Bài giảng Công nghệ Gene: Chương 2 Công nghệ DNA tái tổ hợp với mục tiêu chính giúp các bạn đọc nắm được các khái niệm cơ bản, các công cụ; Nắm được các bước trong kỹ thuật nhân dòng DNA tái tổ hợp; Vận dụng kiến thức để tìm hiểu ứng dụng của kỹ thuật trong thực tế; Vận dụng kiến thức để thiết kế vector nhân dòng DNA trên máy tính (in silico).
11/4/2021 CHƯƠNG 2: CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP NGUYỄN NGỌC PHƯƠNG THẢO Thao.nnp@vlu.edu.vn 23 11/4/2021 NỘI DUNG Công cụ: Hệ thống enzyme cắt giới hạn, vector, tế bào chủ Kỹ thuật nhân dòng DNA tái tổ hợp Các phương pháp chuyển DNA vào tế bào nhân sơ E coli Các kỹ thuật sàng lọc Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp Thiết kế vector chuyển gene in silico 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 47 47 MỤC TIÊU • Nắm khái niệm bản, cơng cụ • Nắm bước kỹ thuật nhân dịng DNA tái tổ hợp • Vận dụng kiến thức để tìm hiểu ứng dụng kỹ thuật thực tế • Vận dụng kiến thức để thiết kế vector nhân dịng DNA máy tính (in silico) 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 48 48 24 11/4/2021 CÁC THUẬT NGỮ • DNA tái tổ hợp (recombinant DNA): DNA loài A chuyển cho loài B • Nhân dòng (cloning): tạo nhiều 9/20/2021 49 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 49 Nhân dòng DNA Để làm gì? -Lưu trữ -Phân tích -Biểu protein … 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 50 50 25 11/4/2021 CÁC CƠNG CỤ SỬ DỤNG • Enzyme: – – – – Sao chép: DNA polymerase Cắt giới hạn (Restrictrion enzyme) Nối DNA (T4 DNA ligase) Thay đổi đầu DNA: dephosphorylation alkaline phosphatase • Plasmid nhân dịng E coli: pBR233, pUC18 • Tế bào chủ: – Prokaryotes: E coli, Bacillus, Pseudomonas – Eukaryotes: S cerevisiae, A nidulans, P pastoris, Chlamydomonas rehardtii 9/20/2021 51 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 51 ENZYME CẮT GIỚI HẠN (RESTRICTION ENDONUCLEASE – RE) Phản ứng tối ưu: • lượng enzyme • lượng DNA • điều kiện pH (dung dịch đệm) • nhiệt độ • thời gian 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 52 52 26 11/4/2021 ENZYME CẮT GIỚI HẠN (RESTRICTION ENDONUCLEASE – RE) Tra cứu: https://nebcloner.neb.co m/#!/redigest 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 53 53 T4 DNA LIGASE • Keo phân tử • Hoạt động hiệu đầu cố kết (cohesive ends) • Hoạt động tốt 37oC 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 54 54 27 11/4/2021 ENZYME BIẾN ĐỔI ĐẦU DNA • Alkaline phosphatase: loại bỏ nhóm phosphate đầu 5’ • T4 polynucleotide kinase: thêm nhóm phosphate vào đầu 5’ • Enzyme cắt tạo đầu 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 55 55 ĐẶC ĐIỂM CỦA VECTOR • Kích thước nhỏ • Có replication origin tương thích với host • Có marker sàng lọc: gene kháng kháng sinh • Có RE sites 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 56 56 28 11/4/2021 ĐẶC ĐIỂM KHÁC • Liên hợp (conjugative) vùng tra mob chuyển qua tế bào khác thông qua q trình tiếp hợp • Khơng liên hợp (non-conjugative) • Số (copy number): – Thấp (vài copies/chromosome): trình chép kiểm sốt với chép gDNA tế bào chủ – Cao (>10 copies/chromosome) 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 57 57 SỐ BẢN SAO CỦA MỘT SỐ PLASMID https://www.google.com.vn/url?sa=i&url=https%3A%2F%2Fhistogene.co%2Frecombinant-proteininsects9%2F&psig=AOvVaw2tlmGwF652bOuiGdDOTZS3&ust=1601456071594000&source=images&cd=vfe&ved=0CA0 QjhxqFwoTCOj04Pf-jewCFQAAAAAdAAAAABAL 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 58 58 29 11/4/2021 CÁC BƯỚC CƠ BẢN TRONG TẠO DÒNG PHÂN TỬ DNA https://www.thermofisher.com/vn/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecularbiology/molecular-cloning/cloning/traditional-cloning-basics.html 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 59 59 CÁC BƯỚC CƠ BẢN TRONG TẠO DỊNG PHÂN TỬ DNA • Chuẩn bị gene nguồn (insert): tách, cắt • Chuẩn bị plasmid: tách, cắt • Dán insert vào plasmid • Biến nạp tổ hợp vào tế bào chủ • Sàng lọc tế bào chứa plasmid mục tiêu 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 60 60 30 11/4/2021 SƠ ĐỒ QUÁ TRÌNH CẮT HẠN CHẾ VÀ NỐI 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 61 61 CHUYỂN DNA VÀO VI KHUẨN A Biến nạp (transformation) B Tiếp hợp (conjugation) C Chuyển nhiễm (transduction) 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 62 62 31 11/4/2021 BIẾN NẠP • Biến nạp (transformation): sốc nhiệt (heat shock) xung điện (electroporation), Tế bào khả biến (competent cell), Chỉ số tế bào nhận thành cơng plasmid: transformants 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 63 63 BIẾN NẠP sốc nhiệt • Tế bào khả biến: tế bào mid-log xử lý với CaCl2 lạnh • Cho tiếp xúc nhiệt độ cao 42oC • Tần số biến nạp 10-3 • Hiệu suất: 106-107 khuẩn lạc/ug DNA 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 64 64 32 11/4/2021 Chuyển DNA vào vi khuẩn xung điện (electroporation) 9/20/2021 • Electroporation • Vi khuẩn + DNA đặt vào điện trường cao áp • Hiệu suất 109 transformants/ug DNA plasmid nhỏ (3kb), 106 plasmid lớn (136 kb) TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 65 https://moodle2.units.it/pluginfile.php/327420/mod_resource/content/0/TEC_CELL_SCHEDA_07_bacteria%20transformation.pdf 65 Chuyển DNA vào vi khuẩn phương pháp tiếp hợp (conjugation) • Chuyển DNA tế bào cách: – Tiếp xúc tế bào với tế bào – Thơng qua kênh (pilus) • Một số plasmid có khả tự chuyển nhiễm (selftransmissable): chứa tra genes (hỗ trợ DNA transfer, replication mating pair formation) 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 66 66 33 11/4/2021 Chuyển DNA vào vi khuẩn chuyển nhiễm (transfection) • Chuyển đoạn gene nhờ vào bacteriophage 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 67 67 SÀNG LỌC TẾ BÀO CHỨA PLASMID MỤC TIÊU • Marker sàng lọc (gene kháng thuốc kháng sinh) -> khuẩn lạc tiềm • Tiến hành kiểm tra DNA khuẩn lạc tiềm năng: PCR, tách plasmid phân huỷ RE 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 68 68 34 11/4/2021 CÁC MARKER SÀNG LỌC 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 69 69 BIỂU HIỆN PROTEIN • Khuẩn lạc chứa plasmid biểu protein tiếp tục ni cấy, mơi trường cảm ứng sản xuất protein đích Protein thu, làm sử dụng 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 70 70 35 11/4/2021 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 71 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 72 71 72 36 11/4/2021 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 73 73 ỨNG DỤNG CỦA CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 74 74 37 11/4/2021 MỘT SỐ HỆ THỐNG KÝ CHỦ CHO SẢN XUẤT PROTEIN TÁI TỔ HỢP • Bằng vi sinh vật: vi khuẩn, tảo, nấm men • Bằng thực vật: protein thân, lá, rễ, hạt • Trong sữa vật ni • Bằng tế bào côn trùng 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 75 75 TRONG Y DƯỢC Sản xuất: • Kháng sinh • Insulin • Hormon tăng trưởng người: somatotrophin, somatostatin • Human factor VIII • Interferons, interleukins • Albumin • Kháng nguyên -> vaccine • Kháng thể Phân tích: gene bệnh Liệu pháp gene ung thư 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 76 76 38 11/4/2021 TRONG NÔNG NGHIỆP 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 77 77 TRONG CƠNG NGHIỆP • Sản xuất chất chuyển hoá: amino acids, vitamins, alcohols, carotenoids, riboflavin, acid butyric • Kháng sinh, thuốc trừ sâu, chất tạo màu, chất tăng trưởng cho cây, vật ni • Enzyme tẩy rửa: lipase, protease, amylase… https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3026452/ 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 78 78 39 11/4/2021 TUẦN SAU • Tham gia post thảo luận • Tiếp tục nội dung: thiết kế vector in silico phần mềm Serial Cloner 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 79 79 THIẾT KẾ VECTOR NHÂN DỊNG (in silico) GENE MÃ HỐ INSULIN ĐỂ BIỂU HIỆN TRONG E COLI 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 80 80 40 11/4/2021 BƯỚC 1: CHUẨN BỊ CƠ SỞ DỮ LIỆU • Vector nhân dịng: pUC18 • Trình tự gene Nguồn liệu gene/genome: – NCBI gene/genome: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ – Uniprot https://www.uniprot.org/ 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 81 81 • • Chuẩn bị đoạn gene tái tổ hợp Tối ưu hoá codon usage cho đoạn gene tái tổ hợp Hố tổng hợp trình tự CDS (optimized) atggcgctgtggatgcgcctgctgccgctgctggcgctgctggcgctgtggggcccggatccggcggcggcgtt tgtgaaccagcatctgtgcggcagccatctggtggaagcgctgtatctggtgtgcggcgaacgcggcttttttta taccccgaaaacccgccgcgaagcggaagatctgcaggtgggccaggtggaactgggcggcggcccgggcg cgggcagcctgcagccgctggcgctggaaggcagcctgcagaaacgcggcattgtggaacagtgctgcacca gcatttgcagcctgtatcagctggaaaactattgcaactag mRNA (original) atggccctgtggatgcgcctcctgcccctgctggcgctgctggccctctggggacctgacccagccgcagccttt gtgaaccaacacctgtgcggctcacacctggtggaagctctctacctagtgtgcggggaacgaggcttcttcta cacacccaagacccgccgggaggcagaggacctgcaggtggggcaggtggagctgggcgggggccctggt gcaggcagcctgcagcccttggccctggaggggtccctgcagaagcgtggcattgtggaacaatgctgtacca gcatctgctccctctaccagctggagaactactgcaactag 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 82 82 41 11/4/2021 B2: thiết lập sở liệu vector đoạn gene mục tiêu Serial Cloner • Import Vector pUC19 • Import đoạn gene 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 83 83 B3: thiết kế đoạn mồi PCR để khuếch đại đoạn gene mục tiêu • Đoạn mồi PCR forward, reverse • Bổ sung đoạn trình tự enzyme cắt giới hạn lên mồi 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 84 84 42 11/4/2021 B4: cloning Serial Cloner 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 85 85 REVIEW Công cụ: Hệ thống enzyme cắt giới hạn, vector, tế bào chủ Kỹ thuật nhân dòng DNA tái tổ hợp Các phương pháp chuyển DNA vào tế bào nhân sơ E coli Các kỹ thuật sàng lọc Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp Thiết kế vector chuyển gene in silico 9/20/2021 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 86 86 43 ... Phương Thảo 70 70 35 11/4 /20 21 9 /20 /20 21 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 71 9 /20 /20 21 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 72 71 72 36 11/4 /20 21 9 /20 /20 21 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 73 73 ỨNG DỤNG CỦA CÔNG NGHỆ... 9 /20 /20 21 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 52 52 26 11/4 /20 21 ENZYME CẮT GIỚI HẠN (RESTRICTION ENDONUCLEASE – RE) Tra cứu: https://nebcloner.neb.co m/#!/redigest 9 /20 /20 21 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo. .. 9 /20 /20 21 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo 82 82 41 11/4 /20 21 B2: thiết lập sở liệu vector đoạn gene mục tiêu Serial Cloner • Import Vector pUC19 • Import đoạn gene 9 /20 /20 21 TS Nguyễn Ngọc Phương Thảo