Bài giảng Kỹ thuật phân tích trong vi sinh vật - Bùi Hồng Quân

Bài giảng Kỹ thuật phân tích trong vi sinh vật cung cấp cho người học những kiến thức như: Giới thiệu về vi sinh trong thực phẩm; Phương pháp lấy mẫu, bảo quản, vận chuyển; Môi trường nuôi cấy-Phương pháp chung xác định vi sinh vật;...Mời các bạn cùng tham khảo!

INDUSTRIAL UNIVERSITY OF HCMC Institute of Biotechnology and Foodtechnology Biotechnology Department ANALYTICAL TECHNIQUE IN MICROBIOLOGY Lecturer: Bui Hong Quan W: http://buihongquan.com (Or google Bui Hong Quan for more information) HP: 0917035038 | Personal Email: buihongquan@gbd.edu.vn Course email: ktptvs@gbd.edu.vn 12/22/2017 http://buihongquan.com | buihongquan@gbd.edu.vn Project Based Learning  03 nhóm phụ trách phần này Mỗi nhóm trình bày 02 chỉ tiêu:  Tổng số vi khuẩn hiếu khí  Coliforms – E.coli  Salmonella spp  Staphylococcus aureus  Bacillus cereus  Clostridium perfringiens  Vibrio cholerae/paraheamolyticus  Tổng nấm men, nấm mốc thực phẩm 12/22/2017 http://buihongquan.com | buihongquan@gbd.edu.vn Khái niệm Thực phẩm bị ô nhiễm tác nhân sinh học bị giảm chất lượng, biến chất, hư hỏng gây ngộ độc cho người sử dụng Ngộ độc thực phẩm vi sinh vật người sử dụng thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh xảy tình trạng bệnh lý vi sinh vật độc tố vi sinh vật gây 12/22/2017 http://buihongquan.com | buihongquan@gbd.edu.vn 12/22/2017 http://buihongquan.com | buihongquan@gbd.edu.vn Côn Trùng VSV Vật nuôi Sinh vật Loài gặm nhấm Kí sinh trùng 12/22/2017 http://buihongquan.com | buihongquan@gbd.edu.vn NGỘ ĐỘC DO TÁC NHÂN SINH HỌC 12/22/2017 - Giảm chất lượng - Biến chất - Hư hỏng - Gây ngộ độc cho người sử dụng http://buihongquan.com | buihongquan@gbd.edu.vn Ngộ độc thực phẩm Vsv gây bệnh Thực phẩm VSV CON NGƯỜI ??? độc tố Vsv 12/22/2017 http://buihongquan.com | buihongquan@gbd.edu.vn Nấm mốc Virus Vi sinh vật Tảo Vi khuẩn** Ký sinh trùng 12/22/2017 http://buihongquan.com | buihongquan@gbd.edu.vn VSV Thịt Giàu P Sữa… Độ ẩm cao Thực phẩm pH kiềm Trạng thái hóa lý … 12/22/2017 Thủy hải sản Trứng… Rau http://buihongquan.com | buihongquan@gbd.edu.vn 10 Điện di gel (gel eletrophoresis)  Lầ kỹ thuậ t được sử dụ ng để tấ ch cấ c đoậ n DNA (hoậ c cấ c đậ i phân tử khấ c RNA và protein) dựa vầ o kích thước và điệ n tích củ a chú ng  DNA được đưâ vầ o cấ c giế ng tậ i mọ t đầ u củ a khó i gel, dò ng điệ n sễ được đưâ vầ o khó i gel để kế o cấ c DNA di chuyể n giế ng được giữ để lầ m thang DNA  DNA tích điệ n âm nên sễ di chuyể n đế n đầ u mang điệ n dương củ a khó i gel Cấ c đoậ n DNA cầ ng ngấ n di chuyể n cầ ng nhanh  Khi gel được nhuọ m bầ ng chấ t nhuọ m liên kế t với DNA, cấ c đoậ n DNA sễ được thể hiệ n dưới dậ ng cấ c dẩ i (bands), mõ i dẩ i nầ y đậ i diệ n cho nhó m cấ c DNA có cù ng kích thước 12/22/2017 http://buihongquan.com | buihongquan@gbd.edu.vn 434 12/22/2017 http://buihongquan.com | buihongquan@gbd.edu.vn 435 Đọc kết quả điện di  Nhuọ m gel bầ ng chấ t nhuọ m liên kế t với DNA và đậ t gel dưới đề n UV  DNA sễ phấ t sấ ng, biể u hiệ n lầ từng dẩ i sấ ng phân bố ở những vị trí khấ c gel  Bầ ng cấ ch đó i chiế u vị trí củ a cấ c dẩ i với thang DNA, kích thước tương đó i củ a cấ c đoậ n DNA có thể được xấ c định 12/22/2017 http://buihongquan.com | buihongquan@gbd.edu.vn 436 Một số vấn đề thường gặp  Khơng có sản phẩm lượng sản phẩm thấp  Kiểm tra lại DNA mẫu, thao tác  Tăng thời gian kéo dài, sớ chu kỳ, nhiệt độ biến tính  Hạ nhiêt độ gắn mồi  Primer, buffer 12/22/2017 http://buihongquan.com | buihongquan@gbd.edu.vn 437 Một số vấn đề thường gặp  Vệt smear kích thước lớn sản phẩm mong ḿn  Giảm DNA, thời gian kéo dài, số chu kỳ  Tăng nhiệt độ gắn mồi  Thay đổi nồng độ Mg2+  Tăng thời gian kéo dài nếu sp mear có kt nhỏ 12/22/2017 http://buihongquan.com | buihongquan@gbd.edu.vn 438 Một số vấn đề thường gặp Băng sản phẩm phụ rõ nét với kích thước thấp sản phẩm mong muốn         12/22/2017 Tăng nhiệt độ bắt mồi 2°C và/hoặc tăng thời gian bắt mồi Tăng thời gian kéo dài thêm 30s Giảm nồng độ DNA polymerase Tối ưu hóa nồng độ Mg2+ Tinh DNA template Giảm nồng độ primer Thiết kế cặp primer http://buihongquan.com | buihongquan@gbd.edu.vn 439 Real time PCR Real 12/22/2017 http://buihongquan.com | buihongquan@gbd.edu.vn 440  PCR cổ điể n: khuế ch đậ i đoậ n DNA đích  điệ n di  đọ c kế t quẩ  Realtime-PCR: kế t quẩ khuế ch đậ i được hiể n thị cù ng lú c với mõ i chu kỳ nhiệ t phẩ n ứng 12/22/2017 http://buihongquan.com | buihongquan@gbd.edu.vn 441  Moät máy luân nhiệt  Một hệ thống phát đọc tín hiệu huỳnh quang  Chương trìnhhttp://buihongquan.com vi tính để theo dõi phân tích kết 12/22/2017 | buihongquan@gbd.edu.vn 442 Quá trình nhân ADN phản ứng PCR Số lượng ADN Pha bình nguyên Pha chậm Thềm phát Pha log Trong pha Log : 12/22/2017 Qn = Q0 (E)n Qn = Số sau n chu kỳ Q0 = Số khởi đầu E = Hiệu suất PCR n = số chu kỳ http://buihongquan.com | buihongquan@gbd.edu.vn 443 A-6 A-5 A-4 A-3 A-2 A-1 A1 PCR cổ điển : kết biết sau tất vòng phản ứng hoàn thaønh A-6 = 10-6 ng A-5 = 10-5ng A-4 = 10-4ng A-3 = 10-3ng A-2 = 10-2ng A-1 = 10-1ng A1 = 1ng Real-Time PCR : trình nhân ADN theo dõi trực chu kỳ Với kỹ thuật này, ADN ban đầu định lượng cách xác 12/22/2017 http://buihongquan.com | buihongquan@gbd.edu.vn 444 Phương pháp tạo huỳnh quang dùng SYBRGreen Kích thích 490nm Phát quang 530nm SYBRGreen phát huỳnh quang chèn mạch ADN Tín hiệu huỳnh quang đo sau giai đoạn kéo dài chu kỳ PCR Ưu điểm : rẻ, đơn giản Nhược điểm : không đặc hiệu 12/22/2017 http://buihongquan.com | buihongquan@gbd.edu.vn 445 Ứng dụng PCR Tạo dịng DNA Tìm hiểu mức biểu củâ gen (Reverse Transcription PCR) Chẩn đoán bệnh (củâ người, súc vật, cối) Phát đột biến Kiểm trâ chất lượng (thực phẩm, GMO, ô nhiễm nước…)  Phát khác biệt giữâ gên (Đâ dạng gen): Á p dụng nông nghiệp để chọn lọc cây, Dấu ấn gên (Tìm châ mẹ, thủ phạm vụ án, giải đáp bí mật lịch sử…) 12/22/2017 http://buihongquan.com | buihongquan@gbd.edu.vn 446 Xác định VSV bằng pp PCR  Mẫ u  ly trích DNA  khuế ch đậ i DNA (PCR)  KQ  Ly trích DNA:  Phá vỡ TB và giẩ i phó ng thầ nh phầ n bên (lysozyme, SDS)  Lầ m sậ ch DNA (loậ i bỏ protêin, lipid… - kế t tủ a phân đoậ n, DNA nầ m pha nước)  Tủ a DNA (cò n, isopropanol)  thu hò i DNA 12/22/2017 http://buihongquan.com | buihongquan@gbd.edu.vn 447 TÓM TẮT QUY TRÌNH THỰC HIỆN MỘT PHẢN ỨNG PCR Thiết kế mồi Chuẩn bị mẫu DNA Phâ mix với thành phần thêo thứ tự sâu:  H2O tiệt trùng  Buffer  dNTP tổng số  mồi xuôi  mồi ngược  taq polymerase  DNA mẫu Cho vào máy lập chương trình chạy phù hợp Kiểm trâ sản phẩm PCR gêl âgârosê với có mặt củâ thâng chuẩn Phân tích kết 12/22/2017 http://buihongquan.com | buihongquan@gbd.edu.vn 448 ... 24 Coliform coliform phân - Hình que, Gram (-) , không tạo bào tử - Lên men lactose và sinh - t0 phát triển: (-) – 500C - pH: 4,4 – 9,0 - Nhiễm nước thực phẩm nhiễm phân - Loài tiêu biểu: E.coli,... Nhiễm vi sinh vật trình chế biến Thực phẩm tươi sống thu hoạch tốt, giết mổ và sơ chế thường có ít vi sinh vật Khi giết mổ sơ chế không đảm bảo vệ sinh sản phẩm bị nhiễm vi sinh vật. .. 26 -Escherichia coli - Hình que, không tạo bào tử - Gram (-) , catalase (+), oxidase (), - t0 phát triển: – 500C, topt: 370C - pHopt : 7, 0-7 ,5 - aw : 0.95 - Nhiễm từ phân - Gây bệnh đường ruột,