Nhân dòng gen prion từ giống bò Hanwoo của hàn quốc

Nhân dòng gen prion từ giống bò Hanwoo của hàn quốc

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

(Pr PGS.TS Nguyễn Ngọc Tuân KHÓA: 2002 – 2006

Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006-

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY

Professor Student

Ph.D Kwon Moosik DANG QUOC BAO Dr Nguyen Ngoc Tuan TERM: 2002 - 2006

HCMC, 09/2006

Các Thầy Cô Phòng Quan Hệ Quốc Tế

Các Thầy Khoa Công Nghệ Di Truyền, Đại Học Sungkyunkwan, Hàn Quốc

Đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu và giúp đỡ em trong thời gian em học tập tại trường

Đặc biệt xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến:

TS Kwon Moosik- Trưởng bộ môn Công Nghệ Di Truyền, Đại Học

Sungkyunkwan đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn, giúp đỡ em trong nghiên cứu và thực hiện đề tài

TS Nguyễn Ngọc Tuân- Trưởng phòng Sau Đại Học, Đại Học Nông Lâm

đã giúp đỡ rất nhiều và hướng dẫn tận tình trong quá trình viết khoá luận TS Trần Thị Dung- Trưởng bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Nông Lâm đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài này

Ths Kim Yong Hwan và các anh chị trong phòng thí nghiệm Công Nghệ Di

Truyền, Đại Học Sungkyunkwan đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt thời gian em thực hiện khóa luận

Xin cảm ơn các bạn trong và ngoài lớp đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và làm khóa luận tốt nghiệp

Con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, những người đã sinh thành, nuôi dưỡng, dạy dỗ con và luôn bên con trong mọi thời điểm

Thủ Đức, ngày 10 tháng 08 năm 2006

iv

TÓM TẮT

ĐẶNG QUỐC BẢO, Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 ―NHÂN

DÒNG GEN PRION (PrP) TỪ BÒ HANWOO (BOS TAURUS COREANAE) CỦA HÀN QUỐC‖

Giáo viên hướng dẫn GS TS KWON MOOSIK

PGS TS NGUYỄN NGỌC TUÂN

BSE là một bệnh truyễn nhiễm do prion, là một trong những bệnh được quan tâm trong giới nghiên cứu Hiện nay các nhà khoa học đang tiến hành nghiên cứu để có thể tạo ra một bộ kit chẩn đoán sớm bệnh BSE, các nghiên cứu này đều tập trung nghiên cứu cấu trúc protein PrPsc, dạng protein gây bệnh của prion Bước đầu trong nghiên cứu của chúng tôi về protein PrPsc, đã tiến hành nhân dòng và giải trình tự gen prion

Tách chiết DNA từ máu của bò Hanwoo và PCR để khuếch đại gen prion Gen prion được khuếch đại có kích thước 651 bp, sau đó được kết buộc vào véc tơ pGEM-

T easy và chuyển vào vi khuẩn E coli DH5α Khuẩn lạc chứa véc tơ tái tổ hợp có màu

trình tinh sạch được giải mã trình tự Kết quả giải trình tự thành công đã cho thấy sự giống nhau gần như hoàn toàn trong trình tự gen prion của bò Hanwoo và bò châu Âu Việc thành công trong quá trình nhân dòng sẽ là bước đầu quan trọng cho mục tiêu cuối cùng trong nghiên cứu của chúng tôi là tạo kit chẩn đoán bệnh BSE

v

ABSTRACT

Prion — short for proteinaceous infectious particle — is a unique type of

infectious agent, as it is made only of protein Prion was termed in 1982 by Prusiner, who was prized Nobel for his research on prion Bovine spongiform encephalopathy (BSE) is one of the most notable prion diseases BSE is not only potential risk on bovine but also on human Until now Korea is free from BSE (Tae-Yung Kim et al,2005), but the BSE is high risk damage society The study on BSE is absolutelly remarkable As the first step of our prion study, we were attempted cloning full gene of prion encoding bovine prion protein from Korean bovine PrP gene was amplified from genome DNA (gDNA) of Korean bovine by PCR following 2 primers forward and reverses primer The recombinant PrP of full sequence cDNA is 651bp long encoding 217 amino acids Amplified gene was then transmitted in to pGEM-T easy

vector Subsequently, recombination vector was transformed into compentent cell E coli DH5α Recombinant plasmid of PrP was then further analyzed through

sequencing

2.3.7.1 Phương pháp Sanger và Coulson 9

2.3.7.2 Phương pháp Maxam – Gilbert 9

2.3.7.3 Giải trình tự bằng hệ thống tự động 9

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 10

3.2 Vật liệu 10

3.5 Khuếch đại gen prion từ bộ gen của bò Hàn Quốc bằng kỹ thuật PCR 11

3.6 Kỹ thuật điện di trên thạch agarose phân tách gen prion 12

4.1.3 Gắn đoạn DNA vào véc tơ pGEM-T easy 17

4.1.4 Biến nạp vào vi khuẩn E coli 17

Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia

Văn phòng quốc tế về bệnh dịch

ix

Hình 4.2: PCR gen prion 16

Hình 4.3: Thạch elution (tinh sạch) 16

Hình 4.4: Sản phẩm sau qúa trình tinh sạch 17

Hình 4.5: Véc tơ pGEMT easy và gen PrP đƣợc cắt bởi EcoR I 18

Hình B.1: Cấu trúc protein PrP và vị trí đoạn mồi trên gen prion 24

Hình B.2: Mồi thiết kế cho dòng hoá 24

Hình B.3: Bản đồ của véc tơ pGEMT easy 25

Hình B.4: So sánh trình tự gen prion của bò Hanwoo và dòng bò khác 26

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trong thời gian gần đây prion trở thành một thuật ngữ rất được lưu ý trong giới khoa học Prion là một tác nhân gây bệnh mới được chú ý từ khi gây nên bệnh bò điên vào thập niên 1980 tại Anh Quốc Sau khi trở thành đại dịch trên bò, người ta còn tìm thấy được mối liên hệ giữa các tác nhân gây nên bệnh bò điên và bệnh vCDJ ở người Trong suốt vài thập kỷ qua, bệnh bò điên đã gây thiệt hại đáng kể cho nền chăn nuôi các nước kể cả các nước có phát hiện đại dịch và các nước nhập khẩu thịt

Các nghiên cứu về prion trong thời gian gần đây rất được chú ý, trong đó các nhà nghiên cứu chú trọng hơn vào việc tìm hiểu cơ chế gây bệnh của prion Ngoài ra người ta còn tìm cách nghiên cứu trên protein của chúng để có thể tìm ra phương thức nhằm xác định bệnh sớm nhất để tránh sự lây lan trên diện rộng có thể xảy ra

phòng thí nghiệm công nghệ di truyền thuộc khoa công nghệ di truyền đại học Sungkyunkwan, Hàn Quốc, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu gen prion của bò Hanwoo (Hàn Quốc) Trong phạm vi đề tài này, như là bước đầu trong nghiên cứu của chúng tôi về prion, đề tài tiến hành nhân dòng và giải mã trình tự của đoạn gen prion

1.2 Mục tiêu

Tiến hành nhân dòng và giải trình tự gen prion giải mã protein prion ở giống bò Hanwoo (Hàn Quốc)

1.3 Yêu cầu

Thiết kế mồi phát hiện gen prion và thực hiện phản ứng PCR

Chuyển gen prion vào véc tơ pGEM-T easy, biến nạp véc tơ tái tổ hợp vào vi

khuẩn E coli

Nhân dòng vi khuẩn, thu nhận vector tái tổ hợp và giải trình tự gen

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Prion

Prion - được viết tắt từ thuật ngữ proteinaceous infectious particle (hạt lây

nhiễm có bản chất protein) là một tác nhân gây bệnh truyền nhiễm đặc biệt, được cấu thành từ protein Bệnh do prion còn được gọi là các bệnh não dạng xốp truyền nhiễm (Transmissible Spongiform Encephalopathies: TSE) là các bệnh gây thái hóa thần kinh ảnh hưởng trên cả người và động vật Một số bệnh được liệt kê ở Bảng A.1(Prusiner, 1998)

Prion đã được nghiên cứu cách đây gần một thế kỷ Vào năm 1930, các nhà khoa học đã nhận thấy tỷ lệ mắc bệnh CJD (Creutzfeldt- Jakob) rất cao ở một số gia đình Năm 1954 trong khi nghiên cứu bệnh run ngứa trên cừu ở Ireland, Bjorn Sigurdsson đã đưa ra khái niệm nhiễm vi rút chậm Sở dĩ nó được gọi là vi rút chậm vì sau khi lây nhiễm cho vật chủ, các triệu chứng bệnh không biểu hiện như: không sốt, không có dấu hiệu ung thư bạch cầu, không có đáp ứng miễn dịch dịch thể Ngoài ra khả năng chịu nhiệt và các tác nhân hoá học khác cho thấy rằng prion có bản chất khác bản chất của vi rút Vào năm 1982, căn cứ vào các nghiên cứu trước đó, Prusiner đã cho rằng có sự tham gia của một loại đại phân tử trong quá trình lây nhiễm và nó có bản chất protein Trong cùng nghiên cứu được đăng trên tạp chí Science vào năm 1982, Prusiner đã đặt tên tác nhân này là prion để phân biệt với các tác nhân lây nhiễm từ vi rút và thể vi rút (Prusiner, 1982)

Khảo sát trên mRNA của gen prion cho thấy không có sự khác biệt trong trình tự base của dạng bình thường và các mô bị bệnh run ngứa Điều này cho thấy cấu trúc

gen không phải là yếu tố quyết định tính lây nhiễm của prion (Chesebro và ctv, 1985)

Gen prion mã hoá protein prion (PrP) Ở động vật có vú, protein prion bình thường (PrPc) là một loại protein màng của tế bào thần kinh và tế bào đệm của não bộ và tuỷ sống, ngoài ra chúng còn xuất hiện trên một vài loại mô ngoại vi và bạch cầu

PrPc vẫn còn một số đặc tính cần được nghiên cứu thêm (Kang và ctv, 2004) PrPc có

thể chuyển sang dạng PrPsc gây bệnh PrPc đóng vai trò chính trong cách sinh bệnh và truyền lây bệnh, nhưng dạng đột biến PrPsc lại là thành phần chính của các hạt prion bất thường (Prusiner, 1991) Mặc dù PrPc và PrPsc có cùng trình tự acid amin, chúng

có cấu trúc bậc hai khác nhau Chìa khoá chính để hiểu rõ cơ chế sinh bệnh của prion là ta phải hiểu rõ sự thay đổi cấu trúc bậc hai từ dạng bình thường PrPc (glycoprotein bề mặt tế bào) sang dạng đồng phân gây bệnh PrPsc (Hình B.1.A) Khi khảo sát protein trên các đối tượng bị bệnh, ngoại trừ PrPsc đến thời điểm hiện tại, không có một tác nhân đặc hiệu nào khác được cho là nguyên nhân gây nên các bệnh viêm não dạng xốp Nên các nhà khoa học khẳng định PrPc là nguyên nhân gây nên bệnh viêm

não dạng xốp (Diedrich và ctv, 1993)

PrPc có cấu trúc xoắn anpha (khoảng 40%) và một phần nhỏ dạng bê ta, trong khi đó PrPsc gây bệnh lại có ít cấu trúc xoắn alpha (30%) nhiều cấu trúc dạng phiến

(khoảng 45%)(Pan và ctv, 1993; Pergami và ctv 1996) Sự khác biệt trong cấu trúc bậc

hai làm tăng tính mẫn cảm với proteinase K (PK), và sự khác biệt trong tính hoà tan

Sau khi lây nhiễm cho bò, thời gian ủ bệnh trung bình khoảng 5 năm Đó cũng là lý do bệnh chỉ được phát hiện sau khi đã trở thành một đại dịch Ví dụ như trong trường hợp của Anh, BSE đã lây nhiễm 160.000 đại gia súc và bò sữa trong suốt thập

niên 1980 cho đến khi chúng được quan tâm (Anderson và ctv, 1996) Một vài nghiên

cứu đã cho thấy rằng BSE trở thành một đại dịch lớn và lây lan mạnh, nguyên nhân là do các nhà chăn nuôi sử dụng trực tiếp bột thịt xương (MBM) vào khẩu phần ăn của

bò sữa (Nathanson và ctv, 1997; Wilesmith và ctv, 1991) Bột thịt xương được chế

biến từ phủ tạng của cừu, bò, heo và gà, phó sản của lò mổ gia súc được xem như thức ăn bổ sung giàu đạm Trong quá trình chế biến MBM được xử lý ở nhiệt độ thấp, kết quả là các tác nhân gây bệnh không được phá huỷ hoàn toàn Thật ra prion có bản chất là protein nên rất khó tiêu diệt bằng các tác nhân vật lý và hoá học Prion kháng rất

mạnh với nhiệt độ, formol, tia cực tím, phần lớn các dung môi như các chất kiềm, chất tẩy, muối đậm đặc Prion có khả năng kháng bức xạ gấp 10 lần vi rút, bị biến tính ở 121oC trong một giờ hoặc 240oC trong 1 phút (trích Nguyễn Ngọc Tuân, 2002) Vì nguyên nhân đó, để phòng tránh nguy cơ của prion, MBM đã bị cấm sử dụng làm thức ăn bổ sung trong chăn nuôi và các nước có gia súc bị lây nhiễm prion đều chọn giải pháp thiêu hủy thú nghi bệnh Đối với các nước khác, việc cấm nhập khẩu thịt từ các nước có dịch là giải pháp tối ưu

Sau đợt đại dịch đầu tiên ở Anh Quốc vào năm 1986, BSE đã lan rộng khắp Châu Âu vào năm 2000 Sau đó, đại dịch lan rộng ra các quốc gia khác như Nhật Bản (2001), Israel (2002), Canada (2003), và tại Hoa Kỳ (2003, chỉ tìm thấy ở bò nhập từ Canada, nên OIE xếp hạng Hoa Kỳ là quốc gia chưa bị BSE) Ghi nhận đến tháng 2 năm 2005 đã có 189.000 trường hợp lây nhiễm tại 23 quốc gia (không bao gồm Hoa Kỳ) Đến thời điểm cuối năm 2005 vẫn chưa có trường hợp BSE nào được ghi nhận ở

Hàn Quốc (Tae-Yung Kim và ctv, 2005), tuy nhiên vì khả năng lây nhiễm và nguy hại

cho cộng đồng nên BSE vẫn là một nguy cơ đáng được quan tâm

2.2.2 Các bệnh khác có nguyên nhân do prion

BSE không chỉ là mối nguy cho bò mà còn có tiềm năng gây nguy hiểm cho người Người ta tin rằng có mối liên quan đến BSE, bệnh vCJD (Creutzfeldt-Jakob biến thể) được phát hiện đầu tiên vào tháng 3 năm 1996 tại Anh Quốc Khác với CJD thể bình thường, vCJD biến thể lây nhiễm trên các bệnh nhân trẻ (trung bình 29 so với 65 tuổi), thời gian ủ bệnh cũng lâu hơn (14 tháng so với 4 tháng rưỡi trong trường hợp CJD) Khi quan sát những điểm tương đồng trong các tác nhân gây bệnh vCJD và BSE và sự tương đồng trong cách lây truyền của các tác nhân gây bệnh có thể giúp ta đưa ra kết luận rằng vCJD và BSE có cùng tác nhân gây bệnh (WHO, 2002)

Trong thực tế và thực nghiệm, người ta quan sát được prion còn có khả năng gây bệnh trên chuột nhắt, chuột cống, chồn, mèo, cừu, nai, dê và một vài loài linh trưởng khác (Bảng A.1)

2.3 Sự nhân dòng

Khoá luận này là bước đầu trong quá trình nghiên cứu của nhóm nghiên cứu tại Hàn Quốc với mục tiêu thực hiện nhân dòng và giải mã đoạn gen của prion trên giống

bò Hanwoo (Bos taurus coreanae) của Hàn Quốc.

Gen prion được khuếch đại từ bộ gen (gDNA) của bò Hàn Quốc bởi kỹ thuật PCR nhờ vào 2 đoạn mồi: mồi xuôi và mồi ngược (Hình B.2) Sản phẩm khuếch đại có 651 cặp base (bp) mã hoá 217 acid amin Sau đó, đoạn gen được khuếch đại này được chuyển vào véc tơ pGEM-T easy Véc tơ chứa đoạn gen mong muốn được chuyển vào

vi khuẩn E coli Sản phẩm PrP tái tổ hợp này được dùng để giải trình tự và là vật liệu

cho các nghiên cứu sau này

2.3.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reacton)

Kỹ thuật PCR được sử dụng để khuếch đại một đoạn DNA đã được biết trước trình tự

Phản ứng PCR phụ thuộc vào khả năng tách đôi của mạch đơn DNA và bắt cặp

bổ sung trong điều kiện thí nghiệm được kiểm soát (in vitro) Nhân tố thứ hai ảnh

hưởng đến phản ứng PCR là đoạn mồi (primer), đoạn oligonucleotide có độ dài khoảng 18 - 20 base Hai đoạn mồi này bắt cặp bổ sung với đoạn DNA cần khuếch đại

C Đoạn mồi sau khi bắt cặp với DNA mẫu được tiếp tục kéo dài nhờ vào các deoxynucleotide (dNTPs) và DNA polymerase

chịu nhiệt có trong hỗn hợp phản ứng Enzyme này được gọi là Taq polymerase,

tách đoạn DNA mạch đôi mới Sau đó nhiệt độ lại được hạ thấp xuống và bắt đầu một chu kỳ mới vì các đoạn mồi vẫn còn trong hỗn hợp Các chu kỳ được lặp lại sẽ nhanh chóng khuếch đại đoạn gen mong muốn Ở mỗi chu kỳ, số lượng DNA được tăng gấp đôi Vì thế trong một thời gian ngắn chỉ khoảng hơn 20 chu kỳ, đoạn DNA mong muốn được tăng lên hàng triệu lần trong khi đoạn DNA gốc vẫn không được nhân lên

(Sandy Primrose và ctv, 2004)

2.3.2 Kỹ thuật điện di

Kỹ thuật điện di không chỉ được sử dụng trong quá trình phân tích mà còn được sử dụng cho quá trình tinh sạch DNA Kỹ thuật điện di thường được tiến hành trên 2 loại thạch là agarose và polyacrylamide Agarose thích hợp phân tách DNA có độ dài từ vài trăm base đến 20.000 base Polyacrylamide thường sử dụng cho các đoạn có kích thước nhỏ hơn Cơ chế của quá trình dựa trên sự khác biệt về trọng khối phân tử của DNA Dưới tác dụng của điện trường, DNA tích điện âm sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương và xuyên qua các lỗ nhỏ trong thạch Các phân tử có khối lượng nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn và ngược lại Thạch agarose có cấu trúc mạng phức tạp bao gồm các đại phân tử có kích thước lỗ phụ thuộc vào nồng độ agarose được sử dụng

Kỹ thuật điện di là kỹ thuật cho phép xác định kích thước đoạn DNA DNA sẽ được xuyên qua chất nền được gọi là gel trong một điện trường DNA tích điện âm cho nên khi điện di mẫu được cho vào những giếng gần cực điện âm và DNA sẽ di chuyển về phía cực dương Sau quá trình điện di trên thạch, các đoạn DNA được phân tách theo khối lượng của chúng Sự di chuyển tỷ lệ nghịch với kích thước phân tử, DNA có khối lượng nhỏ di chuyển nhanh và ngược lại Các DNA này có thể được quan sát bằng tia UV sau khi nhuộm bằng các tác nhân nhuộm màu như EtBr

2.3.3 Véc tơ plasmid

Plasmid là phân tử DNA nằm ngoài nhiễm sắc thể có kích thước biến thiên từ 1 Kb đến hơn 200 Kb Các plasmid hầu hết là mạch đôi, dạng vòng và có thể tách ra từ vi khuẩn ở dạng siêu xoắn

Vì khả năng có thể nhân đôi với số lượng lớn và độc lập với tế bào chủ nên plasmid là vật liệu quan trọng trong công nghệ di truyền Plasmid được phát triển từ

vào plasmid Năm 1973, Cohen và cộng sự lần đầu tiên sử dụng plasmid như là một véc tơ cho quá trình nhân dòng - pSC101 Plasmid đầu tiên mang đầy đủ đặc tính cần thiết cho một véc tơ nhân dòng là plasmid pBR313 Từ năm 1983 đến nay, plasmid đã được phát triển rất nhiều đặc tính mới: mang các origin và các promoter có nguồn gốc từ thể thực khuẩn, các tác nhân chọn lọc mới, véc tơ plasmid biểu hiện (Brown, 2005)

Plasmid có các đặc điểm như sau :

Plasmid có thể tìm thấy ở nhiều loài vi khuẩn, hầu hết các plasmid chỉ có khả năng lây nhiễm trong một số ít vật chủ

Là một DNA nằm ngoài nhiễm sắc thể (NST), có vật chất di truyền ổn định và nhân đôi độc lập với NST tế bào vật chủ

Có rất nhiều cơ chế để ổn định số lượng trong tế bào vật chủ

Phụ thuộc vào enzyme và protein tổng hợp từ tế bào chủ trong quá trình sao mã và dịch mã

Thường chứa các enzyme cần thiết cho tế bào chủ Đặc tính này rất cần thiết cho quá trình chọn lọc plasmid trong công nghệ di truyền như kháng sinh, phân hủy các hợp chất hữu cơ phức tạp, các enzyme cắt hạn chế và biến đổi

2.3.4 Sự kết buộc (ligation)

Tất cả các tế bào sống đều có khả năng sản sinh DNA ligase, nhưng enzyme sử

dụng trong công nghệ di truyền thường được tinh sạch từ vi khuẩn E coli đã bị nhiễm

bởi thể thực khuẩn T4 Trong tế bào, enzyme này đó một vai trò rất quan trọng trong quá trình sửa chữa các lỗi trên mạch đôi DNA Trong thực nghiệm, DNA ligase không chỉ có khả năng sửa chữa các lỗi trên mạch đôi mà còn có khả năng nối các phân tử DNA lại với nhau hoặc hai đầu của cùng một phân tử

T4 DNA ligase là một ligase phổ biến có nguồn gốc từ thể thực khuẩn T4 Nó có khả năng kết buộc mạch đôi của DNA hoặc RNA Enzyme này có hoạt tính trên cả đầu dính và đầu bằng Ngoài ra T4 DNA ligase còn có thể sửa chữa, thêm vào những base còn trống trên mạch đôi của DNA, RNA Quá trình này đòi hỏi phải có ATP

2.3.5 Biến nạp ở vi khuẩn E coli

Biến nạp vào vi khuẩn E coli là một bước cần thiết trong bất kỳ thí nghiệm

nhân dòng nào, người ta luôn tìm cách nâng cao khả năng biến nạp của chúng Mục tiêu là đưa plasmid vào tế bào chủ nhằm nhân nhanh số lượng phục vụ cho nghiên cứu

Nguyên nhân của việc sử dụng E coli là do chúng có cấu trúc di truyền đơn giản, hơn

nữa chúng là đối tượng nghiên cứu được hiểu rõ nhất về sinh hóa cũng như các thông

tin di truyền Các nghiên cứu đã cho thấy rằng tế bào E coli và plasmid DNA có khả

năng biến nạp cao nhất ở môi trường có ion calci và nhiệt độ thấp (0 – 5oC), và bước

các ion kim loại ngoài canci cũng có vai trò trong quá trình biến nạp

Trạng thái khả nạp tự nhiên xuất hiện ở một vài loài vi khuẩn khi mà nồng độ chất dinh dưỡng và hàm lượng oxy trong môi trường giảm xuống thấp Thực tế khi nghiên cứu biến nạp phải tiến hành xử lý tế bào để chúng ở trạng thái khả nạp, có khả năng hấp thu DNA Để có được tế bào khả nạp người ta thường xử lý tế bào bằng các phương pháp vật lý và hóa học Trong phương pháp hóa học, các tế bào vi khuẩn bình thường sẽ được xử lý bằng các hóa chất và DNA có thể xâm nhập vào các lỗ trên

Quá trình biến nạp sử dụng tế bào khả nạp được chia thành hai bước chính :

Sốc nhiệt: tạo sự mất cân bằng nhiệt bên trong và bên ngoài màng tế bào khiến DNA có thể dễ dàng xâm nhập vào tế bào

2.3.6 Chọn lọc vi khuẩn đã được biến nạp

Vì môi trường nuôi cấy có chứa các tác nhân kháng sinh nên chỉ có những khuẩn lạc có sự hiện diện của vec tơ mới có gen tổng hợp kháng sinh và tồn tại trên môi trường kháng sinh Tuy nhiên, các véc tơ này có thể mang gen mong muốn hoặc tự đóng vòng Để nhận biết được, chúng ta cần sử dụng thêm một phương pháp nhận biết khác như :

- PCR: sau khi tách plasmid của những khuẩn lạc tồn tại được trên môi trường có chứa kháng sinh, thực hiện phản ứng PCR với các primer của gen chèn Sau đó điện di để kiểm tra kết quả

- Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp lai khuẩn lạc

- Sử dụng enzyme cắt plasmid để xác định sự hiện diện của gen chèn

- Sử dụng phương pháp α-complementation Sự hoạt động của enzyme -galactosidase dễ dàng nhận biết trong môi trường dinh dưỡng có 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactoside (Xgal) Hợp chất này không màu nhưng khi bị cắt sẽ có màu

xanh Trên môi trường đặc, những khuẩn lạc có -galactosidase hoạt động sẽ có màu

xanh trong khi những khuẩn lạc không có -galactosidase có màu trắng Vì Xgal không có khả năng hoạt hoá -galactosidase, isopropyl- -D-thiogalactoside (IPTG)

được cho vào môi trường -galactosidase được tổng hợp bởi gene lacZ Với các véc tơ có đoạn chèn, gene lacZ sẽ bị cắt và không có khả năng tổng hợp -galactosidase nên có màu trắng Các véc tơ tự đóng vòng hoặc nối véc tơ – véc tơ gene lacZ hoạt động làm khuẩn lạc có màu xanh (Lodisd và ctv, 2000)

2.3.7 Giải trình tự

Có 2 phương pháp chính được sử dụng để giải trình tự DNA

2.3.7.1 Phương pháp Sanger và Coulson

Yêu cầu mạch đơn DNA và phân tử DNA được giải mã thường được nhân dòng từ véc tơ M13 Nguyên tắc của phản ứng là dideoxynucleotide (ddNTP) được cho vào để nối dài mạch DNA, ddNTP có thể gắn vào mạch nhưng không có khả năng kéo dài mạch do không có đường ở đầu 3’ Các nhóm ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP lần lượt được phản ứng và có thể dễ dàng đọc trình tự bằng máy chụp phóng xạ

2.3.7.2 Phương pháp Maxam – Gilbert (Phân giải DNA)

Để thực hiện phương pháp Maxam – Gilbert đòi hỏi phải có DNA mạch đôi, do đó véc tơ M13 không cần phải sử dụng Nguyên tắc của phương pháp là cắt đoạn DNA có sử dụng các hoá chất để đánh dấu

2.3.7.3 Giải trình tự bằng hệ thống tự động

Nguyên tắc chung của máy giải trình tự gene tự động dựa trên cơ sở phương

pháp Sanger và Coulson Máy đọc trình tự cả trên hai mạch đơn, do vậy có thể phát hiện và giảm các nhầm lẫn do kỹ thuật Giải trình tự theo phương pháp tự động sử dụng các chất huỳnh quang để đánh dấu DNA, và được đọc bằng các đầu dò của máy dựa vào độ dài bước sóng khác nhau