Khai thác và chọn gen mã hóa chitinase từ nguồn dữ liệu DNA metagenome

Trong nghiên cứu này, với mục đích tìm kiếm các gen mã hóa chitinase mới có hoạt tính diệt tuyến trùng và bệnh nấm hại rễ ở cà phê, từ 8/56 trình tự với độ tương đồng nhỏ hơn 75%, đã lựa chọn được trình tự ChiA_2. Kết quả phân tích trên BLASTP cho thấy, ChiA_2 có giá trị điểm tối đa cao nhất, đồng thời độ tương đồng của trình tự đạt 72%.

Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 17(3): 553-560, 2019 KHAI THÁC VÀ CHỌN GEN MÃ HÓA CHITINASE TỪ NGUỒN DỮ LIỆU DNA METAGENOME Nguyễn Thị Thơm1, Nguyễn Thị Hồng Hà1, Phạm Bích Ngọc1,*, Chu Hồng Hà1, Hồ Bích Hải2, Lê Mai Hương3 Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Viện Công nghệ thông tin - Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam * Người chịu trách nhiệm liên lạc E-mail: pbngoc@ibt.ac.vn Ngày nhận bài: 18.12.2018 Ngày nhận đăng: 15.03.2019 TÓM TẮT Khai thác sở liệu DNA metagenome đất vùng rễ cà phê tái canh năm tuổi tỉnh Đăl Lăk so sánh liệu CAZy tìm thấy 56 trình tự nucleotide mã hóa chitinase Kết phân tích trình tự BLASTP dự đốn protein có độ bao phủ từ 90% trở lên với hệ số tương đồng từ 33% - 99 % so với gen chitinase công bố Trong nghiên cứu này, với mục đích tìm kiếm gen mã hóa chitinase có hoạt tính diệt tuyến trùng bệnh nấm hại rễ cà phê, từ 8/56 trình tự với độ tương đồng nhỏ 75%, lựa chọn trình tự ChiA_2 Kết phân tích BLASTP cho thấy, ChiA_2 có giá trị điểm tối đa cao nhất, đồng thời độ tương đồng trình tự đạt 72% Bằng phần mềm InterProscan, trình tự gen ChiA_2 dự đốn có trung tâm hoạt động chứa gốc acid amin FDGIDIDWE nằm vị trí acid amin thứ 134-142 Đồng thời, trình tự khảo sát tín hiệu tiết ngoại bào sử dụng phần mềm SignalP 4.1 server cho thấy ChiA_2 có trình tự tín hiệu tiết dài 30 acid amin nằm đầu N Trình tự nucleotide gen ChiA_2 bao gồm 1167 nucleotide, mã hóa cho 389 acid amin với khối lượng phân tử dự đoán khoảng 43 kDa Đoạn gen ChiA_2 với kích thước khoảng 1,2 kb tổng hợp, thiết kế thành công vào vector pET21(a+) biến nạp vào tế bào E coli BL21 (DE3) phương pháp sốc nhiệt Protein ChiA_2 chứng minh biểu đặc hiệu dòng tế bào E coli BL21 (DE3) tái tổ hợp có hoạt tính phân giải Chitin đạt 4,9 U/ml Như vậy, nghiên cứu này, phân tích liệu metagenome từ mẫu đất vùng rễ cung cấp thông tin di truyền tương đối đầy đủ gen mã hoá chitinase, bước đầu biểu thành công đánh giá hoạt tính trình tự ChiA_2 mã hố Chitinase Từ khóa: chitinase, DNA metagenome, E coli, gen mới, tái tổ hợp MỞ ĐẦU Năm 2018, Việt Nam xuất 1,1 triệu cà phê, đạt kim ngạch 2,3 tỷ USD, cà phê Robusta đạt 925.000 tấn, cà phê hòa tan rang xay 89.000 Sản lượng xuất nước tăng 34,8% lượng tăng 17,2% kim ngạch (VIFOCA, 2018) Với ý nghĩa kinh tế to lớn từ xuất sản phẩm cà phê đưa Việt Nam trở thành quốc gia xuất cà phê lớn giới Tuy nhiên, khai thác mức, trình thâm canh điều kiện khơng có che bóng, thối hóa đất, sâu bệnh hại… làm cà phê nhanh chóng già cỗi Việc đẩy mạnh tái canh, thay vườn già cỗi gây khơng trở ngại cho ngành cà phê Việt Nam chi phí q trình tái canh cao, tỷ lệ sâu bệnh nhiều, đặc biệt nghiêm trọng bệnh tuyến trùng hại rễ, bệnh nấm hại rễ Đây khó khăn ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất cà phê giới Các enzyme ngoại bào đặc biệt enzyme chitinase đóng vai trò quan trọng đấu tranh sinh học Nhiều nghiên cứu cho thấy chitinase ngoại bào từ loài nấm kí sinh tuyến trùng có khả phân hủy màng trứng tuyến trùng phân hủy vách tế bào lồi vi nấm gây hại Nấm kí sinh trùng có khả vượt qua hàng rào bảo vệ côn trùng cách sản xuất nhiều enzyme ngoại bào nhằm phân giải protein chitin tạo điều kiện thuận lợi cho trình xâm nhập vào lớp biểu bì 553 Nguyễn Thị Thơm et al gây nhiễm trùng (St Leger, 1991) Ngoài ra, số enzyme khác liên quan đến q trình kí sinh nấm vào tuyến trùng collagenase, lysosymes protease (Sharon et al., 2001; Khan et al., 2004) Trên giới, gen mã hóa chitinase đối tượng vi sinh vật nhiều tác giả nghiên cứu, tập trung chủ yếu vào gen mã hóa chitinase từ số chủng nấm Việc sử dụng hệ biểu để tạo enzyme tái tổ hợp quan trọng cho phát triển enzyme sản xuất lượng lớn enzyme Gen mã hóa chitinase nhiều tác giả nghiên cứu biểu hệ thống biểu khác Barboza-Corona cộng (2003) nhân dịng biểu gen mã hóa endochitinase từ vi khuẩn B thuringiensis vi khuẩn E coli DH5α Dựa sở khoa học khả diệt tuyến trùng vi nấm gây bệnh enzyme chitinase, nhóm nghiên cứu tiến hành khai thác gen chitinase có hoạt tính diệt tuyến trùng mạnh từ liệu metagenome nhằm tạo chủng chế phẩm enzyme chitinase thơ để phịng trừ loại tuyến trùng vi nấm gây hại Hiện nay, metagenomics (phân tích DNA vi sinh vật môi trường mà không cần nuôi cấy) kĩ thuật mới, kết hợp kỹ thuật công nghệ sinh học khác từ cơng nghệ gen, giải trình tự đến tin sinh học để nghiên cứu thành phần, chức động học quần thể vi sinh vật Hiện số lượng lớn liệu thu từ công nghệ metagenomics công bố rộng rãi, tạo điều kiện thuận lợi cho nhà khoa học nghiên cứu phân tích gen góp phần phục vụ mục tiêu canh tác nông nghiệp bền vững Việt Nam Việc áp dụng kĩ thuật metagenomics vào nghiên cứu hệ gen vi sinh vật đất, đóng vai trị to lớn nghiên cứu Tuy nhiên, Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật metagenomics nghiên cứu hệ vi sinh vật đất nói chung hệ vi sinh vật vùng rễ cà phê nói riêng Vì vậy, nghiên cứu tập trung đánh giá có mặt gen chitinase đất vùng rễ cà phê thông qua kĩ thuật metagenomics NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu Nguồn liệu metagenomics vi sinh vật đất vùng rễ cà phê tái canh năm tuổi, giải trình tự hệ thống giải trình tự HiSeq Illumina giải chức dựa CAZy (Do et al., 2014) Dữ liệu gồm có 1.291.826 đoạn ORF 554 dự đoán lắp ráp, tương ứng với 1.291.826 gen dự đoán lắp ráp, 673.899 gen dự đoán giải chức Chủng Bacillus sp từ sưu tập chủng vi sinh vật Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật có hoạt tính chitinase sử dụng làm đối chứng dương nghiên cứu đánh giá hoạt tính protein ChiA_2 Phương pháp Xác định họ Glycosyl Hydrolases (GH) có chứa enzyme chitinase theo CAZy (http://www.cazy.org) Sử dụng liệu phân loại CAZy để xác định có họ GH chứa enzyme này, sau tìm hiểu cấu trúc không gian, loại amino acid cho điện tử proton trình hoạt động enzyme Kết tổng hợp thành bảng phân loại danh sách họ GH chứa enzyme để tìm hiểu thơng tin sâu Khai thác trình tự mã hóa chitinase từ liệu DNA metagenome vi sinh vật nội sinh cà phê Sau có gen mã hóa cho chitinase khác nhau, sử dụng BLASTP để so sánh với trình tự nucleotide ORF thuộc metagenome vi sinh vật đất vùng rễ cà phê với mong muốn xác định gen tiềm tiến tới tách dòng biểu protein chitinase tái tổ hợp Thiết kế vector biểu pET-21a(+) mang gen mã hóa chitinase Vector pUC19/chiA_2 với điểm cắt BamHI SacI nằm tương ứng hai đầu 5’ 3’ pET21a(+) đồng thời cắt tạo đầu so le cặp enzyme giới hạn BamHI SacI Đoạn gen chiA_2 tách từ vector pUC19 vector pET-21a(+) thu sau tinh sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng nối ghép xúc tác T4-ligase để tạo thành vector pET21/chiA2 Sản phẩm nối ghép biến nạp vào E coli phương pháp sốc nhiệt theo Cohen cộng (1972) Tiến hành sàng lọc thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp mong muốn phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen theo chu trình: 95oC - phút, 30 chu kì (95oC - 30 giây, 58oC - 30 giây, 72oC - phút), 72oC - 10 phút, ủ mẫu 4oC phương pháp cắt kiểm tra enzyme hạn chế Plasmid tái tổ hợp pET21/chiA2 sau biến nạp vào chủng E coli BL21 (DE3) để biểu gen Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 17(3): 553-560, 2019 Biểu protein tái tổ hợp tế bào vi khuẩn E coli Rửa màng lần lần 10 phút đệm TTBS (TBS, 0,05% Tween 20) Một khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp nuôi cấy 10 ml mơi trường LB lỏng có kháng sinh ampicillin 37oC, lắc 200 vòng/phút qua đêm Cấy chuyển ml dịch khuẩn nuôi qua đêm sang 100 ml môi trường LB nuôi 37oC, lắc 200 vịng/phút đến giá trị OD600 = 0,4-0,6 bổ sung IPTG tới nồng độ mM chuyển sang ni lắc 200 vịng/phút 28oC để cảm ứng biểu protein ngoại lai Tế bào thu lại cách ly tâm dịch nuôi cấy 6000 vòng/phút 15 phút hòa dung dịch đệm PBS 1X Bổ sung lysozyme tới nồng độ 0,1 mg/ml, ủ đá tiến hành siêu âm phá tế bào, sau ly tâm 13000 vòng/phút 30 phút, thu dịch cặn để kiểm tra phương pháp điện di SDS-PAGE Kỹ thuật điện di biến tính gel polyacrylamid (SDSPAGE) thực theo Laemmli (1970) với thiết bị hãng Bio-rad Vạch protein phát cách nhuộm màng dung dịch nhuộm (100 mM Tris; 100 mM NaCl; mM MgCl2; 75 µg/ml BCIP (5-bromo, 4-chloro, 3-indolylphosphate); 150 µg/ml NBT (nitroblue tetrazolium); pH 8,9), quan sát màu, ngừng phản ứng nhuộm cách rửa màng với nước Kỹ thuật lai miễn dịch (Western Bloting) Protein tổng số phân tích gel acrylamide thấm chuyển sang màng nitrocellulose PVDF thiết bị lai (Mini-Transblotter) điều kiện 22 mA 16 h 4oC dung dịch đệm chuyển (25 mM Tris-HCl, 192 mM Glycine, 20% Methanol, pH 8,3) Màng ủ đệm TBS (20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 7,5) với 5% sữa tách béo h nhiệt độ phòng Tiếp theo ủ màng với dung dịch pha lỗng kháng thể thứ h nhiệt độ phòng Rửa màng lần lần 10 phút đệm TBS với 0,5% sữa để loại bỏ kháng thể dư thừa Ủ tiếp với kháng thể thứ hai liên kết với alkaline photphatase h nhiệt độ phịng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khai thác trình tự mã hóa cho chitinase từ sở liệu DNA metagenome vi sinh vật đất vùng rễ cà phê Từ liệu DNA metagenomes vi sinh vật đất vùng rễ, khai thác 10 nhóm gen phân giải chitin bao gồm alpha-Nacetylglucosaminidase, beta-Nacetylglucosaminidase, chitinase, Nacetylglucosamine-6-sulfatase, Nacetylglucosamine-6-phosphate deacetylase, UDP2,3-diacylglucosamine hydrolase, glucosamine-6phosphate deaminase, exo-1,4-beta-Dglucosaminidase, N-acetylglucosamine-1phosphodiester alpha-N- acetylglucosaminidase Dựa liệu CAZy tìm 56 trình tự gen hồn chỉnh mã hóa chitinase liệu metagenome vi sinh vật cà phê Trong số đó, có trình tự xem gen với độ tương đồng