Nghiên cứu sản xuất bột đạm thủy phân từ sụn cá mập trắng (carcharhinus dussumieri) bằng enzyme protease

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐINH HỮU ĐÔNG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT BỘT ĐẠM THỦY PHÂN CHỨA CHONDROITIN SULFATE TỪ SỤN CÁ MẬP TRẮNG (CARCHARHINUS DUSSUMIERI) BẰNG ENZYME PROTEASE LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHÁNH HÒA - 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐINH HỮU ĐÔNG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT BỘT ĐẠM THỦY PHÂN CHỨA CHONDROITIN SULFATE TỪ SỤN CÁ MẬP TRẮNG (CARCHARHINUS DUSSUMIERI) BẰNG ENZYME PROTEASE LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành : Công nghệ Chế biến Thủy sản Mã số : 9540105 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Vũ Ngọc Bội PGS.TS Nguyễn Anh Tuấn KHÁNH HỊA - 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu cá nhân Các số liệu, kết qủa nêu Luận án trung thực chưa công bố cơng trình nghiên cứu trước Đinh Hữu Đơng LỜI CẢM ƠN Để hồn thành Luận án Trước hết xin gửi tới Ban Giám hiệu, Lãnh đạo phòng Đào tạo Sau đại học Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm kính trọng, niềm tự hào học tập nghiên cứu Trường năm qua Sự biết ơn sâu sắc xin giành cho PGS.TS Vũ Ngọc Bội - Trưởng Khoa Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang PGS TS Nguyễn Anh Tuấn - Bộ môn Công nghệ Chế biến Thủy sản hết lịng hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt trình thực luận án Xin chân thành cám ơn thầy phản biện góp ý cho lời khuyên quý báu để luận án hoàn thành với chất lượng cao Xin cám ơn Lãnh đạo Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm - TP Hồ Chí Minh cho tơi học tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập thực luận án Xin gửi lời cám ơn thầy cô giáo Khoa Công nghệ Thực phẩm giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập trường Đặc biệt, xin ghi nhớ tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân bạn bè quan tâm, chia sẻ khó khăn động viên tơi để tơi hồn thành luận án MỞ ĐẦU Chondroitin sulfate thành phần cấu tạo nên sụn khớp tổ chức sợi chun (gân, cơ, dây chằng…) giúp cho vận động linh hoạt tính đàn hồi hoạt động khớp, tạo độ bền bị nén ép Chondroitin sulfate làm tăng sản xuất chất nhầy khả bôi trơn dịch khớp, đảm bảo vận động linh hoạt khớp [21, 23] Chondroitin sulfate cịn có vai trị bảo vệ sụn khớp cách ức chế enzyme phá hủy sụn khớp collagenase, phospholipase A2, N-acetylglucosamindase Vì vậy, chondroitin sulfate sử dụng để hỗ trợ điều trị bệnh lý xương khớp hạn chế q trình thối hố sụn khớp Ngồi ra, chondroitin sulfate góp phần nuôi duỡng tái tạo tế bào giác mạc mắt [21, 23, 39] Chondroitin sulfate chủ yếu thu nhận từ nguồn nguyên liệu tự nhiên, đó, có sụn cá mà đặc biệt sụn cá mập sụn cá mập thường có hàm lượng chondroitin sulphat cao sụn loại động vật khác [21, 39] Chính thế, người ta thường sử dụng sụn cá mập dạng bột khô sản xuất viên nén thực phẩm chức hỗ trợ điều trị bệnh xương khớp [39, 43, 47÷49] Tuy thế, sụn cá mập, chondroitin sulfate thường liên kết với protein liên kết o-glycosid tạo thành phức hợp proteoglycan (glucoprotein) nằm cấu trúc mô sụn nên người khó hấp thụ [21, 23, 24, 63] Hiện có số nghiên cứu sử dụng tác nhân hóa học enzyme thủy phân sụn cá khơ tươi sau kết tủa thu chondroitin sulfate dùng sản xuất thực phẩm chức [23, 39, 42, 63÷70] Tuy vậy, việc thu nhận chondroitin sulfate dẫn đến lãng phí chất tự nhiên từ sụn cá hiệu sử dụng điều trị bệnh lý xương khớp không cao giá thành sản phẩm cao nên hiệu hạn chế [23, 39, 42, 44, 45, 63÷70] Để khắc phục tượng này, chúng tơi tiến hành nghiên cứu sử dụng enzyme thủy phân sụn cá mập tươi với mong muốn tạo dịch thủy phân chứa chất tự nhiên từ sụn cá chondroitin sulphat để định hướng sử dụng làm thực phẩm chức cung cấp thành phần thiết yếu giúp hỗ trợ điều trị bệnh lý xương khớp chống thối hóa xương khớp Việt Nam có bờ biển dài 3260km, sản lượng khai thác thủy sản lớn trình khai thác thủy sản, số lượng cá mập mắc lưới lớn [14, 23, 26, 27] Hiện cá mập người dân sử dụng để thu cước cá phần lại chiếm tỷ trọng lớn sụn cá vi cá thường phơi khô bán cho thương lái Trung Quốc với giá rẻ [38] Ở Việt Nam, việc nghiên cứu thủy phân sụn sụn cá mập tươi cịn mẻ chưa có cơng trình đề cập đến vấn đề Do vậy, Luận án tiến hành: “Nghiên cứu sản xuất bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate từ sụn cá mập trắng (Carcharhinus dussumieri) enzyme protease” Mục đích luận án: Tận dụng nguồn nguyên liệu lại - sụn cá mập tươi chế biến tạo dịch thủy phân bột đạm chứa chondroitin sulfate chất tự nhiên từ sụn cá mập (C dussumieri) công nghệ sử dụng enzyme protease thân thiện với môi trường để định hướng sử dụng làm thực phẩm chức hỗ trợ điều trị chống thối hóa xương khớp Nội dung nghiên cứu luận án: 1) Nghiên cứu thủy phân sụn cá mập (C dussumieri) enzyme protease 2) Đánh giá chất lượng dịch thủy phân sụn cá mập xác định cấu trúc chondroitin sulfate 3) Nghiên cứu sấy phun tạo bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate Ý nghĩa khoa học luận án: Luận án lần tiến hành nghiên cứu cách tồn diện từ cơng đoạn thủy phân sụn cá mập tươi, … nghiên cứu sấy khô tạo bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate Do luận án có ý nghĩa khoa học, thể chỗ chứng minh thủy phân sụn cá mập tổ hợp enzyme protease thu dịch thủy phân chứa chất dinh dưỡng từ sụn cá mập để ứng dụng thực phẩm sấy phun tạo bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate, sản phẩm hoàn toàn trước chưa có nghiên cứu Mặt khác số liệu nghiên cứu luận án thông tin khoa học có giá trị tài liệu tham khảo phục vụ cho việc giảng dạy, học viên cao học nghiên cứu sinh quan tâm tới lĩnh vực Ý nghĩa thực tiễn luận án: Luận án lần tạo dịch thủy phân sụn cá mập sản phẩm bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate, dễ hấp thụ tiện lợi sử dụng làm thực phẩm chức Đặc biệt sản phẩm bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate thích hợp cho người bị bệnh xương khớp, sản phẩm khô dễ bảo quản vận chuyển Do vậy, luận án có ý nghĩa thực tiễn cao sở cho việc định hướng sản xuất thực phẩm chức hỗ trợ điều trị chống thối hóa xương khớp CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHONDROITIN SULFATE VÀ ỨNG DỤNG 1.1.1 Cấu trúc chondroitin sulfate Chondroitin sulfate (CS) polysaccharid, thuộc nhóm heteropolysaccharid gọi glycosaminoglycan (GAG), tìm thấy tự nhiên dạng polyme mạch thẳng gồm đơn vị cấu tạo loại đường N-acetyl-D-galactosamine (GalNAc) D-glucuronic acid (GlcA) xen kẽ (polymeric D-galactosamine and Dglucuronic acid) Các gốc đường sulphate hóa hay khơng bị sulphate hố [23, 63], số gốc GlcA bị epime hoá thành L-iduronic acid (IdoA) Chondroitin sulfate polyme tự nhiên có chứa 15÷150 đơn vị cấu trúc đơn vị gồm loại đường GlcA GalNAc Khối lượng phân tử CS thường biến động khoảng 10.000 ÷ 100.000 Dalton [23, 37, 57, 65, 79, 84, 85] Năm 1950, Julia Einbinder Maxwell Schubert lần phát tách chiết chondroitin sulfate từ sụn cách kỹ thuật chiết rút chondroitin sulfate dung dịch natri hydroxit 2% Sau đó, Julia Einbinder Maxwell Schubert tinh chondroitin sulfate cách sử dụng canxi clorua khử protein khỏi dịch chiết, thu chondroitin sulfate [65] Năm 1986, Farndale W R., Buttle D J Barrett A J công bố nghiên cứu CS cho CS thường gắn với protein liên kết o-glycosid tạo thành phức chất proteoglycan (PG) (glucoprotein) - hợp chất hữu thuộc nhóm mucopolysaccharid [56, 57, 65, 81, 84, 85] 2- Sự kết hợp nhóm sulphate (SO4 ) với nhóm carboxyl (COO-) làm cho phân tử chondroitin sulfate có mật độ điện tích âm cao dễ dàng liên kết đồng hố trị với protein cấu tạo PG Trong cấu trúc proteoglycan, CS thường gắn với nhóm OH acid amin serine nằm chuỗi polypeptid protein Các nhà khoa học chưa biết cách protein gắn chọn lọc xác với GAG Tuy thế, họ cho GAG tổng hợp mạng lưới nội bào thể Golgi Sự gắn kết chuỗi GAG với gốc đường đơn theo phương thức cố định Xyl-Gal-GalGlcA xylose gắn với protein mạng lưới nội bào, phân tử đường khác gắn hệ Golgi [45, 48, 79] Chondroitin sulfate polyme ưa nước mơ sụn có hàm lượng nước cao Phân tử đường cấu trúc CS khơng bị sulphate hố, bị sulphate hố lần hay lần, đa phần nhóm OH vị trí carbon GalNAc sulphate hố, số chuỗi GAG bị sulphate hố vị trí GlcA Q trình sulphate hố nhờ enzyme sulfotransferase đặc hiệu Việc sulphate hố vị trí khác tạo nên hoạt tính sinh học đặc thù cho CS [39, 45, 48÷50] Trong thể sống, PG GAG giữ vai trị quan trọng nhiều q trình khác như: điều hòa hoạt động enzyme bám dính, phát triển di thực tế bào [39, 45, 48÷50] GAG cịn có chức cấu trúc điều khiển thể sống Về cấu trúc, thành phần mơ sụn Về điều khiển, CS dễ gắn kết với protein mô tế bào nhờ có điện tích âm, mối quan hệ quan trọng cho việc điều hoà hoạt động tế bào Phân tử PG mô sụn (chứa khoảng 80÷100 mạch CS) với protein acid hyaluronic tạo thành phức hệ thủy động học có khả nén thuận nghịch giúp cho mô sụn chống lại ép nén với biến dạng nhỏ [38] Cơng thức cấu trúc hố học đơn vị cấu trúc chondroitin sulfate (C14H21NO14S)n trình bày hình 1.1 1.2 Hình 1.1 Cấu trúc hoá học đơn vị chuỗi chondroitin sulfate [23,56] Chondroitin-4-sulphate: R1 = H; R2 = SO3H; R3 = H Chondroitin-6-sulphate: R1 = SO3H; R2, R3 = H Hình 1.2 Cấu trúc mạch chondroitin sulfate [23, 56] Chondroitin có loại A, B C đặc trưng số lượng vị trí nhóm sulphate disaccharid lặp lại chuỗi polysaccharid Chondroitin sulfate A: gốc sulphate gắn vị trí C-4 (chondroitin-4-sulphate, GlcA-GalNAc-4S, CS4) (Hình 1.3), kết hợp với protein tạo nên chondromucoid có nhiều mơ sụn Chondroitin sulfate C: gốc sulphate gắn vị trí C-6 (chondroitin-6-sulphate, CS6) Chondroitin sulfate B (IdoA-GalNAc-4S, CS4): acid iduronic thay acid glucuronic (hình 1.4) CS4 cịn gọi dermatant sulphate (iduronic acid thay cho glucuronic acid), thường có nhiều da, ngồi cịn gặp van tim, gân, thành mạch Vị trí bị sulphate hố C-4 GlcNAc C-5 glucuronic acid bị epime hoá thành iduronic acid [23, 56] Loại A B (CS4) thường tìm thấy sụn động vật có vú (bị lợn), ngược lại loại C (CS6) thường tìm thấy chủ yếu loài cá sụn (cá mập, cá đuối, ) [56, 63, 81, 88, 94] Tuy nhiên, CS từ nguồn nguyên liệu khác đa dạng cấu trúc kích thước, chúng chứa nhiều hay isome CS, có tới 16 isome CS, phụ thuộc vào vị trí sulphate hóa cặp đường đôi tạo nên 16 isome/ cặp Trong CS A CS C thành phần chủ yếu hình thành PG Hình 1.3 Cấu trúc đơn vị Hình 1.4 Cấu trúc chondroitin chondroitin sulfate A sulfate B Hình 1.5 Cấu trúc chondroitin sulfate - C (GlcA-GalNAc-6S) - CS6 Người ta tách chiết CS trước cấu trúc xác định Do vậy, tên gọi CS có thay đổi Phân loại CS tóm tắt bảng 1.1 ... nghiên cứu thủy phân sụn sụn cá mập tươi cịn mẻ chưa có cơng trình đề cập đến vấn đề Do vậy, Luận án tiến hành: ? ?Nghiên cứu sản xuất bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate từ sụn cá mập trắng. .. Nghiên cứu thủy phân sụn cá mập (C dussumieri) enzyme protease 2) Đánh giá chất lượng dịch thủy phân sụn cá mập xác định cấu trúc chondroitin sulfate 3) Nghiên cứu sấy phun tạo bột đạm thủy phân. .. ĐÔNG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT BỘT ĐẠM THỦY PHÂN CHỨA CHONDROITIN SULFATE TỪ SỤN CÁ MẬP TRẮNG (CARCHARHINUS DUSSUMIERI) BẰNG ENZYME PROTEASE LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành : Công nghệ Chế biến Thủy sản