ĐINH THỊ lý xây DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI GLYCIN và l CYSTEIN TRONG hỗn hợp BẰNG sắc ký LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dƣợc sĩ

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐINH THỊ LÝ XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI GLYCIN VÀ L-CYSTEIN TRONG HỖN HỢP BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2021 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐINH THỊ LÝ Mã sinh viên: 1601493 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI GLYCIN VÀ L-CYSTEIN TRONG HỖN HỢP BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Thuận Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa Dƣợc, Đại học Dƣợc Hà Nội HÀ NỘI – 2021 LỜI CẢM ƠN Lời xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc đến PGS.TS.Nguyễn Thị Thuận - giảng viên mơn Hóa Dƣợc, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn tơi q trình nghiên cứu khoa học mơn hồn thành khóa luận Đồng thời tơi muốn gửi lời cảm ơn đến PGS.TS.Nguyễn Ngọc Chiến-Viện Công nghệ Dƣợc phẩm Quốc gia thầy cô, cán kỹ thuật viên mơn Hố Dƣợc Viện Cơng nghệ Dƣợc phẩm Quốc Gia quan tâm giúp đỡ tạo điều kiện để tơi hồn thành khóa luận Nhân dịp xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu nhà trƣờng, thầy cô giảng dạy giúp đỡ để trau dồi kiến thức kinh nhiệm trình học tập trƣờng Cuối gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè ln động viên, chia sẻ ủng hộ Đặc biệt anh Dƣơng Tiến Anh, bạn Trần Thị Huyền Trang, em Bùi Văn Sơn, Phạm Thị Thu Trang, Nguyễn Bình Minh Phạm Quỳnh Mai giúp đỡ tơi q trình làm khóa luận Do lực thân có hạn nên đề tài khơng tránh khỏi cịn nhiều thiếu sót, tơi mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp để hoàn thiện nghiên cứu Hà Nội, ngày 31 tháng 05 năm 2021 Sinh viên Đinh Thị Lý MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Các acid amin 1.2 Glycin L-cystein 1.2.1 Glycin 1.2.2 L-cystein 1.2.3 Glycin L-cystein hỗn hợp 1.3 Một số phƣơng pháp định lƣợng acid amin glycin, L-cystein 1.3.1 Một số phương pháp định lượng acid amin 1.3.2 Một số phương pháp định lượng glycin L-cystein CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị đối tƣợng nghiên cứu 11 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 11 2.1.2 Nguyên vật liệu, dung mơi hóa chất 11 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 12 2.2 Nội dung nghiên cứu 12 2.2.1 Khảo sát xây dựng phương pháp phân tích 12 2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích 12 2.2.3 Ứng dụng phương pháp thẩm định để định lượng glycin Lcystein hỗn hợp 12 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 12 2.3.1 Chuẩn bị mẫu phân tích 12 2.3.2 Khảo sát xây dựng phương pháp phân tích 13 2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 13 2.3.4 Ứng dụng phương pháp 16 2.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 16 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 17 3.1 Khảo sát xây dựng phƣơng pháp 17 3.1.1 Khảo sát bước sóng phát 17 3.1.2 Khảo sát pH đệm phosphat, tỷ lệ pha động 18 3.2 Thẩm định phƣơng pháp 19 3.2.1 Độ phù hợp hệ thống 19 3.2.2 Độ chọn lọc 20 3.2.3 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 21 3.2.4 Độ 22 3.2.5 Độ xác (độ lặp lại độ xác trung gian) 24 3.3 Áp dụng định lƣợng glycin L-cystein hỗn hợp 26 3.4 Bàn luận 27 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 4.1 Kết luận 29 4.2 Kiến nghị 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Chú thích ACN Acetonitril C18 Octadecylsilan HILIC Sắc ký lỏng tƣơng tác thân nƣớc HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao HQC Mẫu kiểm tra nồng độ cao IP Cặp ion Ka Hằng số phân ly acid LC-MS/MS Sắc ký lỏng kết hợp với khối phổ song song LQC Mẫu kiểm tra nồng độ thấp M mol/lít MeOH Methanol MQC Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình pI Điểm đẳng điện QC Kiểm tra chất lƣợng R Hệ số tuyến tính RSD Độ lệch chuẩn tƣơng đối Spic Diện tích pic TLTK Tài liệu tham khảo tR Thời gian lƣu UPLC Sắc ký lỏng siêu cao áp UV Tử ngoại v/v Thể tích/ thể tích VIS Khả kiến DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Các phƣơng pháp định lƣợng glycin L-cystein HPLC Bảng 2.1 Qui trình pha mẫu chuẩn hỗn hợp 15 Bảng 3.1 Kết độ phù hợp hệ thống 19 Bảng 3.2 Kết khảo sát độ tuyến tính 21 Bảng 3.3 Độ thu hồi Glycin 22 Bảng 3.4 Độ thu hồi L-cystein 23 Bảng 3.5 Độ xác ngày khác ngày 24 Bảng 3.6 Độ xác ngƣời khác ngƣời phân tích 25 Bảng 3.7 Kết định lƣợng Glycin L-cystein hỗn hợp 26 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo tổng quát acid amin Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo Glycin Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo L-cystein Hình 3.1 Phổ xác định bƣớc sóng hấp thụ mẫu chuẩn Glycin 17 Hình 3.2 Phổ xác định bƣớc sóng hấp thụ mẫu chuẩn L-cystein 17 Hình 3.3 Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp pH đệm 4,0 98% đệm 18 Hình 3.4.Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp pH đệm 4,0 100% đệm 18 Hình 3.5 Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp pH đệm 3,0 95% đệm 18 Hình 3.6 Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp pH đệm 3,0 98% đệm 18 Hình 3.7 Sắc ký dồ thẩm định tính chọn lọc 20 Hình 3.8 Đồ thị biểu thị mối tƣơng quan tuyến tính diện tích pic nồng độ Glycin, L-cystein 21 ĐẶT VẤN ĐỀ Acid amin có vai trị quan trọng, thành phần cấu tạo nên protein khác nhau, đảm nhiệm nhiều vai trò chức hoạt động sống thể Ngoài ra, acid amin cịn có tác dụng tổng hợp nên loại nội tiết tố chất dẫn truyền thần kinh cần thiết để hỗ trợ cho q trình sinh hóa thể Do acid amin thƣờng đƣợc sử dụng làm thành phần sản xuất thực phẩm bổ sung chất dinh dƣỡng điều trị suy nhƣợc thể Có sản phẩm đơn chất có sẵn thị trƣờng nhƣng thƣờng acid amin đƣợc kết hợp với Ngồi chúng cịn đƣợc phối hợp chế phẩm điều trị với mục đích khác [11], [16], có glycin L-cystein đƣợc phối hợp thuốc tiêm để làm giảm tác dụng phụ tăng aldosteron amoni glycyrrhizat, hỗ trợ gan đào thải độc tố Việc kiểm nghiệm acid amin nói chung, glycin, L-cystein nói riêng hỗn hợpbằng sắc ký lỏng pha đảo gặp nhiều khó khăn chúng phân cực, thời gian lƣu cột ngắn Để giải vấn đề dùng phƣơng pháp tạo dẫn chất (trƣớc sau cột) [17] Tuy nhiên phƣơng pháp địi hỏi máy móc phƣơng tiện thích hợp Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao tạo cặp ion giải vấn đề làm giảm tính phân cực acid amin, khiến chúng lƣu trữ cột lâu mà không cần tạo dẫn xuất, phân tích trực tiếp sắc ký pha đảo Vì chúng tơi tiến hành đề tài: “Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng đồng thời Glycin L-cystein hỗn hợp sắc ký lỏng hiệu cao” với hai mục tiêu: Xây dựng thẩm định phƣơng pháp định lƣợng đồng thời glycin L-cystein hỗn hợp HPLC Ứng dụng phƣơng pháp thẩm định để định lƣợng glycin L-cystein hỗn hợp CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Các acid amin  Cấu tạo - Trong thể ngƣời có 20 loại acid amin khác với công thức tổng qt Hình1.1 Cơng thức cấu tạo tổng qt acid amin - Nguyên tử C trung tâm nối với nhóm -NH2 (nhóm amin mang tính kiềm), -COOH (nhóm carboxyl mang tính acid), -R (khác cho acid amin) Trong tự nhiên acid amin tồn chủ yếu dạng L  Tính chất - Tính chất vật lý + Các acid amin mặt lý tính chất rắn kết tinh, có vị ngọt, số có vị đắng + Hầu hết acid amin nóng chảy mức nhiệt độ tƣơng đối cao gần nhau, kèm tƣợng phân hủy + Dễ tan nƣớc amino acid tồn dạng ion lƣỡng cực - Tính chất hóa học + Các acid amin vừa thể tính acid, vừa có tính bazơ nên có khả tác dụng với acid vô cơ, với kiềm để tạo muối tƣơng ứng + Phản ứng trùng ngƣng, tạo polime; phản ứng este hóa  Phân loại Có nhiều cách phân loại acid amin khác nhau, theo quan điểm sinh học, ngƣời ta phân loại acid amin thành hai nhóm: - Acid amin thiết yếu: loại acid amin cần thiết cho thể sinh trƣởng phát triển, thể tự sản xuất đƣợc mà phải bổ sung hàng ngày thông qua chế độ ăn uống Có loại acid amin thiết yếu bao gồm: TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học Bộ Y Tế (2009), Dược thư quốc gia Việt Nam 4, Nhà xuất Y học, Hà Nội Bộ Y Tế (2018), Hướng dẫn ASEAN thẩm định phương pháp phân tích, phụ lục 1- Thông tƣ 32/2018/TT-BYT Quy định việc đăng ký lƣu hành thuốc, nguyên liệu làm thuốc Nguyễn Văn Rƣ Nguyễn Xuân Thắng (2015), Hóa sinh học, Nhà xuất Y học, Hà Nội Tiếng Anh Aasodi RR, Murugan V and Kumari Pand Shree V (2018), "Development of Analytical Method for Separation and Quantification of Cysteine Hydrochloride Monohydrate, Followed by Validation with Total Error Concept by Using Ultra Performance Liquid Chromatography with PreColumn Derivatization", Journal of Chromatography Separation Techniques, 2018, 9(4) AOAC (2016), AOAC official methods of analysis, Appendix F guidelines for standard method performance requirements Biotechnology-Derived Articles- Amino Acid Analysis (1052) Húzhǎnghuā (2015), "Cysteine hydrochloride in acetaminophen injection and test method of degradation product cystine", CN105181859A Ira S Krull (2012), Analytical chemistry, Peptide and Amino Acids Separation and Identification from Natural Products, November 7, 2012 10.Japanese Pharmacopoeia (2016) 11.Kalin Ivanov, Assena Stoimenova, Danka Obreshkova and Luciano Saso (2013), "Biotechnology in the Production of Pharmaceutical Industry Ingredients: Amino Acids", Biotechnology & Biotechnological Equipment, 27(2), pp 3620-3626 12.Pravin Bhandare, P Madhavan, B.M Rao and N Someswar rao (2010), "Determination of amino acid without derivatization by using HPLC - HILIC column", Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 2(2), pp 372380 13.Qing Zhong Li, Qing Xian Huang, Shu Cui Li, Mei Zi Yang and Bin Rao (2012), "Simultaneous Determination of Glutamate, Glycine, and Alanine in Human Plasma Using Precolumn Derivatization with 6-Aminoquinolyl-Nhydroxysuccinimidyl Carbamate and High-Performance Liquid Chromatography", The Korean Journal of Physiology and Pharmacology, Otc, 16(5), pp 355-360 14.Rosa M Latorre, Javier Saurina and Santiago Hernández-Cassou (1999), "Capillary Electrophoresis Method for the Determination of Amino Acids in Pharmaceutical Samples Based on Precolumn Derivatization Using 1,2Naphthoquinone-4-Sulfonate", Journal of Chromatographic Science, volume 37, September 1999, pp 353-359 15.Serena Brundu, Lucia Nencioni, Ignacio Celestino, Paolo Coluccio, Anna Teresa Palamara, Mauro Magnani and Alessandra Fraternale (2016), "Validation of a Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography Method for the Simultaneous Analysis of Cysteine and Reduced Glutathione in Mouse Organs", Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2016 16.Shadi S Yarandi, Vivian M Zhao, Gautam Hebbar and Thomas R Ziegler (2011), "Amino acid composition in parenteral nutrition: what is the evidence?", Curr Opin Clin Nutr Metab Care, Jan, 14(1), pp 75-82 17.Shimadzu "Introduction to HPLC", LC World talk Special, volume 18.Stanislaw Sypniewsky and Edward Bald (1994), "Ion-pair high-performance liquid chromatography of cysteine and metabolically related compounds in the form of their S-pyridinium derivatives", Journal of Chromatography A, 676, 2, August 1994, pp 312-330 19.Thomas D Campbell, Rio Febrian, Holly E.Kleinschmidt , KevinA.Smith and Paul J Bracher (2019), "Quantitative Analysis of Glycine Oligomerization by Ion-Pair Chromatography", ACS Omega 2019, 4, 7, pp 12745-12752 20.Trinidad Pérez-Palacios, Miguel A Barroso, Jorge Ruiz and Teresa Antequera (2015), "A Rapid and Accurate Extraction Procedure for Analysing Free Amino Acids in Meat Samples by GC-MS", International Journal of Analytical Chemistry 21.United States Pharmacopoeia (2018), volume 22.Yusuke Kawano, Maeka Shiroyama, Koji Kanazawa, Yasushi A Suzuki and Iwao Ohtsu (2019), "Development of high-throughput quantitative analytical method for L-cysteine-containing dipeptides by LC–MS/MS toward its fermentative production", AMB Express, 9, Article number: 91 PHỤ LỤC Sắc ký đồ mẫu đƣờng chuẩn Sắc ký đồ mẫu LQC, MQC, HQC Sắc ký đồ mẫu thử PHỤ LỤC 1: SẮC KÝ ĐỒ CÁC MẪU ĐƢỜNG CHUẨN PHỤ LỤC 2: SẮC KÝ ĐỒ CÁC MẪU LQC, MQC, HQC PHỤ LỤC 3: SẮC KÝ ĐỒ CÁC MẪU THỬ ... ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐINH THỊ LÝ Mã sinh viên: 1601493 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI GLYCIN VÀ L-CYSTEIN TRONG HỖN HỢP BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người... tiếp sắc ký pha đảo Vì tiến hành đề tài: ? ?Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng đồng thời Glycin L-cystein hỗn hợp sắc ký lỏng hiệu cao? ?? với hai mục tiêu: Xây dựng thẩm định phƣơng pháp định lƣợng đồng. .. CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết thực nghiệm, đạt đƣợc mục tiêu sau - Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng đồng thời glycin L-cystein hỗn hợp phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao + Xử lý mẫu: