Đánh giá thực trạng phơi nhiễm e coli mang gen kháng kháng sinh phân lập từ thịt lợn tiêu thụ tại hà nội

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Đánh giá thực trạng phơi nhiễm E coli mang gen kháng kháng sinh phân lập từ thịt lợn tiêu thụ Hà Nội BÙI THỊ THU TRANG buithithutrang@dinhduong.org.vn Ngành Công nghệ sinh học Chuyên ngành Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: 1.PGS TS Lê Thanh Hà GS TS Lê Thị Hợp Bộ môn: Công nghệ sinh học Viện: Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 05/2021 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Đánh giá thực trạng phơi nhiễm E coli mang gen kháng kháng sinh phân lập từ thịt lợn tiêu thụ Hà Nội BÙI THỊ THU TRANG buithithutrang@dinhduong.org.vn Ngành Công nghệ sinh học Chuyên ngành Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: 1.PGS TS Lê Thanh Hà GS TS Lê Thị Hợp Bộ môn: Công nghệ sinh học Viện: Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 05/2021 i CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn : Bùi Thị Thu Trang Đề tài luận văn: Đánh giá thực trạng phơi nhiễm E.coli mang gen kháng kháng sinh phân lập từ thịt lợn tiêu thụ Hà Nội Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số SV: CB180028 Tác giả, Người hướng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hội đồng ngày 04/05/2021 với nội dung sau: Chỉnh lỗi tả, viết tắt cần bổ sung Viết tài liệu tham khảo trích dẫn theo quy định Kết luận: viết rút ngắn cho xúc tích (Chi tiết chỉnh sửa bổ sung phần đính kèm) Ngày tháng Giáo viên hướng dẫn năm 2021 Tác giả luận văn CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG ii CHỈNH SỬA, BỔ SUNG THEO Ý KIẾN CỦA HỘI ĐỒNG NGÀY 04/05/2021 -*** - STT Yêu cầu nội dung Giải trình chỉnh sửa Trang Chỉnh lỗi tả, viết tắt cần bổ sung Đã chỉnh sửa lỗi tả tồn phần luận văn, bổ sung thêm từ viết tắt 11-12 Viết tài liệu tham khảo trích dẫn theo quy định Đã chỉnh sửa lại theo quy định 58 - 63 Kết luận viết lại ngắn gọn, rõ ràng, dễ hiểu Đã chỉnh sửa phần kết luận 56- 57 iii LỜI CẢM ƠN Trong thời gian làm luận văn tốt nghiệp, nỗ lực thân, em nhận giúp đỡ tận tình gia đình, đồng nghiệp, thầy cô giáo bạn bè Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Lê Thanh Hà, giảng viên cao cấp, môn Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội; GS TS Thị Hợp, chủ tịch hội Dinh dưỡng Việt Nam, nguyên Viện trưởng Viện Dinh dưỡng Cảm ơn hai cô truyền cho em kiến thức, kinh nghiệm quý báu tận tình hướng dẫn em suốt trình thực khóa luận Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn Dự án VIDA-PIG cán Khoa Vi sinh Thực phẩm Sinh học Phân tử, Viện Dinh dưỡng tạo điều kiện thuận lợi cho em kinh phí chuyên môn kỹ thuật đồng hành em suốt trình thực đề tài Em xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình người thân ủng hộ, động viên, tạo điều kiện cho em suốt thời gian học tập trường Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Người viết báo cáo iv MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ vii DANH MỤC BẢNG BIỂU viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Escherichia coli E coli sinh beta-lactamase phổ rộng ESBL 1.1.1 Giới thiệu vi khuẩn Escherichia coli 1.1.2 Kháng sinh vi khuẩn kháng kháng sinh .6 1.1.3 Cấu trúc phân nhóm β-lactam 1.1.4 Cơ chế phân giải β-Lactam β-Lactamase .10 1.1.5 Phân loại β-lactamase ESBL 11 1.2 Gánh nặng thực trạng vi khuẩn sinh ESBL 15 1.2.1 Gánh nặng bệnh tật vi khuẩn kháng thuốc sinh ESBL 15 1.2.2 Sự phổ biến E.coli sinh ESBL giới 16 1.2.3 Thực trạng vi khuẩn sinh ESBL Việt Nam 19 1.3 Sự lây lan vi khuẩn kháng sinh qua chuỗi thực phẩm 20 1.3.1 Cơ chế Sự lan truyền vi khuẩn kháng thuốc chuỗi thực phẩm .20 1.3.2 Sự lây lan vi khuẩn kháng thuốc chuỗi thực phẩm Việt Nam 22 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1.Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu 24 2.1.1 Thời gian nghiên cứu 24 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 24 2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 24 2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3 Cỡ mẫu nghiên cứu .24 2.4 Phương pháp chọn mẫu .25 2.5 Cách lấy mẫu 25 2.6 Hóa chất, trang thiết bị vật liệu sử dụng nghiên cứu .25 2.6.1 Hóachất 25 2.6.2 Thiết bị 27 2.7 Nội dung nghiên cứu kỹ thuật xét nghiệm .28 2.7.1 Phân lập vi khuẩn đứờng ruột có khả sinh ESBL mẫu thịt .28 2.7.2 Kỹ thuật xác định đặc điểm kháng kháng sinh E coli sinh ESBL 29 v 2.7.3 Xác định nhóm gen CTX-M phân loại nguồn gốc phát sinh loài kỹ thuật PCR .31 2.7.4 Phân tích mối liên quan di truyền chủng E coli sinh ESBL kỹ thuật Phân tích trình tự lặp lại ngắn đa locus (Multilocus Variable-Number Tandem Repeat Analysis) 33 2.7.5 Thu thập phân tích số liệu .35 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 36 3.1.Sự lưu hành của vi khuẩn E.coli sinh ESBL mẫu thịt lợn 36 3.2 Tỷ lệ vi khuẩn E.coli mang gen CTX-M đa kháng thuốc 37 3.3 Đặc điểm gen mã hóa sinh ESBL chủng E.coli sinh ESBL 39 3.4 Đặc điểm phân nhóm phát sinh lồi chủng E coli sinh ESBL .40 3.5 Mối liên hệ kiểu gen chủng E coli sinh ESBL 41 KẾT LUẬN 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 Tài liệu tiếng việt .44 Tài liệu tiếng anh .45 vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1 Cơ chế tác động kháng thuốc Hình 1.2 Cấu trúc vịng β-lactam Hình 1.3 Các nhóm cấu trúc Beta-lactam Hình 1.4 Các nhóm cấu trúc Beta-lactam 11 Hình 1.5: Phân loại β-lactamase theo phương pháp Ambler Bush-JacobiMedeiros [29] 12 Hình 1.6 Phân nhóm CTX-M [34] 14 Hình 1.7 Ước tính số ca tử vong năm vi khuẩn kháng kháng sinh so với nguyên gây chết khác [11] 15 Hình 1.8 Phân bố nhóm gen blaCTX-M giới [36] 17 Hình 1.9 Mức độ phổ biến vi khuẩn sinh E coli sinh ESBL toàn giới[37] 18 Hình 1.10 Tỉ lệ kháng sinh chủng Gram âm Việt Nam [38] 19 Hình 1.11 Sự lan truyền vi khuẩn kháng thuốc chuỗi thực phẩm 21 Hình 2.1: Hình dạng E coli mọc thạch TBX 28 Hình 2.2 PCR phát nguồn gốc gen kháng kháng sinh 32 Hình 2.3 Sơ đồ phân tích kết cho kỹ thuật PCR 33 phân loại nguồn gốc phát sinh loài 33 Hình 2.4 Phân tích trình tự lặp lại ngắn đa locus chủng E coli sinh ESBL 35 Hình 3.1 Tỷ lệ kháng thuốc chủng E Coli phân lập (n =167) 38 Hình 3.2 Tỷ lệ chủng phân lập mang nhiều gien kháng betalactamase 40 Hình 3.3 Tỷ lệ nhóm phát sinh lồi chủngE Coli sinh ESBL 40 Hình 3.4 Mối liên hệ kiểu gen chủng E coli sinh ESBL 42 vii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Đường kính vùng ức chế vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae số loại kháng sinh [43] 30 Bảng 2.2 Trình tự mồi cho nhóm gen CTX-M 31 Bảng 2.3 Trình tự mồi phân loại nguồn gốc phát sinh loài 32 Bảng 2.4 Phân tích trình tự lặp lại ngắn đa locus (Caméléna et al., 2019) 34 Bảng 3.1 Kết cấy mẫu thịt lợn mơi trường TBX có CTX 1µg/ml 36 Bảng 3.2 Kết xác đinh vi khuẩn sinh ESBL pp khoanh giấy kháng sinh 37 Bảng 3.3: Số lượng vi khuẩn đa kháng thuốc 38 Bảng 3.4 Tỷ lệ xuất kiểu gen mã hóa sinh ESBL E coli sinh ESBL 39 Bảng 3.5 Phân bố mức độ đa kháng đa thuốc theo nhóm phát sinh lồi 41 viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA Acid Deoxyribo nucleic AMP Ampicillin ATCC American Type Culture Collection CAZ Ceftazidime CAZ-C Ceftazidime/acid clavulanic CFU Clon forming unit CHL Chloramphenicol CIP Ciprofloxacin CLA Acid clavulanic CLSI Clinical and Laboratories Standards Institute (Viện tiêu chuẩn lâm sàng phịng thí nghiệm) CTX Cefotaxim CTX-C Cefotaxim/acid clavulanic CXM Cefuroxim E coli Escherichia coli ECDC European Centre for Disease Prevention and Control (Trung tâm kiểm sốt phịng ngừa dịch bệnh, Châu Âu) EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid ESBL Extended -Spectrum Beta-Lactamase (Beta – lactamase phổ rộng) FOF Fosfomycin FOX Cefoxitin GEN Gentamycin KAN Kanamycin LB Luria Betari MEM Meropenem MIC Minimum Inhibitor Concentrate (nồng độ ức chế tối thiểu) ix Hình 2.4 Phân tích trình tự lặp lại ngắn đa locus chủng E coli sinh ESBL Phân tích liệu Các sản phẩm PCR thu được điện di gel agarose chụp ảnh hệ thống Gel Doc 2000 (Bio-Rad, Mỹ) xuất thành tệp hình ảnh TIFF Để so sánh dấu vân tay từ mẫu khác nhau, hình ảnh gel sau tải vào sở liệu BioNumerics (Applied Math) Các mẫu MLVA so sánh cách sử dụng tham số dung sai 1% tham số tối ưu hóa 0,5% Phân tích biểu đồ phương pháp nhóm cặp khơng trọng số sử dụng liên kết trung bình (UPGMA) cách sử dụng hệ số tương tự xúc xắc cặp thực với phần mềm BioNumerics (Applied Maths) Hai cấu hình coi giống hệt chúng hiển thị mẫu dải (tương ứng với> 95% độ giống hình biểu đồ) Sức mạnh phân biệt đối xử định lượng số đa dạng Hunter Gaston bắt nguồn từ số đa dạng Simpson (D) Sự phù hợp kiểu gõ đánh giá cách sử dụng hệ số Rand (AR) Wallace (W) điều chỉnh 2.7.5 Thu thập phân tích số liệu Xử lý số liệu phần mềm: phần mềm Bionumeric sử dụng để xử lý kết MLVA Sử dụng T-test ghép cặp để so sánh hai giá trị trung bình 35 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 3.1.Sự lưu hành của vi khuẩn E.coli sinh ESBL mẫu thịt lợn Mẫu thịt lợn sau xử lý theo tiêu chuẩn ISO 16649-1:2018 sàng lọc có mặt E coli kháng TBX môi trường Tryptone Bile X-glucuronide agar (TBX) có bổ sung 1μg/ml cefotaxime Khuẩn lạc màu xanh xuất thạch TBX tính dương tính có chứa E coli kháng TBX Bảng 3.1 Thống kê kết phân lập mẫu E coli kháng TBX Số lượng (n) Tỷ lệ (%) 62 86,8 % Không phải E coli 11,1 % Không có vi khuẩn mọc 2, 1% Tổng số 72 100 Biểu mẫu E coli (khuẩn lạc màu xanh) Kết cho thấy 72 mẫu thịt lợn thu thập chợ đầu mối bán lẻ, tỷ lệ cao (86,8 %) mẫu bị ô nhiễm với vi khuẩn E Coli kháng CTX, 11.1 % mẫu nhiễm vi khuẩn đường ruột khác kháng CTX 2,1 % khơng có vi khuẩn đường ruột kháng CTX mọc Kết tương tự với nghiên cứu (Q P Le et al., 2015),(H V Le et al., 2015) (Nguyen et al., 2021) Đối với mẫu phát khuẩn lạc xanh mọc thạch TBX, chọn từ khuẩn lạc cho mẫu kiểm tra sản sinh ESBL kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán (CTX, CTX-C, CAZ, CAZ-C) mô tả phần phương pháp 36 Commented [LTH1]: Trích dẫn dạng số Bảng 3.2 Kết xác đinh vi khuẩn sinh ESBL pp khoanh giấy kháng sinh Số lượng Tỷ lệ (%) E coli kháng ESBL 146 87 E coli không kháng ESBL 21 13 Tổng số chủng E coli kháng CTX 167 100 E Coli sinh ESBL Kết bảng 3.2 cho thấy đa số (87%) vi khuẩn E coli sàng lọc thạch TBX bổ sung CTX 1µg/ml vi khuẩn E coli sinh ESBL 3.2 Tỷ lệ vi khuẩn E.coli mang gen CTX-M đa kháng thuốc Các chủng vi khuẩn E.coli sinh ESBL kiểm tra tính đa kháng với 12 loại kháng sinh phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán Kết trình bày hình 3.1 Kết cho thấy chủng phân lập tỷ lệ kháng với kháng sinh Ampicillin 100% (AMP) Đối với kháng sinh Chloramphenicol (C), Trimethoprim / Sulfamethoxazole (SXT), Gentamicin (GM), Aztreonam (ATM) Cefepime (FEP), tỷ lệ vi khuẩn kháng mức cao từ 24-62% chủng phân lập Đối với loại kháng sinh betalactam khác, tỷ lệ kháng mức vừa thấp: 9% kháng Amoxicillin/clavulanic acid (AMC), 11.5 % kháng Cefoxitin (FOX), (19.9 %) kháng Ciprofloxacin (CIP) Ngoài ra, 10,3 % số chủng E.coli phân lập kháng Colistin (CT), kháng sinh lớp cuối để điều trị vi khuẩn gram âm kháng đa thuốc Kết tương đồng với số nghiên cứu gần cho thấy vi khuẩn gram âm kháng colistin tìm thấy tương đối phổ biến thực phẩm 37 Tỷ lệ kháng thuốc chủng E Coli phân lập (n =167) TỶ LỆ % KHÁNG THUỐC 100.0 100.0 95.5 76.3 80.0 60.0 71.2 20.0 0.0 0.0 AMP 14.7 9.0 AMC 29.5 24.4 ATM 62.8 52.6 40.4 46.2 40.0 0.0 95.5 82.7 11.5 5.8 19.9 9.0 FOX CIP 7.1 1.3 3.2 IMP GM 56.455.8 44.2 39.7 35.9 33.3 35.3 24.4 0.6 3.8 MEM 10.3 1.9 C FEP CT 0.0 SXT LOẠI THUỐC KHÁNG SINH Kháng Trung gian Nhạy cảm Hình 3.1 Tỷ lệ kháng thuốc chủng E coli phân lập (n =167) Đáng ý nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu phát phân lập chủng vi khuẩn E coli kháng betalactam hệ ba Carbapenem (imipenem meropenem) Kháng sinh lớp carbapenem loại kháng sinh dùng trường hợp điều trị vi khuẩn kháng thuốc sinh ESBL Mặc dù tỉ lệ thấp, lưu hành vi khuẩn E coli kháng Carbapenem thực phẩm tín hiệu đáng lo ngại với sức khỏe cộng đồng Bảng 3.3: Đặc tính đa kháng thuốc chủng phân lập Số nhóm KS không nhạy Số chủng Tỷ lệ % 104 62.3 78 46.7 49 29.3 31 18.6 14 8.4 4.2 1.8 10 0.6 cảm 38 Kết cho thấy có tới 62,3% (104 chủng) số chủng phân lập đa kháng (kháng loại kháng sinh trở lên 18,6% kháng loại kháng sinh trở lên Đáng ý phát chủng kháng 10 loại kháng sinh bao gồm colistin carbapenem (bảng 3.3) 3.3 Đặc điểm gen mã hóa sinh ESBL chủng E.coli sinh ESBL Để xác định đặc điểm gen mã hóa ESBL chủng E coli sinh ESBL, chúng tơi chọn 146 chủng điển hình tổng số 167 chủng E coli phân lập, để tiến hành xác định kiểu gen phương pháp PCR đa mồi Kết nghiên cứu cho thấy 60,3% số chủng E coli sinh ESBL mang gen blaTEM 60,5%, 19,2% mang gen blaCTX-M-1, 25,3% mang gen blaCTX-M-9, 8,2% mang BlaCTX-M-8/25 2% mang gen blaSHV Có 42 chủng khơng phát thấy mang gen mã hóa sinh CTX nói (Bảng 3.4) Bảng 3.4 Tỷ lệ xuất kiểu gen mã hóa sinh ESBL E coli sinh ESBL Kiểu gien mã hóa CTX-M Số lượng (n = 146) Tỷ lệ (%) BlaTem 88 60,5 BlaSHV 2,0 blaCTXM-1 28 22,6 BlaCTX-M-8/25 12 8,2 blaCTXM-9 37 25,3 blaCTXM-2 0.0 Không phát 42 28,7 Do vi khuẩn E coli sinh ESBL mang nhiều gen mã hóa sinh ESBL Kết hình 3.2 cho thấy 30,6% số chủng E coli sinh ESBL mang gen mã hóa sinh ESBL, số chủng mang gen mã hóa sinh ESBL chiếm tỷ lệ 32,25 % chủng mang đồng thời gen mã hóa ESBL (8,8 %) 39 % TỔNG SỐ CHỦNG PHÂN LẬP 35 30 25 20 15 10 Mang gene kháng thuốc Mang gene kháng thuốc Mang gene kháng thuốc Hình 3.2 Tỷ lệ chủng phân lập mang nhiều gen kháng betalactamase 3.4 Đặc điểm phân nhóm phát sinh lồi chủng E coli sinh ESBL Phân tích đặc điểm nhóm phát sinh loài chủng E.coli sinh ESBL phân lập từ mẫu thực phẩm chúng tơi nhận thấy: Có xuất nhóm phát sinh lồi, nhóm D chiếm tỉ lệ cao (54,5%), nhóm A(27,6%), nhóm B1 (12,2%) nhóm B2 chiếm tỉ lệ thấp (5,7%) Đặc điểm phân nhóm phát sinh loài chủng E coli sinh ESBL (n =146) 5.7 12.2 27.6 54.5 A D B1 B2 Hình 3.3 Tỷ lệ nhóm phát sinh lồi chủng E coli sinh ESBL 40 Đánh giá mức độ kháng kháng sinh nhóm phát sinh lồi chủng E.coli sinh ESBL cho thấy: Các chủng kháng AMP CTX với tỷ lệ 100% Tỷ lệ đa kháng (kháng với loại kháng sinh) nhóm B1 B2 88.2% 77.7% cao hẳn so với nhóm cịn lại A D 65% 55% (p