Khóa luận tối ưu hóa quy trình chiết xuất alkaloid trong cây dừa cạn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH DƢƠNG PHƢƠNG QUỲNH TỐI ƢU HĨA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT ALKALOID TRONG CÂY DỪA CẠN ( CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G DON APOCYNACEAE) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC TP Hồ Chí Minh – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH DƢƠNG PHƢƠNG QUỲNH TỐI ƢU HĨA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT ALKALOID TRONG CÂY DỪA CẠN ( CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G DON APOCYNACEAE) Chuyên ngành: Sản xuất phát triển thuốc KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC Hƣớng dẫn khoa học: Ths Nguyễn Thị Hồng Phúc TP Hồ Chí Minh - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố công trình khác Chữ ký SV DƢƠNG PHƢƠNG QUỲNH LỜI CẢM ƠN Khơng có thành cơng mà khơng có bàn tay dìu dắt giúp đỡ Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nguyễn Tất Thành tạo hội điều kiện để em thực đề tài Em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến Cô PGS TS Võ Thị Bạch Huệ Cô Ths Nguyễn Thị Hồng Phúc dìu dắt dẫn em suốt q trình nghiên cứu giúp em hồn thành khóa luận Em xin cảm ơn Thầy, Cơ hội đồng đồng ý phản biện cho đề tài em Em xin gởi lời cảm ơn tới anh chị kỹ thuật viên môn giúp đỡ vào tạo điều kiện sở vật chất dụng cụ suốt thời gian em thực đề tài Em xin gởi lời cảm ơn đến Thầy, Cô môn khoa Dƣợc – trƣờng Đại học Nguyễn Tất Thành cho em mƣợn thiết bị, dụng cụ hóa chất nhằm phục vụ cho mục đích nghiên cứu Em xin trân trọng cảm ơn MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC HÌNH ẢNH iv DANH MỤC BẢNG BIỂU v ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .2 1.1 TỔNG QUAN THỰC VẬT .2 1.1.1 Catharanthus .2 1.1.2 Catharanthus roseus (L.) G Don .3 1.1.3 Các hợp chất alkaloid Catharanthus roseus (L.) G Don 1.1.4 Các Vinca alkaloid 10 1.2 Phƣơng pháp chiết xuất, định tính định lƣợng alkaloid 14 1.2.1 Chiết xuất 14 1.2.2 Định tính 18 1.2.3 Định lƣợng 20 1.3 Tối ƣu hóa phần mềm 22 1.3.1 Giới thiệu chung 22 1.3.2 Phƣơng pháp tối ƣu hóa 22 1.3.3 Phần mềm tối ƣu hóa Modde 5.0 23 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 24 2.1.1 Nguyên liệu .24 2.1.2 Dung mơi, hóa chất 24 2.1.3 Trang thiết bị 25 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Chọn alkaloid để định hƣớng chiết 26 2.2.2 Khảo sát hợp chất alkaloid dƣợc liệu Dừa cạn 28 i 2.2.3 Tối ƣu hóa quy trình chiết alkaloid (định hƣớng vinblastin) từ Dừa cạn 30 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .32 3.1 Chọn alkaloid để định hƣớng chiết 32 3.1.1 Định tính alkaloid thuốc tiêm Cytoblastin .32 3.1.2 Chiết alkaloid thuốc tiêm .34 3.1.3 Xác định khối lƣợng phân tử chất chiết đƣợc từ thuốc tiêm phƣơng pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ (MS ) 34 3.1.4 Khảo sát cực đại hấp thụ alkaloid thuốc tiêm Cytoblastin 10mg/ 10ml phƣơng pháp quang phổ .35 3.1.5 Xây dựng đƣờng chuẩn alkaloid sulfat nƣớc 36 3.2 Khảo sát hợp chất alkaloid dƣợc liệu Dừa cạn .38 3.2.1 Sơ khảo sát thực vật 38 3.2.2 Định tính alkaloid dƣợc liệu Dừa cạn 40 3.2.3 Xây dựng quy trình chiết alkaloid (định hƣớng vinblastin) từ Dừa cạn .43 3.3 Tối ƣu hóa quy trình chiết xuất alkaloid (định hƣớng vinblastin) từ Dừa cạn 49 3.3.1 Xây dựng thí nghiệm tối ƣu hóa .49 3.3.2 Kết tối ƣu hóa 51 3.3.3 Phân tích tƣơng tác ảnh hƣởng yếu tố 54 3.3.4 Kết dự đoán 56 3.4 Bàn luận 57 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 4.1 Kết luận 58 4.2 Kiến nghị 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ii DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT STT C ữ v ết tắt Chữ viết đầy đủ tiếng Anh VB Vinblastin VC Vincristine SKLM UV-Vis HPLC ESI-MS DĐVN ng tiếng Việt Sắc ký lớp mỏng Ultra violet–visible High-performance liquid Tử ngoại – khả kiến chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao Electrospray Ionization - Phƣơng pháp khối phổ với Mass Spectrometer ion hóa phun điện Dƣợc điển Việt Nam iii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1 Cơng thức cấu tạo Vinblastin 10 Hình Cơng thức cấu tạo Vincristin 12 Hình Sơ đồ chiết xuất alkaloid dung môi hữu môi trƣờng kiềm 15 Hình Sơ đồ chiết xuất alkaloid nƣớc acid 16 Hình Sơ đồ tổng quát chiết xuất alkaloid từ dƣợc liệu 29 Hình Sắc ký đồ định tính alkaloid (vinblastine) thuốc tiêm Cytoblastin (1) dịch chiết từ thuốc tiêm (2) 33 Hình Phổ khối ESI-MS dịch chiết từ thuốc tiêm Cytoblastin 34 Hình 3 Phổ UV-Vis vinblastine sulfat nƣớc 35 Hình Phổ UV-Vis vinblastine base methanol 36 Hình Đƣờng chuẩn thể phụ thuộc độ hấp thụ vào nồng độ vinblastine sulfat .37 Hình Soi bột dƣợc liệu Dừa cạn 39 Hình Sắc ký đồ xác định vinblastine (C) dịch chiết (T) Dừa cạn .41 Hình Sơ đồ quy trình chiết xuất alkaloid chi tiết 43 Hình Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết bƣớc 44 Hình 10 Sắc ký đồ dịch dung môi loại chlorophyll (dịch A) .46 Hình 11 Sắc ký đồ dịch alkaloid toàn phần (dịch B) 47 Hình 12 Sắc ký đồ so sánh dung mơi chiết tách alkaloid base tồn phần (dịch B) 48 Hình 13 Sắc ký đồ dung dịch thí nghiệm 51 Hình 14 Kết thể mức ảnh hƣởng yếu tố tối ƣu hóa 53 Hình 15 Hệ số biến thiên yếu tố ảnh hƣởng 53 Hình 16 Đƣờng cong thể tƣơng tác yếu tố khảo sát 54 Hình 17 Đƣờng thẳng thể mối quan hệ kết dự đoán kết thực tế 56 iv DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Dung môi hóa chất cần dùng 24 Bảng 2 Các thiết bị sử dụng 25 Bảng Nồng độ dung dịch thu đƣợc .27 Bảng Các yếu tố ảnh hƣởng mức độ biến đổi 31 Bảng Kết định tính alkaloid thuốc tiêm Cytoblastin phƣơng pháp hóa học 32 Bảng Độ hấp thụ dung dịch từ mẫu thuốc thử Cytoblastin 36 Bảng 3 Kết định tính alkaloid bột dƣợc liệu 40 Bảng Kết khảo sát dung môi chiết bƣớc (theo hình 2.1) .44 Bảng Kết khảo sát dung môi loại chlorophyll bƣớc 46 Bảng Kết khảo sát dung môi chiết tách alkaloid base bƣớc 48 Bảng Các thí nghiệm tối ƣu hóa xây dựng đƣợc 50 Bảng Kết thông số đánh giá mơ hình thiết kế tối ƣu hóa .52 Bảng Điều kiện tối ƣu hóa dự đoán 56 Bảng 10 Kết thực lần điều kiện tối ƣu 57 v Khóa luận tốt nghiệp dƣợc s đại học - Năm ọc 2017 – 2018 Tố ƣu ó quy trìn c ết xuất alkaloid Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don Apocynaceace) Dƣơng P ƣơng Quỳnh Hƣớng dẫn khoa học: Ths Nguyễn Thị Hồng Phúc ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, ung thƣ trở thành bệnh nguy hiểm đe dọa đến tính mạng ngƣời Tuy nhiên, thuốc điều trị ung thƣ hạn chế Từ năm 60 kỉ trƣớc, nhà khoa học tìm đƣợc cơng dụng giúp điều trị ung thƣ hợp chất vinca alkaloid Dừa cạn Thế nhƣng, hàm lƣợng alkaloid khơng nhiều, vậy, nhằm xác định điều kiện tối ƣu để chiết xuất alkaloid Dừa cạn, đề tài “Tố ƣu ó quy trình chiết xuất alkaloid Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don)” đƣợc thực ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: Dƣợc liệu toàn Dừa cạn khô mua hiệu thuốc đông y đƣờng Hải Thƣợng Lãn Ông, Quận 5, Thành phố Hồ Chí Minh Chất đối chiếu vinblastin sulfat chiết từ dung dịch thuốc tiêm Cytoblastin công ty Cipla Pharma Phương pháp nghiên cứu: Xác định vinblastin từ thuốc tiêm; khảo sát hợp chất alkaloid dƣợc liệu Dừa cạn tối ƣu hóa quy trình chiết xuất alkaloid Dừa cạn KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Đề tài hoàn thành mục tiêu đƣa thu đƣợc kết nhƣ sau: - Xác định vinblastin từ thuốc tiêm bằng: phản ứng hóa học, SKLM, khối phổ MS Sử dụng vinblastin làm chất đối chiếu định tính alkaloid từ bột dƣợc liệu Khảo sát đƣợc cực đại hấp thụ xây dựng đƣờng chuẩn vinblastin phƣơng pháp quang phổ UV-Vis - Định tính sơ dƣợc liệu Dừa cạn phƣơng pháp soi bột định tính alkaloid bột Dừa cạn phƣơng pháp hóa học sắc ký lớp mỏng - Khảo sát dung môi xây dựng đƣợc quy trình chiết xuất alkaloid tồn phần (định hƣớng vinblastin) với dung môi chiết ban đầu ethanol 80 %, dung môi loại chlorophyll hexan dung môi chiết tách alkaloid base từ dịch acid chloroform - Tối ƣu hóa quy trình chiết xuất alkaloid từ Dừa cạn phần mềm Modde 5.0 chọn đƣợc điều kiện tối ƣu để chiết xuất alkaloid từ Dừa cạn: tỷ lệ dung môi/ dƣợc liệu 5:1 (tt/kl), thời gian ngâm lạnh 18 pH kiềm hóa KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Sau tháng, đề tài đã thực đƣợc mục tiêu đề ra: Xác định vinblastin từ thuốc tiêm, khảo sát hợp chất alkaloid dƣợc liệu Dừa cạn tối ƣu hóa quy trình chiết xuất alkaloid Dừa cạn Từ khóa: Dừa cạn, tối ƣu hóa, Catharanthus roseus, vinblastin, alkaloid 4.2 Kiến nghị Vì thời gian thực có hạn, tiếp tục, dựa kết đạt đƣợc từ nghiên cứu để: Xây dựng thẩm định quy trình định lƣợng alkaloid tồn phần (định hƣớng vinblastin) phƣơng pháp: chuẩn độ acid-base môi trƣờng khan, quang phổ UV-Vis, HPLC Dùng quy trình chiết alkaloid tối ƣu hóa để chiết alkaloid tồn phần, sau phân lập tinh chế alkaloid có giá trị y học nhƣ vinblastin, vincristin ajmacilin Ứng dụng quy trình chiết alkaloid từ Dừa cạn nhiều nguồn thu hái khác đánh giá hàm lƣợng alkaloid tồn phần (định hƣớng vinblastin) có dƣợc liệu nguồn 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 974975, 1144-1146 Bộ Y tế (2017), Dược thư Quốc gia Việt Nam, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 1467-1468 Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chƣơng, Nguyễn Thƣợng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 689-694 Võ Văn Chi (2000), Cây thuốc trị bệnh thông dụng, Nhà xuất Thanh Hóa, Thanh Hóa, tr 115-116 Phạm Thanh Kỳ (2015), Dược liệu học tập II, Bộ Y Tế, Hà Nội, tr 9-174 Đỗ Tất Lợi (2006), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 307-309 Trần Văn Thanh (2002), Nghiên cứu chiết xuất ajmacilin từ rễ Dừa cạn (Catharanthus roseus G Don) bào chế viên nén ajmacilin, Luận án tiến sĩ Dƣợc học, Đại học Dƣợc Hà Nội Tài liệu tham khảo tiếng Anh A JMP, Marcel Proust (2012), "Modeling and multivariate methods", JMP Inc., Cary, pp 1-9 Naznin Ara, Mamunur Rashid, MS Shah Amran (2009), "Comparison of hypotensive and hypolipidemic effects of Catharanthus roseus leaves extract with Atenolol on Adrenaline induced hypertensive rats ", Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences 22, pp 267-271 10 Rajesh Arora (1998), Biotechnological Studies in Catharanthus roseus L (G) Don vis-à-vis Secondary Metabolite Production, PhD, Lucknow and Chaudhary Charan Singh 11 Rajesh Arora, Poonam Malhotra, Ajay K Mathur, Archna Mathur, Cm Govil, Ps Ahuja (2009), "Anticancer Alkaloids of Catharanthus roseus: Transition from Traditional to Modern Medicine", Herbal Medicine: A Cancer Chemopreventive and Therapeutic Perspective, pp 293-310 12 S Balaabirami, S.Patharajan (2012), "Invitro antimicrobial and antifungal activity of Catharanthus roseus leaves extract against important pathogenic organisms", International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 4, pp 487-490 13 Bonadonna, Gianni, Zucali, Roberto, Monfardini, Silvio, de Lena, Mario, Uslenghi, Carlo (1975), "Combination chemotherapy of Hodgkin's disease with adriamycin, bleomycin, vinblastine, and imidazole carboxamide versus MOPP", Cancer, 36(1), pp 252-259 14 Lawrence H Einhorn, John Donohue., (1977), "Cis-diamminedichloroplatinum, vinblastine, and bleomycin combination chemotherapy in disseminated testicular cancer", Annals of internal medicine, 87(3), pp 293-298 15 PA Ellis, IE Smith, JR Hardy, MC Nicolson, DC Talbot, SE Ashley, K Priest (1995), "Symptom relief with MVP (mitomycin C, vinblastine and cisplatin) chemotherapy in advanced non-small-cell lung cancer", British journal of cancer, 71(2), pp 366 16 Kyakulaga A Hassan, Alinda T Brenda, Vudriko Patrick, Ogwang E Patrick (2011), "In vivo antidiarrheal activity of the ethanolic leaf extract of Catharanthus roseus Linn (Apocyanaceae) in Wistar rats", African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 5(15), pp 1797-1800 17 M A Islam, M Afia Akhtar, M R I Khan, M S Hossain, M K Alam, M I I Wahed, B M Rahman, A S M Anisuzzaman, S M Shaheen, Maruf Ahmed (2009), "Antidiabetic and Hypolipidemic Effects of Different Fractions of Catharanthus Roseus (Linn.) on Normal and Streptozotocin-induced Diabetic Rats", JOURNAL OF SCIENTIFIC RESEARCH, 2, pp 334-344 18 Kratika Kumari, Sharmita Gupta (2011), "Antifungal properties of leaf extract of Catharanthus roseus (G.) Don", American Journal of Phytomedicine and Clinical Therapeutics 19 Alvaro Lassaletta, Katrin Scheinemann, Shayna M Zelcer, Juliette Hukin, Beverley A Wilson, Nada Jabado, Anne Sophie Carret, Lucie Lafay-Cousin, Valerie Larouche, Cynthia E Hawkins, Gregory Russell Pond, Ken Poskitt, Daniel Keene, Donna L Johnston, David D Eisenstat, Rahul Krishnatry, Matthew Mistry, Anthony Arnoldo, Vijay Ramaswamy, Annie Huang, Ute Bartels, Uri Tabori, Eric Bouffet (2016), "Phase II Weekly Vinblastine for Chemotherapy-Naïve Children With Progressive Low-Grade Glioma: A Canadian Pediatric Brain Tumor Consortium Study", Journal of Clinical Oncology, 34(29), pp 3537-3543 20 Giuseppe Musumarra, Salvatore Scire (2001), "MODDE, Version 5.0, available from UMETRICS AB", Journal of Chemometrics, pp 199-200 21 B.S Nayak, M Anderson, L.M Pinto Pereira (2007), "Evaluation of woundhealing potential of Catharanthus roseus leaf extract in rats", Fitoterapia 78, pp 540–544 22 R.L Noble, C.T Beer, J.H Cutts (1958), "Role of chance observations in chemotherapy: Vinca rosea", Annals of the New York Academy of Sciences, 76(3), pp 882–894 23 Al Rashid (1970), "Successful treatment of an infant with Letterer-Siwe disease with Vinblastine sulfate", Clinical Pediatrics 9(8), pp 494–496 24 N.Irving Sax (1984), Dangerous Properties of Industrial Materials, Van Nostrand Reinhold Company, New York 25 Magdi El-Sayed, Young H Choi, M Frédérich, Sittiruk Roytrakul1, Rob Verpoorte (2004), "Alkaloid accumulation in Catharanthus roseus cell suspension cultures fed with stemmadenine", Biotechnology Letters 26, pp 793– 798 26 CN Sternberg, A Yagoda , HI Scher, RC Watson, N Geller, HW Herr, MJ Morse, PC Sogani, ED Vaughan, N Bander (1989), "Methotrexate, vinblastine, doxorubicin, and cisplatin for advanced transitional cell carcinoma of the urothelium Efficacy and patterns of response and relapse", Cancer, 64(12), pp 2448-2458 27 A Tazi, G Lorillon, J Haroche, A Neel, S Dominique, A Aouba, J.D Bouaziz, C de Margerie-Melon, E BugnE , V Cottin, T Comont, C Lavigne, J.E Kahn, J Donadieu, S Chevret (2017), "Vinblastine chemotherapy in adult patients with langerhans cell histiocytosis: a multicenter retrospective study", Orphanet J Rare Dis, 12(1), pp 95 28 Robert Verpoorte, A Contin, J Memelink (2002), "Biotechnology for the production of plant secondary metabolites", Phytochemistry Reviews, 1(1), pp 13-25 29 Widowati, Wahyu, Mozef, Tjandrawati, Risdian, Chandra, Yellianty, Yellianty (2013), "Anticancer and free radical scavenging potency of Catharanthus roseus, Dendrophthoe petandra, Piper betle and Curcuma mangga extracts in breast cancer cell lines", Oxidants and Antioxidants in Medical Science, 2(2), pp 137142 30 "Classification for Kingdom Plantae Down to Species Catharanthus roseus (L.) G Don", https://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=display&classid=CAR O14, ĐH NGUYỄN TẤT THÀNH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA DƢỢC TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2018 GIẤY XÁC NHẬN ĐÃ BỔ SUNG, SỬA CHỮA KHÓA LUẬN THEO Ý KIẾN ĐÓNG GÓP CỦA HỘI ĐỒNG Tên đề tài khóa luận: Tối ƣu hóa quy trình chiết xuất alkaloid Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don Apocynaceace) Họ tên sinh viên: DƢƠNG PHƢƠNG QUỲNH Giảng viên hƣớng dẫn: Ths Nguyễn Thị Hồng Phúc Khóa luận đƣợc bổ sung, sửa chữa nội dung sau: Bổ sung chi tiết thiếu Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Bổ sung tài liệu tham khảo mục 1.2.1, 1.2.2 1.2.3 phần chọn yếu tố độc lập mục 2.2.3 Bổ sung R2 đƣờng thẳng thể mối quan hệ kết dự đoán kết thực tế Chia tài liệu tham khảo thành mục Tiếng Việt, Tiếng Anh Web Chỉnh sửa giá trị yếu tố “Tỷ lệ dung môi/dƣợc liệu” Giảng v ên ƣớng dẫn Sinh viên thực Chủ tịch Hộ đồng Giáo viên phản biện ... thuốc tiêm, khảo sát hợp chất alkaloid dƣợc liệu Dừa cạn tối ƣu hóa quy trình chiết xuất alkaloid Dừa cạn Từ khóa: Dừa cạn, tối ƣu hóa, Catharanthus roseus, vinblastin, alkaloid Final essay for... vinca alkaloid Dừa cạn Thế nhƣng, hàm lƣợng alkaloid khơng nhiều, vậy, nhằm xác định điều kiện tối ƣu để chiết xuất alkaloid Dừa cạn, đề tài “Tố ƣu ó quy trình chiết xuất alkaloid Dừa cạn (Catharanthus... 3.2.2 Định tính alkaloid dƣợc liệu Dừa cạn 40 3.2.3 Xây dựng quy trình chiết alkaloid (định hƣớng vinblastin) từ Dừa cạn .43 3.3 Tối ƣu hóa quy trình chiết xuất alkaloid (định