H48O12P]- tín hiệu ion [M-H]- bị phân tử keten axit béo 18:1 [C18H32O] m/z 579,2906 [C27H48O11P]- ion [M-H]- bị phân tử axit béo 16:0 [C16H32O2] Như vậy, liệu phổ khối chứng minh dạng phân tử xét diacyl glycerophosphoinositol PI 16:0/18:1 16 Kiểm tra GC, GC-MS thành phần axit béo lipid tổng phân đoạn lipid phân cực loài rong Nâu Lobophora sp PI 16:0/18:1n-9 Bằng cách tương tự, xác định dạng phân tử phospholipid lại rong biển Hình 4.6 HPLC-HRMS phân mảnh PI 34:1 [C43H79O13P]- (a) Sắc kí đồ HPLC [C43H79O13P]-, (b) Phổ khối (MS-) [C43H79O13P]-, (c) Phổ khối (MS2-) tín hiệu m/z 835,5283 • Xác định dạng phân tử SQDG 32:0 có Rt=13,35 phút hàm lượng cao 36,58% phân lớp glycolipid rong Lục Halimeda incrassata Lamx Trên phổ ion âm MS- có tín hiệu ion mạnh mang điện tích âm [M-H]- m/z 793,4977 [C41H77O12 S]- Công thức phân tử xác định C41H78O12S Ion âm lựa chọn để bắn phá MS2(hình 4.18) 17 Hình 4.18 HPLC-HRMS phân mảnh SQDG 32:0 [C41H78O12S]; (a) Sắc kí đồ HPLC [C41H77O12S]-; (b) Phổ khối (MS-) [C41H77O12S]-; (c) Phổ khối (MS2-) m/z 793,4977 Trên phổ MS2- (hình 4.18-c) xuất đồng thời tín hiệu m/z 537,2656 tương ứng với ion [C25H45O10S]- ion [M-H]- phân tử trung hòa m/z 256,2321 axit béo 16:0 [C16H32O2] tín hiệu m/z 255,2286 tương ứng với giá trị mảnh anion axit béo 16:0 [C16H31O2]- Như vậy, với kiện phổ khối MS2- cho thấy dạng phân tử SQDG 32:0 16:0/16:0 Bằng cách tương tự, xác định dạng phân tử glycolipid lại rong biển Nhận xét: Một số nghiên cứu khác cho thấy, hợp chất SQDG 32:0 30:0 (diacyl tương ứng 16:0/16:0 14:0/16:0) thể hoạt tính kháng virut, kháng khuẩn Nghiên cứu Wang cộng ra, SQDG 32:0 (16:0/16:0) có hoạt tính kháng virut HSV (antiviral) Vì hai dạng phân tử có hàm lượng cao lớp chất SQDG loài rong Lục Halimeda incrassata Lamx với hàm lượng tương ứng 36,58% 29,47% nên phân lớp glycolipid cho tiềm hoạt tính kháng virut tốt 18 • Xác định dạng phân tử DGTS 34:3 có Rt= 4,71 phút hàm lượng cao 12,56% phân lớp betaine lipid rong Lục Halimeda incrassata Lamx Trên phổ ion dương MS+, tín hiệu mạnh [M+H]+ có giá trị m/z 734,5857 tương ứng cơng thức ion [C44H80NO7]+ (hình 4.20b) Trên phổ MS2+ (hình 4.20c) thu tín hiệu m/z 506,3562 tương ứng với mảnh phân tử trung hòa bị m/z 228,2295 [C14H28O2] (axit béo 14:0) Hình 4.20 HPLC-HRMS phân mảnh DGTS 34:3 [C44H80NO7]+; (a) Sắc kí đồ HPLC [C44H80NO7]+, (b) Phổ khối MS+ [C44H80NO7]+; (c) Phổ khối MS2+ m/z 734,5857 Bên cạnh đó, tín hiệu m/z 428,3346, tương ứng với mảnh phân tử axit béo bị m/z 306,2511 [C20H34O2] (phân tử axit béo 20:3) Sự phân mảnh m/z 236,1668 [C10H22NO5]+ tín hiệu quan trọng việc xác định dạng phân tử DGTS Do đó, DGTS 34:3 xác định đặc trưng diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine DGTS 14:0/20:3 Ngồi tín hiệu m/z 496,3571 m/z 19 478,3535 thu ion [M+H]+ mảnh phân tử trung hòa keten axit béo 16:0 có m/z 238,2286 [C16H30O] (axit béo 16:0 phân tử nước) m/z 256,2322 [C16H32O2] (axit béo 16:0) Đồng thời MS2+ xuất hai tín hiệu m/z 474,3801 m/z 456,3654, tương ứng với mảnh phân tử trung hòa bị m/z 260,2056 keten [C18H28O] (axit béo 18:3 phân tử nước) m/z 278,2203 [C18H30O2] (axit béo 18:3) Như vậy, giá trị khối lượng ion [M+H]+ có m/z 734,5857, chúng tơi xác định hai dạng phân tử đồng phân gồm DGTS 14:0/20:3 DGTS 16:0/18:3, DGTS 16:0/18:3 chiếm hàm lượng Kiểm tra GC, GC-MS thành phần axit béo lipid tổng phân đoạn lipid phân cực loài rong Lục Halimeda incrassata Lamx DGTS 14:0/20:3n-3 16:0/18:3n-3 Bằng cách tương tự, xác định dạng phân tử betaine lipid lại rong biển Nhận xét: Một số nghiên cứu nhóm DGTS phân lớp betaine lipid có khả thay cho nhóm PC màng ngồi lục lạp Như vắng mặt nhóm PC lồi rong Lục Halimeda incrassata Lamx hợp lý phân lớp betaine lipid phát nhóm DGTS với 17 dạng phân tử 4.4 Kết đánh giá hoạt tính sinh học 4.4.1 Hoạt tính bẫy gốc tự Ở nồng độ 200 g/mL tất phân đoạn lipid thể hoạt tính “bẫy” gốc DPPH thấp với mức 16,27-26,36% Điều chứng tỏ phân đoạn lipid loài rong Lobophora sp Halimeda incrassata Lamx bền oxy hóa, cơng bố trước 20 độ bền oxy hóa phân đoạn lipid rong biển axit béo omega-3 glycolipid thể rõ nét đặc tính 4.4.2 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Tất phân đoạn kháng số chủng vi sinh vật kiểm định P aeruginosa, F oxysporum, S aureus, E coli, A niger giá trị MIC 150 200 g/mL Trong mẫu rong Lục Halimeda incrassata (TSL), phân đoạn lipid phân cực (Pol) thể hoạt tính kháng vi khuẩn P.aeruginosa, phân đoạn lipid trung tính (NPL) kháng nấm mốc F oxysporum phân đoạn lipid tổng (TL) kháng vi khuẩn Gram (+) S aureus Trong mẫu rong Nâu Lobophora sp (1KT), phân đoạn lipid tổng (TL) kháng tốt chủng vi khuẩn E coli nấm mốc A niger, phân đoạn lipid trung tính (NPL) thể hoạt tính kháng nấm mốc A niger, phân đoạn lipid phân cực (Pol) kháng vi khuẩn E coli 4.4.3 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư Ở nồng độ 100 g/mL có phân đoạn lipid phân cực Lobophora sp có tác dụng gây độc dòng tế bào SK-LU-1, MCF7 Hep G2 với mức độ ức chế phát triển tương ứng 44,94, 49,97 48,41 Phân đoạn lipid phân cực Halimeda incrassata Lamx ức chế 42,5% phát triển dòng tế bào MCF7 Các phân đoạn lipid lồi rong có tác dụng chống ung thư theo chế khác, chẳng hạn sulfolipid (R-12) thuộc nhóm SQDG (SQDG 16:0/20:5) Ohta cộng phân lập, hợp chất có lipid phân cực loài Lobophora sp Halimeda incrassata Lamx với hàm lượng tương ứng 2,3 2,1% có tác dụng ức chế hoạt động enzim polymerase TdT với IC50 1-2 µg/ml 7,5 µg/ml 21 4.4.4 Hoạt tính kháng viêm Được đánh giá in vitro qua ức chế sản sinh NO dòng tế bào RAW 264.7 bị kích thích LPS Kết thử nghiệm cho thấy phân đoạn lipid loài rong biển Lobophora sp Halimeda incrassata Lamx ức chế tốt sản sinh NO với giá trị IC50 52,1- 66,21 µg/mL 32,57- 41,66 µg/mL (chất đối chứng dương L-NMMA có IC50 8,90 µg/mL) Bảng 4.26 Kết xác định hoạt tính kháng viêm Nồng độ (µg/mL) 100 20 0,8 IC50 100 20 0,8 IC50 TL (1KT % ức chế NO % tế bào sống 80,93 96,06 15,25 99,47 5,86 -2,82 61,09±6,06 TL (TSL) 74,68 94,96 35,06 102,75 12,66 1,61 41,66±1,95 - PoL (1KT) % ức chế NO % tế bào sống 69,07 97,29 18,47 98,00 4,66 -1,29 66,21±6,24 PoL (TSL) 79,22 98,99 37,99 101,55 23,05 5,04 32,57±3,75 - NPL (1KT) % ức chế NO % tế bào sống 84,75 98,24 20,76 102,00 7,20 -3,61 52,10±4,43 NPL (TSL) 76,30 97,93 39,61 100,90 24,03 10,75 33,59±3,86 Hầu hết nghiên cứu lâm sàng sử dụng axit béo omega-3 omega-6 nằm lớp chất triglyceride etyl este Tuy nhiên gần đây, sản phẩm có nguồn gốc từ sinh vật biển giàu axit béo omega3 omega6 nằm phân lớp lipid phân cực có tính bền oxy hóa nên tốt hẳn dạng axit béo tự SQDG 28:0 MGDG 28:0 (14:0/14:0) có tác dụng ức chế protein gây viêm kết hợp với omega-3 để điều trị phục hồi tế bào sụn khớp lipid phân cực ngày thu hút quan tâm nhà nghiên cứu lợi ích bật chúng với sức khỏe 22 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đây cơng trình sàng lọc tồn diện lipid axit béo 60 mẫu thuộc 50 loài rong biển Việt Nam 1.1 Hàm lượng lipid tổng phần lớn dao động khoảng 0,35 - 0,58% (tính theo khối lượng tươi) Một số mẫu có hàm lượng cao vượt trội Sargassum paniculatum J Ag (1,7%), Gracilaria tenuistipitata Chang & Xia (1,6%), Turbinaria ornata (Turn.) J Ag (1,49%), Chnoospora implexa J Ag (1,34%), Hypnea fragelliformis Grev (1,1%) Lobophora sp (1,06%) 1.2 Kết phân tích lipid Sorbfil TLC Videodensitometer cho thấy phần lớn lipid rong biển gồm lớp chất: lipid phân cực (Pol), sterol (ST), axit béo tự (FFA), triacylglycerol (TG), hydrocacbon sáp (HW), Pol TG có hàm lượng cao 1.3 Hàm lượng, thành phần lipid tổng axit béo phụ thuộc vào chất sinh học loài, điều kiện sinh trưởng thời gian thu mẫu Lồi Hypnea panosa J Ag có tượng bất thường mẫu thu Côn Đảo với hàm lượng DHA lên tới 43,69% lipid tổng 1.4 Hàm lượng tổng axit béo no (∑SFA) phần lớn dao động từ 38 - 55%, axit béo không no nối đôi (∑MUFA) 20 - 28%, axit béo không no đa nối đôi (∑PUFA) 12 - 25% Một số mẫu có hàm lượng PUFA cao vượt trội Palisada parvipapillata (C K Tseng) K W Nam (63,89%, EPA 33,58% AA 23,4%), Lobophora sp (59,98% DHA 14,26%, EPA 11,56% AA 12,14%) 90% mẫu rong biển (53/60) có lipid vượt tiêu chuẩn WHO số omega-3/omega-6 tốt cho sức khỏe (>0,1) Bằng phép phân tích PCA liệu axit béo xác định axit béo dấu hoá học phân loại rong biển theo ngành Các axit béo C16:1n-7, C18:1n-9 C20:4n-6 đặc trưng cho ngành rong Nâu; C15:0, C16:0 C18:0 đặc trưng cho ngành rong Đỏ axit béo C18:3n-6 C18:1n-7 đặc trưng cho ngành rong Lục 23 Lipid phân cực Lobophora sp chiếm khoảng 27,5% lipid tổng Đã xác định 158 dạng phân tử bao gồm 48 dạng phân tử phospholipid thuộc nhóm PI (11), PC (14), PG (22) PA (1); 46 dạng phân tử glycolipid thuộc nhóm MGDG (9), DGDG (1) SQDG (36); 64 dạng phân tử betaine lipid thuộc nhóm DGTA (37) DGTS (27) Trong phân lớp glycolipid hàm lượng axit béo không no giảm dần theo trật tự MGDG > DGDG > SQDG Trừ hợp chất SQDG 14:0/16:0, 16:0/16:0 16:0/18:1n-9, dạng phân tử lipid phân cực lại lần công bố chi Lobophora Lipid phân cực loài Halimeda incrassata Lamx chiếm khoảng 33,7% lipid tổng Đã xác định 64 dạng phân tử gồm 07 dạng phân tử phospholipid thuộc nhóm PI (3) PG (4); 40 dạng phân tử glycolipid thuộc nhóm MGDG (12), DGDG (11) SQDG (17) 17 dạng phân tử betaine lipid thuộc nhóm DGTS Đây nghiên cứu dạng phân tử lipid phân cực rong biển thuộc chi Halimeda Các dạng phân tử SQDG 20:5/22:6 SQDG 20:4/22:6 lần phát rong biển Kết thử hoạt tính sinh học cho thấy tất phân đoạn lipid Lobophora sp Halimeda incrassata Lamx ức chế tốt sản sinh NO dòng tế bào RAW 264.7 bị kích LPS với giá trị IC50 tương ứng 52,1- 66,22 g/ml 32,57 - 41,66 g/mL Kết hợp với tính bền oxy hóa cao tác dụng kháng số chủng vi sinh vật kiểm định, lipid hai lồi rong biển dùng cho sản phẩm dinh dưỡng, dược mỹ phẩm Các kết luận án không liệu điều tra rong biển Việt Nam, trợ giúp cho lĩnh vực phân loại rong biển, mối tương quan đa dạng loài đa dạng hóa học mà cịn sở khoa học để định hướng bảo tồn, nuôi trồng sử dụng hiệu KIẾN NGHỊ Nghiên cứu sử dụng lipid Lobophora sp Halimeda incrassata Lamx tạo sản phẩm dinh dưỡng, dược mỹ phẩm 24 Cần nghiên cứu tiếp số lồi có triển vọng Sargassum paniculatum J Ag., Palisada parvipapillata (C K Tseng) K W Nam tìm hiểu nguyên nhân hàm lượng DHA cao vượt trội mẫu thuộc loài Hypnea panosa J.Ag thu Côn Đảo Tiếp tục nghiên cứu lipid phân cực lồi có hàm lượng lipid phân cực cao giàu omega-3, omega-6 NHỮNG ĐÓNG GĨP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đây cơng trình sàng lọc toàn diện lipid axit béo 50 loài rong Đỏ, rong Nâu rong Lục vùng biển đảo Việt Nam Đã phát lồi Hypnea panosa J.Ag thu Cơn Đảo có hàm lượng DHA lên tới 43,69% lipid tổng mẫu thu Nha Trang khơng có hoạt chất Đã xác định axit béo sử dụng dấu hóa học phân loại rong biển theo ngành Là cơng trình nghiên cứu dạng phân tử lipid phân cực loài rong biển thuộc chi Lobophora Đã xác định 158 dạng phân tử lipid phân cực lồi Lobophora sp có 155 dạng phân tử lần cơng bố lồi rong biển thuộc chi Lobophora Là cơng trình nghiên cứu dạng phân tử lipid phân cực loài rong biển thuộc chi Halimeda Các dạng phân tử SQDG 20:5/22:6 SQDG 20:4/22:6 lần phát rong biển Các phân đoạn lipid loài Lobophora sp Halimeda incrassata Lamx lần đánh giá tác dụng ức chế sản sinh NO dòng tế bào RAW 264.7 bị kích thích LPS 25 DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ Pham Thu Hue, Nguyen Van Tuyen Anh, Nguyen Thi Cam Binh, Dam Duc Tien, Le Tat Thanh, Pham Quoc Long, Research on the content of lipid classes and fatty acids from Sargassum seaweed, the 6th Asian Symposium on Advanced Materials: Chemistry, Physics and Biomedicine of Functional and Novel Materials, Hanoi-Vietnam, September 27-30th, 2017, pp 577-582 Thu Hue Pham, Van Tuyen Anh Nguyen, Thi Thanh Trung Do, Anh Duy Do, Duc Tien Dam, Thi Thanh Van Tran, Quoc Long Pham and Tat Thanh Le, Lipidomics and anti-inflammation activity of the brown algae Lobophora sp in Vietnam, Journal of Chemistry, 2020, 10 pages, ISSN: 2090-9063 (SCI-E,Q2), DOI:https://doi.org/10.1155/2020/8829054 Pham Thu Hue, Nguyen Van Tuyen Anh, Do Thi Thanh Trung, Pham Quoc Long, Dam Duc Tien, Tran Thi Thanh Van, Le Tat Thanh, Lipid, fatty acid composition and molecular species of betaine lipid in the green algae Halimeda incrassata Lamx collected from Truong Sa archipelago, Vietnam J Chem., 2021, 59(3), 369-375 (Scopus), DOI: 10.1002/vjch.202000201 Le Tat Thanh, Nguyen Van Tuyen Anh, Pham Thu Hue, Molecular species of glycolipid and anti- inflamation activity of lipid fractions in the green algae Halimeda incrassata Lamx collected from Truong Sa, Viet Nam, Vietnam J Chem., 2021, 59(5), 640-648 (Scopus), DOI: 10.1002/vjch.202100027 Thu Hue Pham, Van Tuyen Anh Nguyen, Thi Hoang Yen Kieu, Le My Anh Nguyen, Hai Nam Hoang, Quoc Long Pham, Duc Tien Dam, Thi Thanh Van Tran, Tat Thanh Le, Content and composition of lipid classes, fatty acid from Sargassum seaweed collected at Con Dao and Van Phong bay, Vietnam Journal of Marine Science and Technology, 2021, 21(2), 1–8, ISSN 1859-3097, DOI: https://doi.org/10.15625/1859-3097/15942 Pham Thu Hue, Nguyen Van Tuyen Anh, Pham Quoc Long, Le Tat Thanh, Studying on phospholipid molecular species of the green seaweed Halimeda incrassata Lamx from Truong Sa in Vietnam, Vietnam Journal of Marine Science and Technology, 2021, Vol 21(1),1–8, ISSN 1859-3097, DOI: https://doi.org/10.15625/1859-3097/15939 Le Tat Thanh, Pham Thu Hue, Nguyen Van Tuyen Anh, Dam Duc Tien, Study on using fatty acid data in the botanical chemotaxonomy for Vietnamese seaweed species, Viet Nam Journal of Biotechnology, 2021, 19(2), 371-379 ... án? ?Nghiên cứu thành phần hoạt tính sinh học lipid số loài rong biển Việt Nam? ?? 2 Mục tiêu nghiên cứu luận án Tiếp cận hướng nghiên cứu đại, xây dựng liệu điều tra rong biển Việt Nam, trợ giúp cho... trò rong biển hệ sinh thái biển, phân loại phân bố rong biển Việt Nam Giới thiệu hai chi Lobophora, Halimeda nghiên cứu thành phần hóa học 1.2 Lipid rong biển Giới thiệu chung lipid lipid rong biển, ... giới đến có số lồi rong biển nghiên cứu công bố dạng phân tử lipid phân cực Tại Việt Nam, lipid rong biển nghiên cứu hóa sinh túy theo cách truyền thống Tiếp cận hướng nghiên cứu đại lipid phân