Sự lưu hành các chủng phổ biến và gen độc lực STX2, EAE của vi khuẩn Escherichia coli phân lập trên gà tại huyện Tam Bình tỉnh Vĩnh Long

Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định sự lưu hành các chủng E. coli phổ biến và gene độc lực stx2, eae của vi khuẩn E. coli trên 227 mẫu phân gà được thu thập tại trang trại, hộ nuôi và chợ tại huyện Tam Bình tỉnh Vĩnh Long từ tháng 08/2020 đến tháng 12/2020. Bằng phương pháp phân lập và PCR, đã xác định được tỷ lệ dương tính của E. coli tại trang trại, nông hộ và chợ lần lượt là 67,82%, 76,25% và 75,00%.

KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ - 2021 SỰ LƯU HÀNH CÁC CHỦNG PHỔ BIẾN VÀ GENE ĐỘC LỰC STX2, EAE CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TRÊN GÀ TẠI HUYỆN TAM BÌNH TỈNH VĨNH LONG Nguyễn Khánh Thuận*, Lâm Ngọc Điệp, Tiêu Hồng Phúc, Lý Thị Liên Khai *Email: nkthuan@ctu.edu.vn Bộ môn Thú y, Khoa Nơng nghiệp, trường Đại học Cần Thơ TĨM TẮT Nghiên cứu thực nhằm xác định lưu hành chủng E coli phổ biến gene độc lực stx2, eae vi khuẩn E coli 227 mẫu phân gà thu thập trang trại, hộ ni chợ huyện Tam Bình tỉnh Vĩnh Long từ tháng 08/2020 đến tháng 12/2020 Bằng phương pháp phân lập PCR, xác định tỷ lệ dương tính E coli trang trại, nơng hộ chợ 67,82%, 76,25% 75,00% Trong tổng số 165 mẫu dương tính với E coli, chủng O78 chiếm 20,61%, chủng O1 (17,58%), chủng O18 (16,36%) Các kiểu ghép chủng E coli gà xác định nghiên cứu O1+O18 (12,22%), O1+O78 (8,89%), O18+O78 (4,44)% O1+O18+O78 (3,33%) Kết khảo sát gene độc lực cho thấy, gene stx2, eae diện chủng E coli định danh với tỷ lệ 34,44% 8,89% Kết cho thấy có diện E coli chủng O1, O18, O78 mang gene độc lực nguy hiểm địa điểm nghiên cứu, chủng có khả gây bệnh người vật ni Từ khóa: E coli, gene độc lực, PCR, serotype, Vĩnh Long Prevalence of common serotypes and pathogenic genes stx2, eae of Escherichia coli isolated from chickens in tam binh, vinh long province Nguyen Khanh Thuan, Lam Ngoc Diep, Tieu Hong Phuc, Ly Thi Lien Khai SUMMARY The study was conducted to determine the prevalence of common serotypes and pathogenic gene stx2, eae of E coli on 227 chicken fecal samples collected at farms, households and retail markets in Tam Binh, Vinh Long province from August 2020 to December 2020 By isolation and PCR methods, the positive rates of E coli at the farms, households and retail markets were determined as 67.82%, 76.25% and 75.00%, respectively Of 165 positive samples for E coli, serotype O78 accounted for 20.60%, followed by serotype O1 (17.58%), serotype O18 (16.36%) The combined serotypes of E coli isolated from chickens in this study included O1 + O18 (12.22%), O1 + O78 (8.89%), O18 + O78 (4.44%), and O1 + O18 + O78 (3.33%) The survey on pathogenic genes showed that the stx2 and eae genes were present in identified E coli isolates at 34.44% and 8.89% respectively The results exhibited that E coli serotypes of O1, O18, O78 haboring pathogenic genes were frequently present on chickens in this area; and these strains are capable of causing disease in humans and animals Keywords: E coli, PCR, Vinh Long, virulent gene, serotype Vinh Long province 39 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ - 2021 I ĐẶT VẤN ĐỀ Trên động vật, bệnh E coli (Colibacillosis) thường xảy đường ruột đường tiết niệu; gia cầm, thường bệnh cục hay tồn thân nhiễm trùng huyết, viêm nỗn hồng, hội chứng sưng đầu hệ miễn dịch vật chủ suy yếu bị lấn át chủng E coli độc lực (Barnes, 2000) Ngoài ra, yếu tố gây bệnh khác virus, loài vi khuẩn khác, ký sinh trùng, dinh dưỡng ảnh hưởng đến tính nhạy cảm gà vi khuẩn E coli gây bệnh E coli loài vi khuẩn phức tạp, có 186 kháng nguyên O, 60 kháng nguyên H, 80 kháng nguyên K phát (Fratamico cs., 2016) Nhiều khảo sát thực nhằm xác định chủng E coli thường xuyên gây bệnh gia cầm, hầu hết nghiên cứu cho kết có diện chủng O1, O18 O78 (Heller Drabkin, 1977) Barbieri cs (2015) ghi nhận kiểu huyết phổ biến thường xác định gà khỏe gà bệnh O1, O2, O18, O35, O36, O78 O111 Trong số đó, chủng O1, O2, O18 O78 có liên quan đến đợt bùng phát dịch bệnh, chiếm 50% chủng E coli gây gia cầm (Ewers cs., 2003; 2004) Tại Việt Nam, diện chủng O1, O18 O78 phổ biến (Tô Minh Châu cs., 2002) Ngồi ra, gene độc lực đóng vai trò quan trọng khả gây bệnh chủng E coli Eid cs (2016) nghiên cứu Ai Cập Paixao cs (2016) nghiên cứu Bồ Đào Nha ghi nhận diện cao gene stx2, eae chủng E coli phân lập đàn gà quốc gia Do đó, việc sớm phát chủng E coli gene độc lực chúng đóng vai trị quan trọng chẩn đốn, điều trị kiểm sốt dịch bệnh Tại Đồng Bằng sơng Cửu Long, Tam Bình huyện có đàn gà lớn tỉnh Vĩnh Long; nhiên, nghiên cứu chủng vi khuẩn E coli diện đàn gà mức độ nguy hiểm chủng cịn hạn chế Vì vậy, nghiên cứu thực 40 nhằm xác định diện chủng vi khuẩn E coli phổ biến diện hai gene độc lực stx2 eae đàn gà Qua đó, cung cấp thơng tin dịch tễ cần thiết việc kiểm sốt phòng trị bệnh E coli gây gà, người II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu - Xác định tỷ lệ lưu hành chủng vi khuẩn E coli (O1, O18, O78) gà nông hộ, trang trại, chợ thuộc huyện Tam Bình, Vĩnh Long - Xác định tỷ lệ lưu hành gene độc lực stx2, eae chủng E coli phân lập gà định danh 2.2 Vật liệu nghiên cứu Điều tra cắt ngang thực với tổng số mẫu dự kiến tính theo cơng thức Thrusfield (2018) tỷ lệ lưu hành E coli O1 gà thịt 14,8% (Ibrahim cs., 2019) Tổng số mẫu phân gà dự kiến thu thập 194 mẫu Tuy nhiên, khảo sát tổng số 227 mẫu phân gà lấy ngẫu nhiên hộ (80 mẫu), trại (87 mẫu), chợ bán lẻ (60 mẫu) huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long Gà lấy mẫu gà khoẻ, tất lứa tuổi, giống trình khảo sát cắt ngang 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn E coli từ mẫu phân gà Phân từ gà khỏe thu thập mẫu swab trực tiếp từ trực tràng gà, cho vào ống môi trường chuyên chở Carry Blair (Nam Khoa, Việt Nam) ghi sẵn ký hiệu, ngày tháng lấy mẫu Mẫu bảo quản điều kiện lạnh 2-8oC, đưa phịng thí nghiệm phân tích 24 Phương pháp phân lập thực theo TCVN 5155-1990 hướng dẫn Barrow and Feltham (2003) Chọn tất khuẩn lạc điển hình vi khuẩn E coli môi trường MacConkey KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ - 2021 (Merck, Đức) cấy lại môi trường MC, ủ 37oC 24 Những khuẩn lạc nghi ngờ kiểm tra sinh hóa để khẳng định vi khuẩn E coli môi trường Kligler Iron Agar (KIA, Merck, Đức), phản ứng Indole, phản ứng Methyl Red (MR, Merck, Đức), phản ứng Voges - Proskauer (VP, Merck, Đức), phản ứng Simmon’s Citrate (Merck, Đức) 2.3.2 Định danh vi khuẩn E coli O1, O18, O78 phương pháp PCR Ly trích DNA Các chủng E coli khẳng định sau kiểm tra sinh hóa, tăng sinh môi trường Tryptycase soy agar (TSA, Merck, Đức) ly trích DNA phương pháp shock nhiệt Soumet et al (1994) DNA khuôn mẫu sau ly trích trữ -20°C Thực phản ứng PCR Phản ứng PCR sử dụng kit Mastermix 2X (Promega, Mỹ) với tổng thể tích 25µl: Mastermix 2X (12,5µl), mồi xi (F: 0.5µl), mồi ngược (R: 0,5µl), nước tinh khiết (9,5µl), DNA (2 µl) Chu trình nhiệt thực phản ứng PCR: tiền biến tính (95oC, phút); 30 chu kỳ: biến tính (94oC, 35 giây), gắn mồi (57oC, 30 giây), kéo dài (72oC, 40 giây); kết thúc (72oC, 10 phút) Trình tự nucleotide cặp primer sử dụng nghiên cứu thể qua Bảng Bảng 1: Trình tự nucleotide cặp mồi xác định chủng O1, O18 O78 Chủng Trình tự primer (5’-3’) O1 F: CGATGTTGAGCGCAAGGTTG R: CATTAGGTGTCTCTGGCACG O18 F: CGATGTTGAGCGCAAGGTTG R: AGAAGCATTGAGCTGTGGAC O78 F: CGATGTTGAGCGCAAGGTTG R: TAGGTATTCCTGTTGCGGAG Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1,5%, nhuộm với Safeview (ABM, Canada), hiệu điện 50V 60 phút; đọc kết chụp ảnh gel ánh sáng UV để xác định diện gene mã hoá Mẫu đối chứng dương: DNA vi khuẩn E coli O1, O18, O78; mẫu đối chứng âm: nước tinh khiết Kích thước Tài liệu tham khảo 263 bp 459 bp Wang et al., 2014 623 bp không chứa enzyme DNA RNA 2.3.3 Phương pháp xác định gene độc lực stx2, eae vi khuẩn E coli phương pháp PCR Quy trình thực tương tự phương pháp định danh vi khuẩn E coli với trình tự nucleotide primer trình bày qua Bảng Bảng 2: Trình tự nucleotide cặp mồi xác định gene stx2 eae Gene Trình tự primer (5’-3’) eae F: GCGCGTTACATTGACTCCCG R: CCATTTGCTGGGCGCTCATC stx2 F: CCCGGGAGTTTACGATAGAC R: ACGCAGAAGTGCTCTGGATG Kích thước Tài liệu tham khảo 245 bp Chassagne et al., 2009 428 bp Yoshitomi et al., 2006 41 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ - 2021 Chu trình nhiệt thực phản ứng PCR: tiền biến tính (95oC, phút); 30 chu kỳ: biến tính (95oC, 35 giây), gắn mồi (54oC, 45 giây), kéo dài (72oC, 40 giây); kết thúc (72oC, phút) Mẫu đối chứng dương: DNA vi khuẩn E coli mang gee stx2 eae; mẫu đối chứng âm: nước tinh khiết không chứa enzyme DNA RNA 2.4 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thu thập xử lý phần mền Excel 2010 Phân tích tỷ lệ phép thử Chi-square Test phần mềm Minitab 16 (ở mức ý nghĩa 5%) III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân lập vi khuẩn E coli gà huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long Tổng số 227 mẫu phân gà khoẻ phân tích để xác định tỷ lệ diện vi khuẩn E coli Kết phân lập trình bày qua Bảng Bảng Kết phân lập vi khuẩn E coli gà huyện Tam Bình tỉnh Vĩnh Long Địa điểm Số mẫu khảo sát Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%) Nơng hộ 80 61 76,25a Trang trại 87 59 67,82a Chợ 60 45 75,00a Tổng 227 165 72,69 Các giá trị chữ số mũ cột giống khơng khác có ý nghĩa thống kê (P>0,05) Kết cho thấy tỷ lệ diện vi khuẩn E coli gà huyện Tam Bình tỉnh Vĩnh Long cao với 72,69%; tỷ lệ sai khác khác biệt mặt thống kê địa điểm khảo sát Tỷ lệ E coli vi khuẩn thường trú đường tiêu hóa gà lồi động vật (Tenaillon cs., 2010); nhiên, tỷ lệ lưu hành vi khuẩn E coli gà cịn phụ thuộc vào tình trạng sức khỏe vật Ở nông hộ trang trại, gia cầm nuôi với mật độ cao, vi khuẩn E coli dễ dàng lây lan cho các thể khác đàn thông qua thức ăn, nước uống máng, chất độn chuồng có lẫn phân Ibekwe cs (2007) cho biết sau E coli theo phân bị thải ngoài, chúng tiếp tục sống môi trường chăn nuôi, tồn chuồng 90 ngày, nước uống 30 ngày, điều dễ dẫn đến việc lan truyền vi khuẩn cá thể gà đàn Kết nghiên cứu vi khuẩn E coli gà chợ Hà Nội Trần Thị Hương Giang Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2012) cho biết tỷ lệ dương tính 53,33% 42 3.2 Kết khảo sát chủng E coli phổ biến phân lập gà huyện Tam Bình tỉnh Vĩnh Long Vi khuẩn E coli phân lập xác định chủng phương pháp PCR để xác định lưu hàh chủng phổ biến (O1, O18, O79) gây bệnh cho đàn gà Kết khảo sát diện chủng E coli phổ biến thể qua Bảng Hình Bảng 4: Sự diện chủng E coli phổ biến phân lập gà (n=165) Chủng khảo sát Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%) O1 29 17,58a O18 27 16,36a O78 34 20,61a Tổng 90 54,54 Các giá trị chữ số mũ cột giống khơng khác có ý nghĩa thống kê (P>0,05) KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ - 2021 Hình 1: Kết điện di PCR xác định chủng E coli O1 (263bp) (a), O18 (459bp) (b), O78 (623bp) (c) M: 100bp DNA marker; P: đối chứng dương; N: đối chứng âm; (a): giếng 2, (+), giếng 1, 4, 5, (-); (b): giếng 1, 2, (+), giếng 4, 5, (-); (c): giếng 1, 3, (+), giếng 2,5, (-) Kết phân tích cho thấy có 90 tổng số 165 mẫu dương tính với E coli chủng O1, O18 O78, chiếm tỷ lệ 54,54% Tỷ lệ cao, chủng phổ biến tồn đường ruột gia cầm Barbieri cs (2015) cho có khác mặt địa lý kiểu huyết phổ biến O1, O18, O78 thường ln tìm thấy gia cầm Nghiên cứu Schouler cs (2012) gia cầm Pháp, Bỉ, Tây Ban Nha cho kết 56,50% mẫu phân lập dương tính với O1, O18 O78 Sự phổ biến chủng E coli gà vấn đề cần quan tâm chúng tác nhân ảnh hưởng đến trình phát triển vật nuôi, làm giảm giá trị kinh tế, tác động xấu đến sức khỏe người chăn nuôi tiêu dùng Mặt khác, tỷ lệ diện chủng E coli O1, O18 O78 khác ý nghĩa thống kê (P>0,05) nghiên cứu này; thể phân bố đồng chủng địa điểm nghiên cứu Tỷ lệ diện kiểu huyết không phản ánh yếu tố độc lực vi khuẩn, nên dựa vào thông tin để xác định dự đốn tình hình dịch bệnh cách xác, vấn đề cần nghiên cứu sâu (Ewers cs., 2005) Sự phân bố chủng E coli O1, O18, O78 trang trại, nông hộ chợ phân tích nhằm xác định mơi trường lưu trữ mầm bệnh Kết cho thấy diện chủng E coli địa điểm khảo sát khác biệt có ý nghĩa thống kê (P