Nghiên cứu sản xuất bột đạm thủy phân từ sụn cá mập trắng (carcharhinus dussumieri) bằng enzyme protease TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐINH HỮU ĐÔNG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT BỘT ĐẠM THỦY PHÂN CHỨA CHONDROITIN SULFATE TỪ SỤN CÁ MẬP TRẮNG (CARCHARHINUS DUSSUMIERI) BẰNG ENZYME PROTEASE TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công nghệ chế biến thủy sản Mã số : 9540105 KHÁNH HỊA – 2021 Cơng trình hoàn thành Trường Đại học Nha Trang Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Vũ Ngọc Bội PGS.TS Nguyễn Anh Tuấn Phản biện 1: GS.TS Nguyễn Anh Dũng Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Thị Mỹ Hương Phản biện 3: PGS.TS Ngô Đại Nghiệp Luận án bảo vệ Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường Trường Đại học Nha Trang vào hồi 00 ngày 26 tháng 11 năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Thư viện Trường Đại học Nha Trang TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đề tài luận án: Nghiên cứu sản xuất bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate từ sụn cá mập trắng (Carcharhinus dussumieri) enzyme protease Chuyên ngành: Công nghệ chế biến thủy sản Mã số: 9540105 Nghiên cứu sinh: Đinh Hữu Đơng Khóa: 2014 Người hướng dẫn: PGS.TS Vũ Ngọc Bội PGS.TS Nguyễn Anh Tuấn Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang Nội dung: Luận án thu số kết bổ sung vào lĩnh vực nghiên cứu thủy phân tạo bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate từ sụn cá mập (C Dussumieri) định hướng ứng dụng thực phẩm chức năng: 1) Xác định thông số tối ưu cho trình thuỷ phân sụn cá mập là: tổ hợp enzyme Alcalase: Papain với tỷ lệ 60/40, nồng độ 0,3%; Tỷ lệ nguyên liệu:nước 1/1; pH thích hợp 6,8; nhiệt độ thuỷ phân 50oC thời gian 20 Hiệu suất thu hồi chondroitin sulfate 96,97% Dịch đạm thuỷ phân có lượng dinh dưỡng: 20,42 Kcal/100 ml, hàm lượng chondroitin sulfate: 40,5 mg/ml, Nitơ tổng số: 7,46 g/l, khoáng tổng số: 3,02 g/l, Zn: 7,63 mg/l, Mg: 205 mg/l, Fe: 4,78 mg/l, dịch có chứa 18 loại acid amin đạt tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm theo quy định hành Bộ Y tế 2) Xác định cấu trúc đặc trưng bảo toàn hai gốc sulfate C4 C6 sản phẩm chondroitin sulfate Sản phẩm hỗn hợp gồm đồng phân GlcA-GalNAc-4SO3- GlcA-GalNAc-6SO3- 3) Xác định thông số tối ưu cho trình sấy phun tạo bột đạm chứa chondroitin sulfate từ dịch thuỷ phân sụn cá mập là: 12% chất mang maltodextrin, nhiệt độ buồng sấy 80oC, tốc độ dòng 12 ml/phút áp suất buồng sấy 2,5bar Hiệu suất thu hồi chondroitin sulfate 87,81% Sản phẩm có hàm lượng chondroitin sulfate 203mg/g, nito tổng số 5,04g/100g, tro tổng số 3,95g/100g, độ ẩm 4,27% đạt tiêu chuẩn vi sinh vật dùng thực phẩm theo qui định Bộ Y tế 4) Xác định qui trình sản xuất bột đạm thuỷ phân chứa chondroitin sulfate từ dịch thủy phân sụn cá mập tươi enzyme protease quy mơ thí nghiệm Sản phẩm bột đạm chứa chondroitin sulfate đạt tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm theo quy định hành Bộ Y tế CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS Vũ Ngọc Bội NGHIÊN CỨU SINH CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS TS Nguyễn Anh Tuấn Đinh Hữu Đông MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Chondroitin sulfate (CS) thành phần cấu tạo nên sụn khớp tổ chức sợi chun (gân, cơ, dây chằng…) giúp cho vận động linh hoạt tính đàn hồi hoạt động khớp Chondroitin sulfate làm tăng sản xuất chất nhầy khả bôi trơn dịch khớp, đảm bảo chức vận động linh hoạt khớp Chondroitin sulfate cịn có vai trị bảo vệ sụn khớp cách ức chế enzyme phá hủy sụn khớp Vì vậy, chondroitin sulfate sử dụng để hỗ trợ điều trị bệnh lý xương khớp, hạn chế q trình thối hố khớp Ngồi ra, chondroitin sulfate góp phần ni duỡng tái tạo tế bào giác mạc mắt Chondroitin sulfate chủ yếu thu nhận từ nguồn nguyên liệu tự nhiên Trong đó, sụn cá mà đặc biệt sun cá mập thường có hàm lượng chondroitin sulfate cao loại động vật khác Chính thế, người ta thường sử dụng sụn cá hỗ trợ điều trị bệnh xương khớp Chondroitin sulfate thường liên kết với protein liên kết oglycosid tạo thành proteoglycan nằm cấu trúc mô sụn nên người khó hấp thụ Hiện có số nghiên cứu sử dụng tác nhân hóa học enzyme thủy phân sụn cá khơ tươi, sau kết tủa thu chondroitin sulfate dùng sản xuất thực phẩm chức Tuy vậy, việc thu nhận chondroitin sulfate dẫn đến lãng phí nguồn chất tự nhiên từ sụn cá hiệu sử dụng không cao Để khắc phục tượng này, tiến hành nghiên cứu sử dụng enzyme thủy phân sụn cá mập tươi với mong muốn tạo dịch thủy phân chứa chondroitin sulfate chất từ sụn cá định hướng sử dụng làm thực phẩm giúp hỗ trợ điều trị bệnh lý xương khớp chống thối hóa xương khớp Do vậy, Luận án tiến hành: “Nghiên cứu sản xuất bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate từ sụn cá mập trắng (Carcharhinus dussumieri) enzyme protease” Mục tiêu luận án Tận dụng nguồn nguyên liệu lại - sụn cá mập tươi chế biến tạo dịch thủy phân bột đạm chứa chondroitin sulfate chất tự nhiên từ sụn cá mập (C dussumieri) công nghệ enzyme protease thân thiện với môi trường định hướng sử dụng làm thực phẩm chức hỗ trợ điều trị chống thối hóa xương khớp Đối tượng phạm vi nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu Sụn cá mập trắng (C dussumieri) khai thác vùng biển Khánh Hòa 3.2 Phạm vi nghiên cứu 1) Nghiên cứu thủy phân sụn cá mập (C dussumieri) enzyme protease 2) Đánh giá chất lượng dịch thủy phân sụn cá mập xác định cấu trúc chondroitin sulfate 3) Nghiên cứu sấy phun tạo bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate Phương pháp nghiên cứu Luận án sử dụng phương pháp nghiên cứu Hoá sinh học, vi sinh vật có hỗ trợ lý thuyết tốn học để phát tính chất mới, mối quan hệ đại lượng kiểm chứng giả thuyết Các kết thí nghiệm xử lý thống kê, kiểm định so sánh giá trị trung bình nhóm phần mềm BoxBehnken, ANOVA, Minitab 20 JMP 10 Ngoài luận án sử dụng phương pháp thường sủ dụng phân tích cấu trúc chất để phân tích cấu trúc chondroitin sulfate Các đóng góp khoa học - Luận án lần tiến hành nghiên cứu cách toàn diện từ công đoạn thủy phân sụn cá mập tươi, … nghiên cứu sấy khô tạo bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate Kết nghiên cứu luận án có ý nghĩa khoa học làm phong phú thêm hiểu biết khả sử dụng protease thủy phân sụn cá mập - Luận án xác định hỗn hợp enzym alcalase - papain tác nhân thích hợp cho q trình thủy phân sụn cá mập (C dussumieri) xác định thơng số tối ưu cho q trình thủy phân sụn cá mập hỗn hợp enzyme alcalase-papain Mặt khác, luận án xác định số thông số tối ưu cho trình sấy phun tạo bột đạm chứa chondroitin sulfate từ dịch thủy phân sụn cá mập Kết nghiên cứu luận án áp dụng thực tế góp phần tạo sản phẩm thực phẩm có chứa chondroitin sulfate ứng dụng làm thực phẩm chức hỗ trợ điều trị bệnh lý xương khớp chống thối hóa khớp - Luận án xác định cấu trúc chondroitin sulfate từ sụn cá mập (C dussumieri) hỗn hợp gồm đồng phân, bao gồm chondroitin - - sulphate với mảnh cấu trúc đặc trưng GlcA-GalNAc4SO3- chondroitin - - sulphate với mảnh cấu trúc đặc trưng GlcAGalNAc-6 SO3- Kết cấu luận án Luận án gồm 155 trang, 38 trang phụ lục, trang liệt kê 93 tài liệu tham khảo Nội dung luận án gồm chương, có 17 bảng 101 đồ thị, hình ảnh CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHONDROITIN SULFATE VÀ ỨNG DỤNG * Cấu trúc chondroitin sulfate Chondroitin sulfate (CS) polysaccharid, thuộc nhóm heteropolysaccharid gọi glycosaminoglycan (GAG), tìm thấy tự nhiên dạng polyme mạch thẳng gồm đơn vị cấu tạo loại đường N-acetyl-D- galactosamine (GalNAc) D-glucuronic acid (GlcA) xen kẽ Các gốc đường sulphate hóa hay khơng bị sulphate hố, số gốc GlcA bị epime hoá thành L-iduronic acid (IdoA) Chondroitin sulfate polyme tự nhiên có chứa 15÷150 đơn vị cấu trúc đơn vị gồm loại đường GlcA GalNAc Khối lượng phân tử CS thường biến động khoảng 10.000 ÷ 100.000 Dalton CS thường gắn với protein liên kết o-glycosid tạo thành phức chất proteoglycan (PG) CS polyme ưa nước mơ sụn có hàm lượng nước cao Phân tử đường cấu trúc CS khơng bị sulphate hố, bị sulphate hố lần hay lần, đa phần nhóm OH vị trí carbon GalNAc sulphate hố, số chuỗi GAG bị sulphate hố vị trí GlcA GAG thành phần mơ sụn PG với protein acid hyaluronic tạo thành phức hệ thủy động học có khả nén thuận nghịch giúp cho mơ sụn chống lại ép nén với biến dạng nhỏ * Kỹ thuật thu nhận chondroitin sulfate Quá trình thu nhận chế phẩm CS thơ từ sụn cá thực phương pháp hố học phương pháp sinh học (dùng enzyme) để thuỷ phân sụn cá Trong phương pháp hố học, mơ sụn xử lý nước nóng dung dịch muối kiềm (NaOH) acid (HCl, CH3COOH, ) để tách GAG khỏi phân tử (protein, hyaluronic acid, …) Phương pháp áp dụng để thu CS từ sụn gà, sụn bò Tuy nhiên, nhược điểm phương pháp hóa học phá vỡ liên kết glycosid CS thu nhận CS Phương pháp sinh học dùng enzyme để thủy phân mô sụn, phương pháp có hiệu để thu nhận CS Do CS khơng bị biến đổi cấu trúc, giữ hoạt tính sinh học phương pháp không gây ô nhiễm mơi trường hóa chất (muối, kiềm, acid, ) gây nên Một số nghiên cứu cho sử dụng enzyme protease để thuỷ phân sụn giải phóng GAG khỏi protein liên kết Sau đó, loại bỏ protein CS tách tinh Các chuỗi dài hydrophilic polyme GAG không tan ethanol, acetone methanol Vì vậy, người ta sử dụng dung môi hữu để kết tủa thu CS thô tách CS khỏi polysaccharid khác * Ứng dụng chondroitin sulfate CS sử dụng rộng rãi chế phẩm thực phẩm bổ sung dinh dưỡng cho người ngày mở rộng ứng dụng lĩnh vực khác nhau, lĩnh vực y học, đặc biệt điều trị bệnh lý xương khớp CS chất sinh lý giác mạc, giúp trì độ suốt cho mắt, tạo độ nhớt thích hợp bồi bổ nội mô giác mạc, nuôi dưỡng tế bào giác mạc mắt, tái tạo lớp phím nước mắt trước giác mạc, tăng cường độ đàn hồi thấu kính, chống tình trạng khơ mắt CS có tác dụng giảm tổn thương thấu kính mắt CS dùng thuốc nhỏ mắt để phịng ngừa điều trị tình trạng khơ mắt, mỏi mắt, thối hố võng mạc Ngồi CS cịn có khả ức chế hình thành vi mao mạch tân sinh mà mô ung thư cần để phát triển, nên hạn chế phát triển khối u ác tính Một số nghiên cứu cho thấy sụn cá mập có khả giúp tăng cường hệ miễn dịch nên giúp giảm nhẹ chứng miễn dịch thấp khớp, đau nhức xương, vẩy nến, chàm, luput ban đỏ, Nhiều nghiên cứu cho thấy CS có khả tăng cường kháng viêm, ức chế tiết cytokine tiền viêm gốc oxy hóa tự 1.2 TÌNH HÌNH KHAI THÁC VÀ SỬ DỤNG SỤN CÁ MẬP Theo thống kê nhà khoa học, giới có 420 lồi cá mập với kích cỡ khác Việc khai thác, đánh bắt cá mập trở thành nghề trội, thu hút đa số ngư dân nước giáp với biển giới Người ta đánh bắt cá mập chủ yếu để lấy vi cá, vi cá mập có giá trị lớn thị trường giới Hiện nay, nước đánh bắt tiêu thụ vi cá mập lớn giới Mỹ Trung Quốc Ở Việt Nam có vùng khai thác cá mập Phú Yên, Nha Trang, Bình Định, Đặc khu hành Hồng Kong Trung Quốc, trung tâm thương mại mua bán vây cá mập lớn giới Người ta cho Hồng Kông thị trường nhập lượng đáng kể vây cá mập vây cá mập nhập tiêu thụ nước tái xuất Sự sụt giảm số lượng cá mập Thế giới cho đánh bắt mức nhiều loài cá mập khắp giới có liên quan đến việc mua bán vây chúng để sử dụng chế biến súp vây cá mập Hiện có quốc gia đánh cá lưu giữ liệu cách xác việc đánh bắt cá mập theo lồi Hiện khơng có sơ liệu thức tình hình khai thác cá mập Việt Nam Hiện Việt Nam có báo cáo kết điều tra tình hình khai thác nguồn lợi cá mập Nguyễn Văn Long Võ Sĩ Tuấn - Viện Hải dương học Nha Trang thực giai đoạn 2010 ÷ 2011 Kết điều tra Nguyễn Văn Long Võ Sĩ Tuấn cho thấy có khoảng 530 tầu thuyền tham gia khai thác cá nhám/mập Kết điều tra tác giả cho thấy có giảm mạnh số lượng phương tiện tham gia khai thác cá sản lượng khai thác Kết điều tra tác giả Nguyễn Văn Long Võ Sĩ Tuấn cho thấy nguồn lợi cá mập biển bị khai thác mức, đặc biệt vùng biển ven bờ Việt Nam * Một số sản phẩm từ sụn cá mập Sụn cá mập cho có nhiều dưỡng chất quý từ thiên nhiên collagen, chất đạm, khoáng chất thiết yếu cần thiết cho thể người, đặc biệt có chứa chondroitin sulfate nên sử dụng làm thực phẩm chức điều trị bệnh lý xương khớp tăng cường sức khỏe Hiện nay, thị trường có nhiều sản phẩm sụn cá mập đến từ quốc gia khác Mỹ, Canada, Úc, Các sản phẩm từ sụn cá mập quảng cáo nguồn bổ sung chất dinh dưỡng khoáng chất tốt cho sức khỏe người 1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ THỦY PHÂN SỤN CÁ MẬP Trên giới có số nghiên cứu thủy phân sụn động vật sụn cá rô phi, sụn gà, sụn cá mập, … phương pháp thủy phân sử dụng tác nhân hóa học phối hợp tác nhân hóa học enzyme protease Tuy vậy, nghiên cứu giới tập trung vào việc * Thuyết minh quy trình + Sụn cá mập: sụn cá mập có thành phần: Hàm lượng chondroitin sulfate: 41,77±0,21mg/g, hàm lượng tro tổng số: 4,2±0,11g/100g, hàm lượng nitơ tổng số: 2,64±0,02g/100g, độ ẩm 80,7±1,12% + Xay, bao gói cấp đơng: tiến hành xay nhỏ sụn cá mập máy xay thịt nhằm đồng mẫu bao gói bao bì PA 2kg/túi, hút chân khơng 100%, cấp đơng bảo quản đông -200C để dùng suốt trình nghiên cứu + Rã đơng: Trước thủy phân tiến hành rã đông nhanh thời gian phút lị vi sóng + Thủy phân: Tiến hành thủy phân sụn cá mập hỗn hợp enzyme alcalase - papain bể thủy phân theo thông số kỹ thuật sau: Tỉ lệ enzyme alcalase/papain 6:4; Nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase-papain 0,3%, tỉ lệ sụn/nước 50/50, nhiệt độ thủy phân 50oC, thủy phân pH tự nhiên (6,8) thời gian 20 + Bất hoạt enzyme: Kết thúc trình thủy phân, tiến hành bất hoạt enzyme cách đun sôi dịch thủy phân thời gian 10 phút + Lọc: tiến hành lọc sơ hỗn hợp thủy phân qua lớp vải lọc để thu dịch lọc thơ Sau đó, tiếp tục lọc dịch lọc thô qua hệ thống lọc hút chân khơng với kích cỡ lõi sứ cho phép chất qua có kích cỡ nhỏ 5m để thu dịch lọc Dịch lọc đun sôi thời gian 10 phút bảo quản ngăn mát tủ lạnh (4±1C) để dùng cho q trình phân tích nghiên cứu sấy phun (hình 3.4) Hình 3.4 Hình ảnh dịch thủy phân sụn cá mập 14 3.2 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG DỊCH THỦY PHÂN SỤN CÁ MẬP BẰNG HỖN HỢP ENZYME ALCALASE - PAPAIN VÀ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA CHONDROITIN SULFATE 3.2.1 Đánh giá chất lượng dịch thủy phân sụn cá mập Kết đánh giá thành phần hóa học, lượng dịch thủy phân Viện Pasteur Nha Trang Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia - Bộ Y tế trình bày bảng 3.2 ÷3.4 cho thấy dịch thủy phân sụn cá mập dạng lỏng, sánh, có mầu vàng nhạt, mùi vị đặc trưng giầu lượng 20,42 Kcal/100ml, giầu khoáng chất, đặc biệt giầu Magie: 205,49 mg/lít kẽm 7,63mg/lít - khống chất cần cho sức khỏe người Ngoài dịch thủy phân có chứa 18 acid amin đặc biệt có hàm lượng chondroitin sulfate tới 40,5mg/ml - thành phần cần thiết cho việc tái tạo mơ sụn, chống lão hóa sụn khớp người Kết phân tích cho thấy dịch thủy phân sụn cá mập đạt yêu cầu vi sinh vật theo Quy định hành Bộ Y Tế Như vậy, dịch thủy phân sụn cá mập sản xuất đạt tiêu chuẩn chất lượng để dùng thực phẩm định hướng làm thực phẩm chức Bảng 3.2 Thành phần hóa học lượng dịch thủy phân sụn cá mập Đơn vị Kết Hàm lượng nitơ tổng số g/lít 7,46 Năng lượng dinh dưỡng Kcal/100 ml 20,42 Hàm lượng khoáng tổng số g/lít 3,02 Hàm lượng Magie mg/lít 205,49 Hàm lượng kẽm mg/lít 7,63 Hàm lượng sắt mg/lít 4,78 Hàm lượng Thủy ngân mg/lít Khơng phát Hàm lượng Arsen mg/lít Khơng phát Hàm lượng protein thơ g/lít 46,63 10 Hàm lượng Alanine g/lít 2,617 11 Hàm lượng Arginine g/lít 7,921 STT Chỉ tiêu hóa học 15 12 Hàm lượng Aspartic g/lít 2,164 13 Hàm lượng Cysteine g/lít 0,254 14 Hàm lượng Cystine g/lít 0,469 15 Hàm lượng Glutamic g/lít 3,102 16 Hàm lượng Glycine g/lít 5,202 17 Hàm lượng Histidine g/lít 0,221 18 Hàm lượng Isoleucine g/lít 0,415 19 Hàm lượng Leucine g/lít 3,680 20 Hàm lượng Lysine g/lít 1,043 21 Hàm lượng Methionine g/lít 0,994 22 Hàm lượng Phenylalanine g/lít 0,653 23 Hàm lượng Tryptophane g/lít 0,129 24 Hàm lượng Serine g/lít 0,836 25 Hàm lượng Threonine g/lít 1,009 26 Hàm lượng Tyrosine g/lít 0,047 27 Hàm lượng Valine g/lít 0,812 28 Hàm lượng chondroitin sulfate mg/ml 40,50 Bảng 3.3 Trạng thái cảm quan dịch thủy phân Chỉ tiêu Trạng thái Màu sắc Mùi vị STT Kết Dịch lỏng, sánh Màu vàng Đặc trưng dịch thủy phân Bảng 3.4 Kết phân tích số tiêu vi sinh dịch thủy phân sụn cá mập STT Chỉ tiêu Đơn vị tính Kết Tổng số VSV hiếu khí Salmonella Coliforms Tổng số bào tử nấm men, nấm mốc CFU/g CFU/g CFU/g CFU/g Neg Neg Neg (Neg: không phát hiện) 16 Quy định QCVN - 16: 2010/BYT < 5000 Âm tính Âm tính < 500 ... án: Nghiên cứu sản xuất bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate từ sụn cá mập trắng (Carcharhinus dussumieri) enzyme protease Chuyên ngành: Công nghệ chế biến thủy sản Mã số: 9540105 Nghiên cứu. .. phạm vi nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu Sụn cá mập trắng (C dussumieri) khai thác vùng biển Khánh Hòa 3.2 Phạm vi nghiên cứu 1) Nghiên cứu thủy phân sụn cá mập (C dussumieri) enzyme protease. .. hành: ? ?Nghiên cứu sản xuất bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate từ sụn cá mập trắng (Carcharhinus dussumieri) enzyme protease? ?? Mục tiêu luận án Tận dụng nguồn nguyên liệu lại - sụn cá mập