TCVN-Định lượng nấm men, nấm mốc trong mỹ phẩm Cosmetics – Microbiology – Enumeration of yeast and mould

TCVN T I ÊU C H U ẨN Q U Ố C G I A DỰ THẢO VN ĐỊNH LƯỢNG NẤM MEN, NẤM MỐC TRONG MỸ PHẨM D Ự TH ẢO TC Cosmetics – Microbiology – Enumeration of yeast and mould THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – TCVN…02… Lời nói đầu TCVN 02 xây dựng sở ISO 16212:2017 Cosmetics – Microbiology – Enumeration of yeast and mould TCVN …02… Viện Kiểm nghiệm Thuốc Tp Hồ Chí Minh biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công D Ự TH ẢO TC VN nghệ công bố TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN Định lượng nấm men, nấm mốc mỹ phẩm Cosmetics – Microbiology – Enumeration of yeast and mould Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn đưa hướng dẫn chung để định lượng nấm men nấm mốc có mỹ TC VN phẩm cách đếm khuẩn lạc môi trường thạch chọn lọc sau ủ hiếu khí Để đảm bảo chất lượng độ an tồn cho người tiêu dùng, thực phương pháp phân tích rủi ro vi sinh vật phù hợp để xác định loại sản phẩm mỹ phẩm áp dụng phương pháp theo TCVN Các sản phẩm coi có nguy nhiễm vi sinh vật (xem ISO 29621) sản phẩm có hoạt độ nước thấp, sản phẩm chứa cồn, sản phẩm có giá trị pH kiềm acid (pH cực TH ẢO đoan, …) Do có nhiều loại sản phẩm mỹ phẩm, nên phương pháp khơng phù hợp để phân tích số sản phẩm (ví dụ số sản phẩm có khả tan nước) Các phương pháp khác (ví dụ phương pháp tự động) sử dụng thay cho phương pháp trình bày kiểm chứng Ự với điều kiện phù hợp phương pháp chứng minh phương pháp D Nấm men định lượng định danh phép thử định danh thích hợp, ví dụ phép thử mô tả tiêu chuẩn liệt kê mục tài liệu tam khảo Nấm mốc định lượng định danh phương pháp thích hợp khác, cần Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) ISO 21148:2017, Cosmetics – Microbiology – General instructions for microbiological examination EN 12353, Thuốc khử trùng chất khử trùng hoá học - Bảo quản sinh vật thử nghiệm dùng để hoạt tính diệt khuẩn (bao gồm Legionella), diệt khuẩn nấm,diệt bào tử khuẩn, diệt virus (bao gồm thực khuẩn thể) TCVN 02 Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn áp dụng thuật ngữ định nghĩa sau Thuật ngữ ISO IEC sử dụng cách chuẩn hóa theo địa sau: - ISO: http://www.iso.org/obp/ - IEC: http://www.electropedia.org 3.1 Nấm men Một loại nấm đơn bào, có tế bào sinh dưỡng có khả phát triển điều kiện thử nghiệm chuyên biệt quy định tiêu chuẩn 3.2 Nấm mốc TC VN Vi nấm hình thành hệ sợi, bao gồm bào tử bào tử đính, có khả phát triển theo điều kiện thử nghiệm chuyên biệt quy định tiêu chuẩn 3.3 Sản phẩm 3.4 Mẫu TH ẢO Một sản phẩm mỹ phẩm xác định mà PTN nhận để thử nghiệm Là phần sản phẩm (ít g mL) dùng để chuẩn bị hỗn dịch ban đầu 3.5 Hỗn dịch ban đầu Là hỗn dịch mẫu (hoặc dung dịch) mẫu thử pha thể tích xác định dung Mẫu pha loãng D 3.6 Ự dịch phù hợp (chất pha lỗng, chất trung hịa, dịch thể phối hợp hai) Mẫu pha loãng từ hỗn dịch mẫu ban đầu 4.1 Nguyên tắc Nguyên tắc chung Phép thử liên quan đến việc đếm khuẩn lạc môi trường thạch chọn lọc Các yếu tố phát triển nấm mẫu, cần trung hịa để đếm vi sinh vật sống Trong tất trường hợp, với phương pháp nào, việc trung hòa chất kháng vi sinh vật sản phẩm cần kiểm tra chứng minh 4.2 Phương pháp đĩa thạch Phương pháp đĩa thạch bao gồm bước sau: TCVN 02 - Chuẩn bị đĩa petri cho phương pháp trải trộn, sử dụng môi trường nuôi cấy chuyên biệt Tiến hành ủ nuôi cấy đĩa sau bổ sung lượng xác định hỗn dịch dịch pha loãng sản phẩm vào đĩa petri; - Ủ hiếu khí 22,5 oC ± 2,5 oC đến ngày; - Đếm số khuẩn lạc hình thành (CFU) tính tốn số lượng nấm men nấm mốc gram hay mL Chú thích: Thay đổi điều kiện ủ 22,5 oC ± 2,5 oC đến ngày sử dụng môi trường nuôi cấy không bổ sung kháng sinh Phương pháp màng lọc 4.3 Phương pháp màng lọc bao gồm bước sau: Thấm ướt màng lọc lượng nhỏ dung mơi pha lỗng vơ khuẩn thích hợp Chuyển TC VN - lượng mẫu thích hợp mơ tả mục 12 lên màng lọc Tiến hành lọc sau rửa lại màng lọc theo mơ tả mục 12.3.4 Chuyển màng lọc lên bề mặt đĩa thạch chứa môi trường chuyên biệt theo hướng dẫn TCVN … (ISO 21148); Ủ hiếu khí đĩa chứa màng lọc 22.5 oC ± 2,5 oC đến ngày; - Đếm số lượng khuẩn lạc (CFU) tính toán số lượng nấm men nấm mốc g mL TH ẢO - Chú thích: Thay đổi điều kiện ủ 22,5 oC ± 2,5 oC đến ngày sử dụng môi trường nuôi cấy khơng bổ sung kháng sinh Dung dịch pha lỗng, dịch trung hồ mơi trường ni cấy 5.1 Ự Qui định chung D Chỉ dẫn chung đưa TCVN … (ISO 21148) Nước đề cập tài liệu này, nước cất nước tinh khiết theo tiêu chuẩn TCVN … (ISO 21148) Các dung dịch pha lỗng, dung dịch trung hịa mơi trường ni cấy sau phù hợp để định lượng nấm men nấm mốc Các dung dịch pha loãng, dịch trung hịa mơi trường ni cấy khác sử dụng chúng chứng minh phù hợp để sử dụng 5.2 5.2.1 Dung dịch pha loãng trung hịa dịch pha lỗng Qui định chung Dịch pha lỗng sử dụng để phân tán mẫu Nó chứa chất trung hịa mẫu có đặc tính kháng khuẩn Hiệu việc trung hòa cần chứng minh trước thực bước đếm (xem mục 12) Thơng tin liên quan đến chất trung hịa thích hợp đưa Phụ lục D TCVN 02 5.2.2 Các dịch pha lỗng trung hịa 5.2.2.1 Mơi trường casein thủy phân - lecithin đậu nành - polysorbat 20 (SCDLP 20 broth) 5.2.2.1.1 Thành phần Casein thủy phân pancreatin 20,0 g Lecithin đậu nành 5,0 g Polysorbat 20 40,0 mL Nước 960 mL 5.2.2.1.2 Chuẩn bị Hòa tan polysorbate 20 960 mL nước cách vừa khuấy vừa đun nóng bể cách thủy TC VN 49 oC ± oC Thêm casein thủy phân pancreatin lecithin đậu nành Đun nóng khoảng 30 phút để tan hồn tồn Phân phối mơi trường vào bình tích thích hợp Hấp tiệt khuẩn 121 oC 15 phút Sau hấp để nguội, pH phải đạt khoảng 7,3 ± 0,2 đo nhiệt độ phịng 5.2.2.2 Các chất pha lỗng trung hịa khác 5.2.3 TH ẢO Các chất pha lỗng trung hịa khác sử dụng thích hợp (xem Phụ lục A Phụ lục D) Dung dịch pha loãng 5.2.3.1 Dung dịch A Ự 5.2.3.1.1 Thành phần Nước D Pepton từ mô động vật 1,0 g 1000 mL 5.2.3.1.2 Chuẩn bị Hoà tan g pepton vào 1000 mL nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình chứa tích thích hợp Hấp tiệt khuẩn 121 oC 15 phút Sau hấp để nguội, pH phải đạt khoảng 7,3 ± 0,2 đo nhiệt độ phòng 5.2.3.2 Các dịch pha loãng khác Các dịch pha loãng khác sử dụng thích hợp (xem Phụ lục B) 5.3 Dung dịch pha loãng nấm men (Dung dịch Natri tryptone chlorid) TCVN 02 5.3.1 Thành phần Tryptone, casein thủy phân pancreatin 1,0 g Natri clorua 8,5 g Nước 1000 mL 5.3.2 Chuẩn bị Hoà tan thành phần nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình chứa tích thích hợp Hấp tiệt khuẩn 121 oC 15 phút Sau hấp để nguội, pH phải đạt khoảng 7,1 ± 0,2 đo nhiệt độ phịng Mơi trường ni 5.4.1 TC VN 5.4 u cầu chung Mơi trường ni cấy chuẩn bị sau, chuẩn bị từ môi trường khô theo hướng dẫn nhà sản xuất Môi trường pha sẵn sử dụng thành phần / hiệu suất sinh trưởng chúng tương đương với công thức đưa Môi trường sabouraud dextrose chloramphenicol agar (SDCA) Dextrose Pepton từ mô động vật TH ẢO 5.4.2 Chloramphenicol D Thạch Ự Casein thủy phân pancreatin Nước 40,0 g 5,0 g 5,0 g 0,050g 15,0 g 1000mL 5.4.2.1 Chuẩn bị Hịa tan thành phần (bao gồm chloramphenicol) mơi trường khơ hồn chỉnh nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình tích thích hợp Hấp tiệt khuẩn 121 °C 15 phút Sau hấp để nguội, pH phải đạt khoảng 5,6 ± 0,2 đo nhiệt độ phòng Lưu ý: Đối với sản phẩm biết khơng có khả tạp nhiễm (vi khuẩn), sử dụng môi trường không chứa kháng sinh chloramphenicol 5.4.3 Các mơi trường ni cấy khác Có thể sử dụng mơi trường thích hợp khác - Xem phụ lục C TCVN 02 Môi trường thạch để nuôi cấy chủng vi sinh vật chuẩn: Sabouraud dextrose agar 5.4.4 (SDA) 5.4.4.1 Thành phần Dextrose 40,0 g Pepton từ mô động vật 5,0 g Casein thủy phân pancreatin 5,0 g Thạch 15,0 g Nước 000 mL 5.4.4.2 Chuẩn bị TC VN Hịa tan thành phần mơi trường khơ hồn chỉnh nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình tích thích hợp Hấp tiệt khuẩn 121 °C 15 phút Sau hấp để nguội, pH phải đạt khoảng 5,6 ± 0,2 đo nhiệt độ phòng Thiết bị dụng cụ thủy tinh 21148) Chủng vi sinh vật TH ẢO Sử dụng thiết bị phịng thí nghiệm, thiết bị dụng cụ thủy tinh mô tả TCVN… (ISO Để xác nhận hiệu chất trung hòa, sử dụng chủng nấm men sau: - Candida albicans ATCC(1) 10231 chủng tương đương: CIP(2) 48.72 NCPF(3) 3179 Ự NBRC(4) 1594 KCTC(5) 17205 chủng tương đương sưu tập chủng giống quốc gia khác Nấm men xem có độ nhạy cảm với hoạt tính kháng nấm nấm mốc chấp D - nhận lồi đại diện cho nhóm nấm để thực phép thử xác định phù hợp phương pháp Tuy nhiên trường hợp đặc biệt,phép thử hiệu chất trung hòa thực cách thêm vào chủng nấm mốc chuẩn, sử dụng quy trình phù hợp để tạo thành hỗn dịch chủng đối chứng Các chủng cần hồn ngun theo quy trình hướng dẫn nhà cung cấp Các chủng lưu giữ phịng thí nghiệm theo (EN 12353) ATCC = American Type Culture Collection = Bộ sưu tập chủng chuẩn Mỹ CIP = Bộ sưu tập Viện Pasteur, Pháp NCPF = National Collection of Pathogenic Fungi = Bộ sưu tập nấm gây bệnh quốc gia, Anh Quốc NBRC = National Biological Resource Center = Trung tâm tài nguyên sinh vật quốc gia, Nhật Bản KCTC = Korean Collection for Type Culture = Bộ sưu tập chủng chuẩn Hàn Quốc TCVN 02 Xử lý sản phẩm mỹ phẩm mẫu thử phịng thí nghiệm Nếu cần thiết, giữ sản phẩm thử nghiệm nhiệt độ phịng Khơng ủ, làm lạnh cấp đơng sản phẩm (xem mục 3.3) mẫu thử nghiệm (xem mục 3.4) trước sau phân tích Mẫu thử sản phẩm mỹ phẩm chuẩn bị để phân tích nên tiến hành mô tả TCVN … (xem ISO 21148) theo quy trình đưa mục 9 Cách tiến hành 9.1 Quy định chung Sử dụng vật liệu vô khuẩn, thiết bị kỹ thuật vô khuẩn để chuẩn bị mẫu thử nghiệm, pha hỗn dịch mẫu ban đầu dung dịch pha loãng Khi chuẩn bị hỗn dịch mẫu ban đầu, khoảng thời gian từ TC VN lúc hoàn tất việc chuẩn bị đến lúc hỗn dịch mẫu ban đầu / mẫu pha lỗng bắt đầu tiếp xúc với mơi trường nuôi cấy không nên 45 phút, trừ có u cầu đặc biệt khác quy trình tài liệu thiết lập 9.2.1 Chuẩn bị hỗn dịch mẫu ban đầu Quy định chung TH ẢO 9.2 Hỗn dịch mẫu ban đầu chuẩn bị từ g mL sản phẩm trộn điều kiện thử nghiệm Ghi chú, S: khối lượng hay thể tích xác mẫu thử nghiệm Hỗn dịch mẫu ban đầu thường có độ pha lỗng 1:10 Lượng dung dịch pha lỗng mơi trường Ự lớn sử dụng mẫu có nguy nhiễm vi sinh vật cao / hoạt tính 9.2.2 D kháng khuẩn cịn độ pha loãng 1:10 Các sản phẩm tan nước Chuyển lượng mẫu, S, sản phẩm vào thể tích phù hợp (ví dụ mL) dung dịch pha lỗng trung hịa (xem mục 5.2.2) dung dịch pha lỗng (xem mục 5.2.3) Chú thích: Ký hiệu độ pha lỗng d 9.2.3 Các sản phẩm khơng tan nước Chuyển lượng mẫu, S, sản phẩm vào bình chứa phù hợp với lượng thích hợp tác nhân phân tán (ví dụ polysorbat 80) Phân tán mẫu thử tác nhân hòa tan thêm thể tích (ví dụ mL) dung dịch pha lỗng trung hịa (xem mục 5.2.2) dung dịch pha lỗng (xem mục 5.2.3) mơi trường tăng sinh lỏng thích hợp (xem mục 5.4.3.2) tùy theo phương pháp sử dụng (xem mục 9.3 9.4) TCVN 02 Chú thích: Ký hiệu độ pha loãng d 9.3 9.3.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc 9.3.1 Pha loãng cho phương pháp đếm Hỗn dịch mẫu ban đầu tính độ pha lỗng Nếu cần thiết, thực dãy pha lỗng (ví dụ 1:10) từ hỗn dịch mẫu ban đầu, sử dụng chất pha loãng (tùy theo mức độ tạp nhiễm dự kiến sản phẩm) Thông thường, thực đếm khuẩn lạc hai đĩa petri cho độ pha lỗng Nhưng sử dụng đĩa Petri trường hợp kiểm tra thường xuyên phương pháp đếm thực độ pha loãng liên tiếp mẫu dựa theo kết 9.3.2 Phương pháp đĩa thạch 9.3.2.1 Phương pháp đổ đĩa thạch TC VN trước Chuyển mL hỗn dịch chủng ban đầu / mẫu pha loãng chuẩn bị phần thẩm định vào đĩa petri có đường kính từ 85 mm đến 100 mm (xem mục 12), thêm vào đĩa từ 15 TH ẢO mL đến 20 mL môi trường thạch làm nóng chảy giữ bể ổn nhiệt không 48 °C Nếu sử dụng đĩa petri lớn hơn, lượng môi trường thạch cần tăng lên tương ứng Trộn hỗn dịch mẫu ban đầu / dịch pha lỗng mẫu với mơi trường cẩn thận cách xoay nghiêng đĩa để phân tán Để đĩa bề mặt nằm ngang, hỗn hợp đĩa đơng lại nhiệt độ phịng Ự 9.3.2.2 Phương pháp cấy trải Trong đĩa petri có đường kính từ 85 mm đến 100 mm, cho 15 mL đến 20 mL môi trường thạch D làm nóng chảy giữ bể ổn nhiệt khơng 48 °C Nếu sử dụng đĩa Petri lớn hơn, thể tích mơi trường tăng lên tương ứng Để nguội làm đơng đĩa tủ an tồn sinh học tủ ủ Trải khắp bề mặt đĩa thạch thể tích xác định khơng 0,1 mL lượng hỗn dịch mẫu ban đầu / mẫu pha loãng chuẩn bị mô tả mục 13 9.3.2.3 Phương pháp màng lọc Sử dụng màng lọc có kích thước lỗ khơng lớn 0,45 μm Chuyển lượng hỗn dịch mẫu ban đầu mẫu pha lỗng thích hợp chuẩn bị phần thẩm định (tốt đại diện từ g mL sản phẩm) lên màng Lọc rửa màng, tiến hành theo quy trình thực đánh giá phù hợp (xem mục 12) Chuyển màng lọc lên bề mặt môi trường thạch (xem mục 5.4.2) TCVN 02 9.3.2.4 Ủ mẫu Trừ có quy định khác, lật ngược đĩa có mẫu đặt chúng vào tủ ấm 22.5 oC ± 2,5 oC đến ngày sử dụng điều kiện thay Sau ủ, đĩa phải kiểm tra Nếu khơng có quy định khác bảo quản đĩa tủ lạnh oC ± oC tối đa 24 Chú thích 1: Trong số trường hợp định, có khả gây nhầm lẫn việc đếm khuẩn lạc với tiểu phân từ sản phẩm, chuẩn bị đĩa tương tự độ pha loãng mẫu môi trường thạch bảo quản tủ lạnh để so sánh với đĩa đem ủ Chú thích 2: Nếu nghi ngờ có nấm mốc nấm men, cần đọc kết thời điểm trung gian, (mà không cần phải đợi đủ - ngày) Sau ủ, đếm khuẩn lạc (xem mục 11.2.3): TC VN 10 Đếm khuẩn lạc (phương pháp đếm đĩa phương pháp màng lọc) - Trong đĩa Petri có chứa từ 15 khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc; có 15 khuẩn lạc - Trên màng lọc chứa 15 khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc; có 15 khuẩn lạc 11 Tính tốn kết - TH ẢO 11.1 Phương pháp tính tốn kết cho phương pháp đĩa thạch Tính số N vi sinh vật có mẫu S, m số khuẩn lạc trung bình đếm hai đĩa nồng độ tính theo cơng thức (1) c số khuẩn lạc đếm đĩa tính theo cơng thức (2) số trung bình cân chỉnh từ hai độ pha lỗng liên tiếp có số khuẩn lạc phù hợp tính theo Ự cơng thức (3) (1) N = c / (V x d) (2) N= (3) D N = m / (V x d) / (V-d) Trong đó: m số khuẩn lạc trung bình đếm từ hai đĩa có nồng độ; V thể tích mẫu sau pha lỗng vào đĩa, tính theo mL; d hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng bước chuẩn bị hỗn dịch ban đầu (xem mục 9.2) cho độ pha loãng lần đầu tiên; c số khuẩn lạc đếm đĩa đơn TCVN 02 - trung bình cân chỉnh từ hai độ pha loãng liên tiêp có số khuẩn lạc phù hợp tính sau: Trong đó: ∑c tổng khuẩn lạc đếm tất đĩa từ hai độ pha loãng liên tiếp; n1 số lượng đĩa đếm từ hỗn dịch mẫu ban đầu (hoặc lần pha loãng đầu tiên); n2 số lượng đĩa tính độ pha loãng 1/10 hỗn dịch mẫu ban đầu (hoặc cho lần pha lỗng thứ hai) Làm trịn số kết thu đến chữ số có nghĩa Khi số cần làm trịn nhỏ số đứng trước khơng phải thay đổi, số cuối lớn làm trịn số đứng TC VN trước lên đơn vị, tiếp tục thu chữ số có nghĩa Ghi lại số N thu 11.2 Diễn giải kết 11.2.1 Cần xác định độ sai lệch phương pháp đếm đĩa Hai kết nên coi khác có khác biệt 50 % hoặc, thể log khác biệt TH ẢO vượt 0,3 Để kết đếm xác, nên sử dụng đĩa màng lọc có 15 khuẩn lạc 150 khuẩn lạc Chọn kết đếm từ độ pha lỗng, mà phù hợp phương pháp chứng minh (xem mục 12) 11.2.2 Trường hợp đĩa có 15 khuẩn lạc 150 khuẩn lạc đĩa Nếu S g mL, V mL Số lượng nấm men nấm mốc D - Ự màng, biểu thị kết sau: mililit gram mẫu = N / S - Nếu S g mL, / V mL Số lượng nấm men nấm mốc mẫu (lưu ý lượng mẫu thử, coi S V) = N Trong S khối lượng thể tích mẫu thử Biểu diễn kết dạng số 1,0 9,9 nhân lên theo cấp số 10 (xem ví dụ) 11.2.3 Trường hợp đĩa có 15 khuẩn lạc đĩa màng lọc, biểu thị kết sau: - Nếu S g mL, V mL, ước tính số lượng nấm men nấm mốc mililit gram mẫu = N / S 10 TCVN 02 - Nếu S g mL, / mL, ước tính số nấm men nấm mốc mẫu = N Trong đó: S khối lượng thể tích mẫu (xem mục 9.2) Biểu diễn kết dạng số 1,0 9,9 nhân lên theo cấp số 10 (xem ví dụ 4, ví dụ 5, ví dụ 6) Thể kết dạng số 1,0 9,9 nhân với công suất tương ứng 10 (xem ví dụ) 11.2.4 Trường hợp khơng thấy xuất khuẩn lạc, kết báo cáo sau: - Ít / d x V x S nấm men nấm mốc gram mililít sản phẩm (S g mL) Ít / d x V nấm men nấm mốc mẫu S (lưu ý lượng mẫu thử, coi S V S g mL) Trong TC VN - d hệ số pha loãng hỗn dịch mẫu ban đầu (xem mục 9.2) V (đếm phương pháp đổ đĩa thạch lọc qua màng) 0,1 (đối với phương pháp TH ẢO cấy trải) (xem ví dụ) Ví dụ 1: Một độ pha loãng cấy lên hai đĩa S = g ; V = 1; Số khuẩn lạc đếm độ pha loãng 10-1 38 CFU 42 CFU Nhập vào công thức (1): N = m / (V x d) = 40 / (1 x 10-1) = 40 / (1 x 0,1) = 400 x 102 tế bào nấm men nấm mốc Ự mililit gram mẫu D Ví dụ 2: Một độ pha loãng cấy lên đĩa S = 1g, V = 1, Số khuẩn lạc đếm độ pha lỗng 10-1 60 CFU Nhập vào cơng thức (2): N = c / (V x d) = 60 / (1 x 10-1) = 60 / (1 x 0,1) = 600 x 102 tế bào nấm men nấm mốc mililit gram mẫu Ví dụ 3: Hai độ pha lỗng cấy lên đĩa S = g, V = 1, Số khuẩn lạc đếm độ pha loãng 10-2 235 CFU 282 CFU; độ pha loãng 10-3 31 CFU 39 CFU Nhập vào công thức (3): N= / (V x d) =( 235 + 282 + 31 + 39) / [(2 + 0,1 x 2) x (1 x 10-2)]= 587 / 0,022 = 26682 11 TCVN 02 Làm tròn kết nêu 27000 2,7 x 104 tế bào nấm men nấm mốc mililit gram mẫu Ví dụ 4: Một độ pha lỗng cấy lên hai màng lọc S = g; V = 1; Số khuẩn lạc đếm độ pha loãng 10-1 18 CFU 22 CFU Nhập vào công thức (1): N = m l (V x d)= 20 / (1 x 10-1) = 20 / (1 x 0,1) = 200 x 102 tế bào nấm men nấm mốc mililit gram mẫu Ví dụ 5: Một độ pha loãng cấy lên màng lọc S = g; V = 1; Số khuẩn lạc đếm độ pha loãng 10-1 65 CFU Nhập vào công thức (2): mililit gram mẫu Ví dụ 6: Hai độ pha lỗng cấy lên hai màng lọc TC VN N = c / (V x d ) = 65 / (1 x 10-1) = 65 / 0,1 = 650 6,5 x 102 tế bào nấm men nấm mốc S = g, V= 1; Số khuẩn lạc đếm độ pha loãng 10-1 121 CFU 105 CFU; Số khuẩn lạc Nhập vào công thức (3): N= TH ẢO đếm độ pha loãng 10-2 15 CFU 25 CFU / (V x d) = 121 + 105 + 15 + 25 / [(2 + 0,1 x 2) x (1 x 10-1)] = 266 / 0,22 = 1209 Làm tròn kết nêu cho phép 1200 1,2 x 103 nấm men nấm mốc mililit gram mẫu Ự Ví dụ 7: Một độ pha lỗng cấy lên hai đĩa D S = g; V = 1, Số khuẩn lạc đếm độ pha loãng 10-1 28 CFU 22 CFU Nhập vào công thức (1): N = m / (V x d) = 25 / (1 x 10-1) = 25 / (1 x 0,1) = 250 Con số ước tính 250 2,5 x 102 nấm men nấm mốc mililit gram mẫu Ví dụ 8: S = g; V = 1, Số khuẩn lạc đếm độ pha loãng 10-1 CFU CFU Nhập vào công thức (1): N = ≤ / d.V ,S, ≤ (1 / 0,1).1,1 ≤ 10 tế bào nấm men nấm mốc mililit gram mẫu Con số ước tính 10 nấm men nấm mốc mililit gram mẫu 12 TCVN 02 12 Trung hòa chất kháng nấm sản phẩm 12.1 Quy định chung Các thử nghiệm khác mô tả nhằm chứng minh vi sinh vật phát triển điều kiện phân tích 12.2 Chuẩn bị nuôi cấy Trước thử nghiệm, nuôi cấy bề mặt Candida albican môi trường thạch không chọn lọc – Sabouraud dextrose agar (SDA) Ủ 32,5 oC ± 2,5 oC 18 đến 24 Để gặt chủng, dùng que cấy vô khuẩn lấy khuẩn lạc bề mặt môi trường sau nuôi cấy hịa tan tế bào vào dịch pha lỗng (xem mục 5.2) để tạo hỗn dịch chủng có nồng độ tế bào vào khoảng 1x106 CFU/mL Ví dụ xác định nồng độ máy quang phổ (xem ISO 21148) Sử TC VN dụng hỗn dịch chuẩn dung dịch pha lỗng từ vịng 12.3 Sự phù hợp phương pháp đếm đĩa thạch 12.3.1 Nguyên tắc Trộn mẫu trung hòa hỗn dịch mẫu ban đầu, mẫu pha loãng phụ thuộc vào hoạt tính kháng nấm độ hịa tan sản phẩm) với chủng chuẩn pha loãng Chuyển lên đĩa Petri mẫu) TH ẢO lọc qua màng lọc Sau ủ, kiểm tra đếm khuẩn lạc so sánh với đĩa đối chứng (khơng có Nếu số lượng đếm 50 % (0,3 log) so với đối chứng Cần thay đổi quy trình để loại bỏ chất ức chế (chất pha loãng, chất trung hòa kết hợp hai, xem phụ lục D) Khi xảy khả sản phẩm bị nhiễm loại vi sinh vật thử nghiệm, kết xác định phù hợp Ự phương pháp trường hơp không chấp nhận D 12.3.2 Xác nhận phù hợp phương pháp đổ đĩa thạch Trộn mL hỗn dịch mẫu ban đầu / mẫu pha lỗng chất pha lỗng trung hịa (hoặc chất pha loãng khác, xem mục 5.2) với mL hỗn dịch vi sinh vật có nồng độ 1000 CFU/mL đến 3000 CFU / mL Chuyển mL hỗn dịch vào đĩa petri (tốt lặp lại đĩa), thêm vào đĩa 15 mL đến 20 mL môi trường đun chảy giữ bể ổn nhiệt không 48 oC Tiến hành song song đĩa đối chứng sử dụng chất pha loãng bổ sung tương tự lượng hỗn dịch vi sinh vật, khơng có mẫu Sau ủ ngày đến ngày nhiệt độ 22,5 oC ± 2,5 oC, sử dụng điều kiện thay (xem Chú thích mục 4.2 4.3), đếm khuẩn lạc đĩa so sánh với khuẩn lạc thu đĩa đối chứng Dung dịch pha loãng phương pháp đếm xác nhận độ pha loãng 1:10 (khi 1mL hỗn dịch mẫu ban đầu sử dụng) chứng minh thẩm định đạt 50 % so với đối chứng 13 TCVN 02 12.3.3 Xác nhận phù hợp phương pháp cấy trải Trộn mL hỗn dịch mẫu ban đầu dung dịch trung hòa (hoặc dung dịch khác, xem mục 5.1) với mL hỗn dịch vi sinh vật có chứa 10000 CFU/mL đến 30000 CFU/mL (hoặc thấp trải 0,5 mL mL) Trải 0,1 mL vào đĩa thạch đông cứng (xem mục 5.4.2) (tốt lặp lại đĩa) Tiến hành song song với đĩa đối chứng sử dụng chất pha loãng bổ sung lượng hỗn dịch vi sinh vật, khơng có mẫu Sau ủ ngày đến ngày nhiệt độ 22,5 oC ± 2,5 oC, sử dụng điều kiện thay (xem Chú thích mục 4.2 4.3), đếm khuẩn lạc đĩa so sánh với khuẩn lạc thu đĩa đối chứng Dung dịch pha loãng phương pháp đếm xác nhận độ pha loãng 1:10 (khi 1mL hỗn dịch mẫu ban đầu sử dụng) chứng minh thẩm định đạt 50 % so với đối chứng TC VN 12.3.4 Xác nhận phù hợp phương pháp màng lọc Trộn thể tích hỗn dịch mẫu ban đầu dịch pha loãng mẫu (xem mục 9.3.2.3) với lượng phù hợp hỗn dịch vi sinh vật chuẩn hóa tương ứng với khoảng 100 CFU Lọc tồn thể tích rửa màng với lượng thể tích nước (xem mục 5.1), dịch pha loãng (xem mục 5.2.3) dịch pha lỗng trung hịa xác định (xem mục 5.2.2) Chuyển màng TH ẢO vào bề mặt mơi trường thạch thích hợp (xem mục 5.4.2) Tiến hành song song với mẫu đối chứng điều kiện trên, sản phẩm Lọc rửa mẫu đối chứng điều kiện mẫu thử Sau ủ ngày đến ngày nhiệt độ 22,5 oC ± 2,5 oC, đếm khuẩn lạc màng so sánh số lượng thu thử nghiệm đĩa đối chứng Dung dịch pha loãng phương pháp màng D Ự lọc xác nhận đạt xác nhận 50 % (0,3 log) so với đối chứng 14 TCVN 02 13 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm ghi rõ: a) Tất thông tin cần thiết cho việc nhận biết đầy đủ sản phẩm; b) Phương pháp sử dụng; c) Các kết thu được; d) Tất chi tiết thực để chuẩn bị hỗn dịch mẫu ban đầu; e) Mơ tả phương pháp với chất trung hịa môi trường sử dụng; f) Chứng minh phù hợp phương pháp, thử nghiệm thực g) TC VN riêng; Bất kỳ điểm không nêu tài liệu này, coi tùy chọn (không bắt D Ự TH ẢO buộc), với chi tiết cố ảnh hưởng đến kết 15 TCVN 02 Phụ lục A (Cung cấp thông tin) Các dung dịch trung hòa khác A.1 Quy định chung Bất dung dịch trung hòa sử dụng để tạo hỗn dịch mẫu ban đầu kiểm tra thẩm định Các dung dịch trung hòa sau ví dụ dung dịch phù hợp Thơng tin chung trung hịa đưa Phụ lục D A.2 Môi trường lỏng Eugon LT100 TC VN A.2.1 Yêu cầu chung Thành phần môi trường có chứa chất chất trung hịa chất chất ức chế có mẫu (lecithin polysorbat 80) chất phân tán (octoxynol 9) A.2.2 Thành phần TH ẢO Casein thủy phân pancreatin Papaic L- cystin Natri clorid Sodium sulfit Glucose Polysorbat 80 D Lecithin từ trứng Ự Pepton đậu tương Bột đậu nành thủy phân Octoxynol Nước 15,0 g 5,0 g 0,7 g 4,0 g 0,2 g 5,5 g 1,0 g 5,0 g 5,0 g 1000 mL A.2.3 Chuẩn bị Hòa tan polysorbat 80, octoxynol lecithin từ trứng vào nước sôi tan hồn tồn Hịa tan thành phần khác nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình tích thích hợp Hấp tiệt khuẩn 121 oC 15 phút Sau hấp để nguội, pH phải đạt khoảng 7,0 ± 0,2 đo nhiệt độ phòng 16 TCVN 02 A.3 Dung dịch Lecithin polysorbate (LP) A.3.1 Thành phần Polypepton 1,0 g Lecithin từ trứng 0,7 g Polysorbat 80 20,0 g Nước 980 mL A.3.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình tích thích hợp Hấp tiệt khuẩn 121 oC 15 phút Sau hấp để D Ự TH ẢO TC VN nguội, pH phải đạt khoảng 7,2 ± 0,2 đo nhiệt độ phòng 17 TCVN 02 Phụ lục B (Cung cấp thông tin) Các dung dịch khác B.1 Quy định chung Bất dung dịch sử dụng để tạo hỗn dịch mẫu ban đầu kiểm tra thẩm định Các dung dịch sau ví dụ dung dịch phù hợp B.2 Dung dịch đệm pepton pH7 B.2.1 Thành phần 1,0 g TC VN Pepton từ thịt Natri clorid 4,3 g Mono kali photphat 3,6 g Dinatri phosphate dihydrat 7,2 g Nước TH ẢO 1000 mL B.2.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình tích thích hợp Hấp tiệt khuẩn 121 oC 15 phút Sau hấp để Đệm photphat (pH7,2) D B.3 Ự nguội, pH phải đạt khoảng 7,2 ± 0,2 đo nhiệt độ phòng B.3.1 Thành phần Kali dihydrogen phosphat Nước 34 g 500 mL B.3.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước vào bình 1000 mL Điều chỉnh pH 7,2 ± 0,1 với 175 mL Natri hydroxid (4,3 g/100 mL) Sau thêm nước vào để đạt thể tích cuối 1000 mL Nồng độ cuối đạt 0,05 mol/l Đây dung dịch gốc Bảo quản tủ lạnh Trước sử dụng, pha loãng dung dịch với nước tỉ lệ 1:800 hấp tiệt khuẩn 121 °C 15 phút 18 TCVN 02 Phụ lục C (Cung cấp thông tin) Các môi trường nuôi cấy khác C.1 Quy định chung Bất môi trường nuôi cấy sử dụng kiểm tra thẩm định Các mơi trường ví dụ môi trường phù hợp C.2 Môi trường thạch dùng để đếm C.2.1 Môi trường thạch potato dextrose bổ sung kháng sinh Thành phần TC VN C.2.1.1 Dịch chiết từ khoai tây 4,0 g Glucose 20,0 g Thạch 15,0 g Chloramphenicol 0,05 g Nước Chuẩn bị TH ẢO C.2.1.2 1000 mL Hòa tan thành phần nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình tích thích hợp Hấp tiệt khuẩn 121 oC 15 phút Sau hấp để nguội, pH phải đạt khoảng 5,6 ± 0,2 đo nhiệt độ phịng Ự Có thể thay việc sử dụng chloramphenicol 0,10 g Kali benzylpenicillin 0,10 g tetracillin D lít mơi trường, cho dạng vô trùng trước sử dụng C.2.2 Mơi trường Glucose-pepton (GP) có kháng sinh C.2.2.1 Thành phần Glucose 20,0 g Cao nấm men 2,0 g Magnesi sulfat 0,5 g Pepton 5,0 g Monokali phosphat 1,0 g Thạch Chloramphenicol Nước 15,0 g 0,05 g 1000mL 19 TCVN 02 C.2.2.2 Chuẩn bị Trộn thành phần phân phối vào bình tích thích hợp Hấp tiệt khuẩn 121 oC 15 phút Sau hấp để nguội, pH phải đạt khoảng 5,6 ± 0,2 đo nhiệt độ phịng Có thể thay việc sử dụng chloramphenicol 0,10 g Kali benzylpenicillin 0,10 g tetracillin lít mơi trường, cho dạng vô trùng trước sử dụng C.3 Môi trường thạch cao nấm men C.3.1 Thành phần Cao nấm men 30,0 g Pepton đậu nành, bột đậu nành thủy phân 3,0 g TC VN papaic Thạch 15,0 g Chloramphenicol 0,05 g Nước C.3.2 Chuẩn bị TH ẢO 1000 mL Hòa tan thành phần (bao gồm chloramphenicol) mơi trường khơ hồn chỉnh nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình tích thích hợp Hấp D nhiệt độ phòng Ự tiệt khuẩn 115 oC 10 phút Sau hấp làm nguội, pH phải đạt khoảng 5,6 ± 0,2 đo 20 TCVN 02 Phụ lục D (Cung cấp thông tin) Các chất trung hịa tương ứng với hoạt tính kháng nấm chất bảo quản dung dịch rửa/ lọc Hợp chất hóa học trung hịa hoạt tính kháng khuẩn chất bảo quản Chất bảo quản Ví dụ thành phần chất trung hịa thích hợp dung dịch rửa (dùng cho phương pháp màng lọc) Các hợp chất phenol: Lecithin, Polysorbat 80, 30 g/L + lecithin, g/L - Polysorbat 80, Ethylen oxid ngưng tụ cồn béo, g/L + lecithin, 20 g/L + polysorbat 80, g/L Các paraben, phenoxyethanol, - Ethylen oxid ngưng tụ cồn béo (fatty alcohol) Phenylethanol, v.v… Môi trường lỏng trung hòa D/E a Chất hoạt động bề mặt không ion Dung dịch rửa: nước cất vô trùng; trypton, g/L + NaCl, g/L; polysorbat 80, g/L Các hợp chất amoni bậc bốn Lecithin, saponin, polysorbat 80, natri dodecyl sulphat Polysorbat 80, 30 g/L + natri dodecyl sulphat, g/L + lecithin, g/L Các chất hoạt động bề mặt cation Ethylen oxid ngưng tụ cồn béo (fatty alcohol) TC VN Các anilin Polysorbat 80, 30 g/L + saponin, 30 g/L + lecithin, g/L Môi trường lỏng trung hòa D/E a Dung dịch rửa: nước cất vô trùng; trypton, g/L + NaCl, g/L; polysorbat 80, g/L Glycin, histidin TH ẢO Các andehit Các chất giải phóng formaldehyd Lecithin, saponin D Các isothiazolinon, imidazol Natri thiosulfat Ự Các hợp chất oxy hóa Các biguanide Lecithin, g/L + polysorbate 80, 30 g/L + L-histidin, g/L Polysorbat 80, 30 g/L + saponin, 30 g/L + L-histidin, g/L + L-cystein, g/L Môi trường lỏng trung hòa D/E a Dung dịch rửa: polysorbat 80, g/L + L-histidin, 0,5 g/L Natri thiosulfat, g/L Dung dịch rửa: Natri thiosulfat, g/L Polysorbat 80, 30 g/L + saponin, 30 g/L + lecithin, g/L Các amin, sulfat, mercaptan, natri bisulfit, natri thioglycolat Dung dịch rửa: trypton, g/L + NaCl, g/L; polysorbat 80, g/L Lecithin, saponin, polysorbat 80 Polysorbat 80, 30 g/L + saponin, 30 g/L + lecithin, g/L Dung dịch rửa: trypton, g/L + NaCl, g/L; polysorbat 80, g/L Các muối kim loại (Cu, Zn, Hg) Natri bisulfat, L-cystein Natri thioglycolat, 0,5 g/L hay g/L L-cystein, 0,8 g/L hay 1,5 g/L Các muối thủy ngân hữu Các hợp chất sulfhydryl, axít thioglycolic Mơi trường lỏng trung hòa D/E a Dung dịch rửa: Natri thioglycolat, 0,5 g/L a Mơi trường lỏng trung hịa D/E (Mơi trường lỏng trung hòa Dey/Engley) – xem Phụ lục B 21 TCVN 02 Tài liệu tham khảo [1] ISO 18415, Cosmetics -Microbiology -Detection of specified and non-specified microorganisms [2] ISO 18416:2015, Cosmetics – Microbiology - Detection of Candida albicans [3] EN 13624:2013, Chemical disinfectants and antiseptics – Quantitative suspension test for the evaluation of fungicidal or yeasticidal activity in the medical area – test method and requirements (phase 2, step 1) [4] COLIPA Guidelines on Microbial Quality M anagement, European Cosmetics, Toiletry TC VN and Perfumery Association COLIPA, 1997 [5] CTFA Microbiology Guidelines Toiletry and Fragrance Association, 2001 [6] E P Microbiological Examination of non-sterile products, European Pharmacopoeia, Fourth Edition, 2002 [7] FDA Bacteriological Analytical Manual, 8th edition, U.S Food and Drug [8] J P 14, General Tests -Microbial Limit test, published by the Japanese Pharmacopoeia, 2001 [9] TH ẢO Administration, 1995 USP 28, Microbial Limit test (61), published by the U.S Pharmacopoeia, 2005 S The Use of Preservative Neutralizers in Diluents and Plating Media D [11] SINGER Ự [10] ATLAS R.M Handbook of Microbiological Media CRC Press, 1993 Cosmetics and Toiletries 1987 December, 102, pp 55 [12] ISO 29621, Cosmetics -Microbiology –Guidelines for the risk assessment and identification of microbiologically low-risk products 22