Bài giảng Công nghệ Gene: Chương 3 Giải trình tự Gene, bộ Gene, cung cấp cho người học những kiến thức như: Giải trình tự gene và bộ gene bằng phương pháp Sanger (chain-termination DNA sequencing); Giải trình tự gene và bộ gene bằng phương pháp mới (NGS-next generation sequencing): Illumina; Ứng dụng của kỹ thuật giải trình tự DNA. Mời các bạn cùng tham khảo!
11/4/2021 CHƯƠNG 3: GIẢI TRÌNH TỰ GENE, BỘ GENE GV: NGUYỄN NGỌC PHƯƠNG THẢO 87 NỘI DUNG Giải trình tự gene gene phương pháp Sanger (chain-termination DNA sequencing) Giải trình tự gene gene phương pháp (NGS-next generation sequencing): Illumina Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự DNA 11/4/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 88 44 11/4/2021 GIẢI TRÌNH TỰ DNA • Trình tự xác nucleotide đoạn DNA • 1990s: whole genome sequencing lồi nhân thực, nhân sơ • 1970s: Fred Sanger developed chain termination DNA sequencing • NGS: nhiều phương pháp khác nhau, cho phép giải trình tự lúc hàng triệu đoạn DNA 11/4/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 89 PHƯƠNG PHÁP SANGER (CHAIN TERMINATION DNA SEQUENCING) • Nguyên tắc: khác kích thước (đến nucleotide) sợi đơn DNA gel điện polyacrylamide Polyacrylamide gel electrophoresis in a capillary system can resolve single-stranded DNA molecules that differ in length by just one nucleotide The capillary is typically 50–80 in length withPhương a gel diameter 11/4/2021 TS.cm Nguyễn Ngọc Thảo of 0.1 mm 90 45 11/4/2021 PHƯƠNG PHÁP SANGER (CHAIN TERMINATION DNA SEQUENCING) • • • • DNA polymerase dNTPs Primer (mồi) ddNTPs gắn fluorescent (4 màu) 11/4/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 91 PHƯƠNG PHÁP SANGER (CHAIN TERMINATION DNA SEQUENCING) • • • • DNA polymerase dNTPs Primers (mồi) ddNTPs gắn fluorescent (4 màu) 11/4/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 92 46 11/4/2021 PHƯƠNG PHÁP SANGER (CHAIN TERMINATION DNA SEQUENCING) 11/4/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 93 SỬ DỤNG DNA POLYMERASE NÀO? • Klenow polymerase đột biến loại bỏ hoạt tính sửa sai (5’-3’ exonuclease) • Taq DNA polymerase: no exonuclease activity • Thermo cycle sequencing (PCR): forward primer, reverse primer, internal primer 11/4/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 94 47 11/4/2021 GIỚI HẠN CỦA PP SANGER • Chiều dài đoạn DNA cho tín hiệu tốt 750bp -> sequencing gene, phần gene sản phẩm PCR cloning • Để giải trình tự genome sao? Chi phí? Thời gian? 11/4/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 95 GIỚI HẠN CỦA PP SANGER Để giải trình tự genome sao? Errors sao? 11/4/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 96 48 11/4/2021 HUMAN GENOME SEQUENCING PROJECT • • • • 1990s Genome size 3200 Mbp reads cho base -> cần 3200*5=16 000 Mb Dự án có 23 147 Mb nhờ thiết bị tự động hoá: lần chạy cho 384 sequences lúc, => Mb/ngày 11/4/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 97 NEXT GENERATION SEQUENCING (NGSGIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI) 11/4/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo https://www.slideshare.net/mkim8/a-comparison-of-ngs-platforms 98 49 11/4/2021 NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS-GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI) • • • Khơng cần bước cloning/PCR Chỉ cần ly trích tồn genome Tạo thư viện hàng triệu sợi DNA giải trình tự lúc 11/4/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 99 CÁC BƯỚC CHUẨN BỊ THƯ VIỆN CHO NGS Ly trích DNA (DNA extraction) Cắt thành đoạn DNA ngắn theo kích thước phù hợp với phương pháp lựa chọn Cố định đoạn DNA bề mặt rắn 11/4/2021 Khuếch đại (amplification) trình tự TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 100 50 11/4/2021 SÓNG SIÊU ÂM (SONICATION) CẮT ĐỨT DNA NGẪU NHIÊN • Cắt ngẫu nhiên thành đoạn 100-500 bp • Tất đoạn giải trình tự từ đầu sợi 11/4/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 101 CỐ ĐỊNH CÁC ĐOẠN LÊN BỀ MẶT RẮN (IMMOBILIZATION THE FRAGMENTS ON SOLID SUPPORT) • Gắn đoạn ngắn adapter (biết trước trình tự) lên DNA • Cố định lên bề mặt rắn nhiều cách: adapter gắn lên trình tự bổ sung với oligonucleotide adapter-liên kết biotin gắn lên hạt Streptavidin 11/4/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 102 51 11/4/2021 CỐ ĐỊNH CÁC ĐOẠN LÊN BỀ MẶT RẮN (IMMOBILIZATION THE FRAGMENTS ON SOLID SUPPORT) • Gắn đoạn ngắn adapter (biết trước trình tự) lên DNA • Cố định lên bề mặt rắn nhiều cách: adapter gắn lên trình tự bổ sung với oligonucleotide adapter-liên kết biotin gắn lên hạt Streptavidin 11/4/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 103 KHUẾCH ĐẠI CÁC TRÌNH TỰ BẰNG PCR • Khuếch đại sợi DNA đơn thành nhiều copies đứng gần tạo thành cụm (cluster) PCR Các cluster bề mặt rắn 11/4/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 104 52 11/4/2021 KHUẾCH ĐẠI CÁC TRÌNH TỰ BẰNG PCR • Khuếch đại sợi DNA đơn thành nhiều copies đứng gần tạo thành cụm (cluster) PCR https://www.1010genome.com/illumina-sequencing/ 11/4/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 105 GIẢI TRÌNH TỰ BẰNG CÁCH TỔNG HỢP SỢI MỚI (SEQUENCING BY SYNTHESIS-SBS) 11/4/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 106 53 11/4/2021 GIẢI TRÌNH TỰ BẰNG CÁCH TỔNG HỢP SỢI MỚI (SEQUENCING BY SYNTHESIS-SBS) 11/4/2021 https://www.google.com.vn/url?sa=i&url=https%3A%2F%2Fwww.medizinische-genetik.de%2Findex.php%3Fid%3Dnext-generationTS Nguyễn Ngọc Phương Thảo sequencing&psig=AOvVaw3kfKoA0Z8mSQoDWErk8Y3D&ust=1602912490282000&source=images&cd=vfe&ved=2ahUKEwjIP29sLjsAhVoHbcAHSUlBqwQr4kDegUIARCQAQ 107 GIẢI TRÌNH TỰ BẰNG CÁCH TỔNG HỢP SỢI MỚI (SEQUENCING BY SYNTHESIS-SBS) http://tcr.amegroups.com/article/view/4506/html 11/4/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 108 54 11/4/2021 LẮP RÁP TRÌNH TỰ (DE NOVO ASSEMBLY) ĐỘ PHỦ (COVERAGE) TỪ 5X: MỖI NUCLEOTIDE ĐƯỢC LẶP LẠI LẦN 11/4/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 109 PHÂN TÍCH DỮ LIỆU GENOME 11/4/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 110 55 11/4/2021 11/4/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 111 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ DNA • Phát sớm ung thư di truyền: tuyến giáp, vú, đại trực tràng, dày, bạch cầu tuỷ bào cấp… • Sàng lọc trước sinh chẩn đoán hội chứng DOWN, khuyết tật ống thần kinh, Trisomy 18, não úng thuỷ, … • Chẩn đốn phát đột biến kháng thuốc vi khuẩn, virus, nấm gây bệnh người, động vật, thực vật • Xét nghiệm DNA huyết thống • Xác định nguồn gốc động vật, giống • Phục vụ cơng tác điều tra tội phạm 11/4/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 112 56 11/4/2021 11/4/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 113 https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigmaaldrich/articles/biology/marketing-assets/sangersequencing_steps_process_diagram.png 11/4/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 114 57 11/4/2021 https://www.intechopen.com/books/next-generation-sequencing-advances-applications-and-challenges/next11/4/2021generation-sequencing-in-aquatic-models TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 115 TÀI LIỆU THAM KHẢO • https://medlatec.vn/tin-tuc/nhung-ung-dungcua-ky-thuat-giai-trinh-tu-dna-the-he-moitren-may-pyromark-q24-trong-y-hoc-lamsang-s28-n4685 11/4/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 116 58 ... https://www.intechopen.com/books/next-generation-sequencing-advances-applications-and-challenges/next11/4/2021generation-sequencing-in-aquatic-models TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 115 TÀI LIỆU THAM KHẢO • https://medlatec.vn/tin-tuc/nhung-ung-dungcua-ky-thuat-giai-trinh-tu-dna-the-he-moitren-may-pyromark-q24-trong-y-hoc-lamsang-s28-n4685... https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigmaaldrich/articles/biology/marketing-assets/sangersequencing_steps_process_diagram.png 11/4/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 114 57 11/4/2021 https://www.intechopen.com/books/next-generation-sequencing-advances-applications-and-challenges/next11/4/2021generation-sequencing-in-aquatic-models... SYNTHESIS-SBS) 11/4/2021 https://www.google.com.vn/url?sa=i&url=https%3A%2F%2Fwww.medizinische-genetik.de%2Findex.php%3Fid%3Dnext-generationTS Nguyễn Ngọc Phương Thảo sequencing&psig=AOvVaw3kfKoA0Z8mSQoDWErk8Y3D&ust=1602912490282000&source=images&cd=vfe&ved=2ahUKEwjIP29sLjsAhVoHbcAHSUlBqwQr4kDegUIARCQAQ