PHÁT HIỆN PSEUDOMONAS AERUGINOSA TRONG MỸ PHẨM Cosmetics – Microbiology – Detection of Pseudomonas aeruginosa

TCVN T I ÊU C H U ẨN Q U Ố C G I A TC VN DỰ THẢO PHÁT HIỆN PSEUDOMONAS AERUGINOSA TH ẢO TRONG MỸ PHẨM Cosmetics – Microbiology – Detection of Pseudomonas D Ự aeruginosa THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – TCVN…08… Lời nói đầu TCVN …08 xây dựng sở ISO 22717:2015 Cosmetics – Microbiology – Detection of Pseudomonas aeruginosa TCVN …08 Viện Kiểm nghiệm Thuốc Tp Hồ Chí Minh biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, VN Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công D Ự TH ẢO TC bố TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN Phát Pseudomonas aeruginosa mỹ phẩm Cosmetic – Microbiology – Detection of Pseudomonas aeruginosa Phạm vi áp dụng VN Tiêu chuẩn quốc tế đưa hướng dẫn chung để phát định danh Pseudomonas aeruginosa sản phẩm mỹ phẩm Các vi sinh vật coi gây bệnh theo tiêu chuẩn TC khác với quy định riêng quốc gia Để đảm bảo chất lượng độ an toàn cho người tiêu dùng, thực phương pháp phân tích rủi ro vi sinh vật phù hợp để xác định loại sản phẩm mỹ phẩm áp dụng phương pháp theo TCVN TH ẢO Các sản phẩm coi có nguy nhiễm vi sinh vật theo TCVN … (xem ISO 29621) bao gồm sản phẩm có hoạt độ nước thấp, sản phẩm chứa cồn, sản phẩm có giá trị pH cực đoan… Phương pháp mô tả tiêu chuẩn dựa việc phát Pseudomonas aeruginosa môi trường lỏng không chọn lọc (môi trường tăng sinh), tiếp phân lập mơi trường thạch chọn lọc Các phương pháp khác thích hợp phụ thuộc vào giới hạn phát Ự Chú thích: Đối với việc phát Pseudomonas aeruginosa, cấy truyền môi trường nuôi D cấy không chọn lọc, sau thực bước định danh thích hợp (ví dụ sử dụng Kit định danh) Do đa dạng sản phẩm mỹ phẩm nên phạm vi áp dụng này, phương pháp khơng phù hợp cho số sản phẩm đặc biệt (ví dụ sản phẩm không thấm nước) Các tiêu chuẩn khác TCVN (xem ISO 18415) phù hợp Các phương pháp khác (ví dụ phương pháp định danh tự động) chứng minh tương đương phù hợp thay cho thử nghiệm trình bày tiêu chuẩn Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) ISO 21148:2017, Cosmetics – Microbiology – General instructions for microbiological examination TCVN 08 EN 12353, Chất hấp tiệt khuẩn hoá học chất tiệt khuẩn - Bảo quản sinh vật thử nghiệm sử dụng để xác định hoạt tính diệt khuẩn (kể Legionella), vi khuẩn nội bào, bào tử, nấm virút (kể bacteriophages) Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn này, sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau 3.1 Sản phẩm Một phần sản phẩm mỹ phẩm xác định mà phịng thí nghiệm nhận để sử dụng cho mục đích thử nghiệm 3.2 Mẫu Là phần sản phẩm (ít g mL) dùng để chuẩn bị hỗn dịch mẫu ban đầu VN 3.3 Hỗn dịch mẫu ban đầu 3.4 Mẫu pha loãng 3.5 Vi sinh vật gây bệnh TH ẢO Mẫu pha loãng từ hỗn dịch mẫu ban đầu TC Hỗn dịch hay dung dịch mẫu thử thể tích định mơi trường tăng sinh lỏng phù hợp Vi khuẩn ưa nhiệt hiếu khí nấm men khơng có sản phẩm mỹ phẩm xác định loài gây bệnh da gây hại cho sức khoẻ người vi sinh vật điểm việc khơng đảm bảo vệ sinh q trình sản xuất Ự 3.6 Pseudomonas aeruginosa D Trực khuẩn Gram âm, di động, khuẩn lạc mịn, sinh sắc tố màu nâu màu lục nhạt Chú thích 1: Đặc điểm để định danh: phát triển môi trường thạch chọn lọc cetrimid, có phản ứng oxidase dương tính, phát huỳnh quang sinh sắc tố phenazin (pyocyanin) môi trường thích hợp Chú thích 2: Pseudomonas aeruginosa phân lập từ nhiều nguồn khác đặc biệt nước có khả phân hủy nhiều chất Nó gây viêm nhiễm cho da vùng mắt người Đây lồi vi sinh vật khơng mong muốn sản phẩm mỹ phẩm có khả gây bệnh làm thay đổi đặc tính hóa lý sản phẩm (Xem mục 11) 3.1 Môi trường tăng sinh lỏng Môi trường lỏng không chọn lọc chứa chất trung hòa / chất phân tán thích hợp chứng minh phù hợp cho thử nghiệm TCVN 08 Nguyên tắc Bước quy trình làm tăng số lượng vi sinh vật môi trường lỏng không chọn lọc đảm bảo vi sinh vật không bị ức chế tác nhân chọn lọc có mơi trường chọn lọc / phân biệt Bước thứ hai thử nghiệm (phân lập) thực môi trường chọn lọc sau thử nghiệm định danh Phải trung hòa khả ức chế phát triển vi sinh vật mẫu thử phép phát vi sinh vật sống Trong trường hợp phương pháp nào, phải kiểm tra chứng minh trung hịa đặc tính kháng khuẩn sản phẩm (xem mục 11) Dung dịch pha lỗng mơi trường ni cấy VN 5.1 Quy định chung Hướng dẫn chung đưa TCVN… (xem ISO 21148) Nước đề cập tiêu chuẩn TC nước cất nước tinh khiết TCVN… (xem ISO 21148) Môi trường tăng sinh lỏng sử dụng để phân tán mẫu thử tăng số lượng vi sinh vật ban đầu Mơi trường có chứa chất trung hịa mẫu kiểm tra có chứa chất kháng khuẩn Hiệu lực TH ẢO phương pháp trung hòa cần chứng minh (xem mục 11) Thơng tin chất trung hịa phù hợp đưa Phụ lục B Theo tiêu chuẩn này, môi trường tăng sinh lỏng (xem mục 5.3.3.1) hay môi trường liệt kê phụ lục A phù hợp để kiểm tra có mặt Pseudomonas aeruginosa Những môi trường chứng minh phù hợp theo mục 11 Ự Những dung dịch pha lỗng mơi trường ni cấy khác sử dụng D chứng minh phù hợp 5.2 Dung dịch pha loãng cho hỗn dịch vi khuẩn (dung dịch trypton natri clorid) 5.2.1 Quy định chung Dung dịch pha loãng sử dụng để chuẩn bị hỗn dịch vi khuẩn dùng cho kiểm tra phù hợp quy trình thử nghiệm (xem mục 11) 5.2.2 Thành phần Tryptone, casein thủy phân pancreatin 1,0 g Natri clorid 8,5 g Nước 1000 mL TCVN 08 5.2.3 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối dung dịch vào bình tích thích hợp Hấp tiệt khuẩn 121 oC 15 phút Sau hấp để nguội, pH phải đạt khoảng 7,0 ± 0,2 đo nhiệt độ phịng 5.3 Mơi trường ni cấy 5.3.1 Quy định chung Dung dịch pha loãng sử dụng để chuẩn bị hỗn dịch vi khuẩn dùng cho kiểm tra tính phù hợp quy trình thử nghiệm (xem mục 11) 5.3.2 Mơi trường thạch để kiểm tra tính phù hợp phương pháp (xem Mục 11) [môi trường thạch casein đậu tương (SCDA) môi trường thạch đậu tương tryptic (TSA)] VN 5.3.2.1 Thành phần Casein thủy phân pancreatin Natri clorid 5,0 g TC Bột đậu nành thủy phân papain 15,0 g 5,0 g TH ẢO Thạch Nước 15,0 g 1000 mL 5.3.2.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần riêng rẽ môi trường môi trường khơ hồn chỉnh nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình tích thích hợp Hấp tiệt 5.3.3 D độ phòng Ự khuẩn 121 °C 15 phút Sau hấp để nguội, pH phải đạt khoảng 5,6 ± 0,2 đo nhiệt Môi trường tăng sinh lỏng 5.3.3.1 Eugon LT 100 5.3.3.1.1 Quy định chung Đây mơi trường có chứa thành phần để trung hịa chất ức chế có mặt mẫu: lecithin, polysorbat 80 tác nhân phân tán octoxynol TCVN 08 5.3.3.1.2 Thành phần Casein thủy phân pancreatin 15,0 g 5,0 g L - cystine 0,7 g Natri clorid 4,0 g Natri sulfit 0,2 g Glucose 5,5 g Lecithin từ trứng 1,0 g Polysorbat 80 5,0 g Octoxynol 1,0 g VN Bột đậu nành thủy phân papain Nước 1000 mL TC 5.3.3.1.3 Chuẩn bị Hịa tan hồn toàn thành phần polysorbat 80, octoxynol lecithin từ trứng nước nóng Hịa tan thành phần khác nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường TH ẢO vào bình tích thích hợp Hấp tiệt khuẩn 121 °C 15 phút Sau hấp để nguội, pH phải đạt khoảng 7,0 ± 0,2 đo nhiệt độ phịng 5.3.3.2 Các mơi trường tăng sinh lỏng khác Có thể sử dụng mơi trường tăng sinh lỏng khác phù hợp (xem Phụ lục A) Môi trường thạch chọn lọc để phân lập Pseudomonas aeruginosa Ự 5.3.4 D 5.3.4.1 Môi trường thạch Cetrimid 5.3.4.1.1 Thành phần Gelatin thủy phân pancreatin Magnise clorid Kali sulfat Cetrimid (cetyltrimethylammonium bromid) 20,0 g 1,4 g 10,0 g 0,3 g Thạch 13,6 g Glycerol 10,0 g Nước 1000 mL TCVN 08 5.3.4.1.2 Chuẩn bị Hòa tan tất thành phần rắn vào nước thêm glycerol vừa khuấy vừa đun sơi phút để hịa tan hồn tồn Phân phối mơi trường vào bình tích thích hợp Hấp tiệt khuẩn 121oC 15 phút Sau hấp để nguội, pH phải đạt khoảng 7,2 ± 0,2 đo nhiệt độ phịng 5.3.5 Mơi trường thạch chọn lọc để định danh Pseudomonas aeruginosa 5.3.5.1 Môi trường thạch Pseudomonas phát pyocyanin (thạch Pseudomonas P) 5.3.5.1.1 Thành phần Gelatin thủy phân pancreatin 20,0 g Magnesi clorid khan 1,4 g 10,0 g Thạch 15,0 g Glycerol 10,0 g VN Kali sulfat khan Nước TC 1000 mL 5.3.5.1.2 Chuẩn bị TH ẢO Hòa tan tất thành phần rắn vào nước thêm glycerol vừa khuấy vừa đun sơi phút để hịa tan hồn tồn Phân phối mơi trường vào bình tích thích hợp Hấp tiệt khuẩn 121oC 15 phút Sau hấp để nguội, pH phải đạt khoảng 7,2 ± 0,2 nhiệt độ phòng Dụng cụ dụng cụ thủy tinh Ự Sử dụng thiết bị phịng thí nghiệm dụng cụ theo mô tả TCVN… (xem ISO 21148) Chủng vi sinh vật D Để xác nhận tính phù hợp điều kiện thử nghiệm, chủng vi khuẩn sau sử dụng: Pseudomonas aeruginosa ATCC(1 ) 9027 (tương đương với chủng CIP(2) 82118, NCIMB(3) 8626 NBRC(4) 13275, KCTC(5) 2513) Các chủng cần hoàn nguyên theo hướng dẫn nhà cung cấp Các chủng lưu giữ phịng thí nghiệm theo EN 12353 ATCC = American Type Culture Collection = Bộ sưu tập chủng chuẩn Mỹ CIP = Bộ sưu tập Viện Pasteur, Pháp NCIMB = National Collection of Industrial and Marine Bacteria NBRC = National Biological Resource Center = Trung tâm tài nguyên sinh vật quốc gia, Nhật Bản KCTC = Korean Collection for Type Culture = Bộ sưu tập chủng chuẩn Hàn Quốc TCVN 08 Xử lý sản phẩm mỹ phẩm mẫu thử Giữ sản phẩm thử nghiệm nhiệt độ phòng, cần Không ủ, làm lạnh cấp đông sản phẩm mẫu thử nghiệm trước sau phân tích Quá trình lấy mẫu thử nghiệm từ sản phẩm mỹ phẩm để phân tích cần tiến hành mơ tả ISO 21148 Phân tích mẫu mơ tả ISO 21148 theo quy trình đưa mục 9 Cách tiến hành 9.1 Quy định chung Sử dụng vật liệu vô trùng, thiết bị kỹ thuật vô trùng để chuẩn bị mẫu thử nghiệm, pha hỗn dịch mẫu ban đầu mẫu pha loãng Khi chuẩn bị hỗn dịch mẫu ban đầu, sử dụng dung dịch pha loãng VN hợp lý, khoảng thời gian từ lúc hoàn tất việc chuẩn bị đến lúc hỗn dịch mẫu ban đầu và/ mẫu pha loãng bắt đầu tiếp xúc với môi trường tăng sinh không nên 45 phút, trừ có yêu cầu đặc TC biệt khác quy trình tài liệu thiết lập 9.2 Chuẩn bị hỗn dịch mẫu ban đầu môi trường tăng sinh lỏng 9.2.1 Quy định chung TH ẢO Mẫu thử tăng sinh từ g mL sản phẩm (đã trộn đều) phân tán mL mơi trường tăng sinh lỏng Chú thích, S, khối lượng hay thể tích xác mẫu thử nghiệm Phương pháp thử nghiệm nên kiểm tra để thành phần (chất trung hòa thêm Ự vào) thể tích mơi trường lỏng phù hợp cho thử nghiệm (xem mục 11.3) Chú thích, Trong số trường hợp, có thể, lọc sản phẩm mỹ phẩm qua màng lọc sau D đó, màng lọc cấy vào môi trường tăng sinh lỏng nhằm tạo điều kiện thuận lợi việc trung hòa chất kháng khuẩn sản phẩm (xem mục 11.3) 9.2.2 Các sản phẩm phân tán nước Chuyển lượng mẫu, S, sản phẩm vào bình chứa lượng thích hợp mơi trường tăng sinh lỏng 9.2.3 Các sản phẩm không phân tán nước Chuyển lượng mẫu, S, sản phẩm vào bình chứa lượng thích hợp tác nhân phân tán (ví dụ polysorbat 80) Phân tán mẫu thử tác nhân phân tán thêm lượng thích hợp mơi trường tăng sinh lỏng TCVN 08 9.2.4 Các sản phẩm lọc Sử dụng màng lọc có kích thước lỗ lọc khơng q 0,45 µm Chuyển lượng mẫu, S, lên màng lọc lọc (xem ISO 21148) Lọc nhanh rửa màng lọc lượng nước và/ dung dịch pha loãng xác định Chuyển màng lọc nhúng ngập màng lọc vào ống bình có chứa lượng thích hợp mơi trường tăng sinh lỏng 9.3 Ủ dịch hỗn dịch ban đầu môi trường tăng sinh lỏng Ủ hỗn dịch mẫu ban đầu chuẩn bị môi trường lỏng (xem mục 9.2) 32,5 oC ± 2,5 oC 20 (tối đa 72 giờ) 9.4 Phát định danh Pseudomonas aeruginosa 9.4.1 Phân lập VN Sử dụng que cấy vơ trùng, lấy vịng que cấy dịch mơi trường tăng sinh lỏng cấy lên bề mặt môi trường thạch Cetrimid để thu khuẩn lạc riêng lẻ TC Lật ngược đĩa petri, sau ủ 32,5 oC ± 2,5 oC 24 (tối đa 48 giờ) Kiểm tra đặc điểm khuẩn lạc (xem Bảng 1) TH ẢO Bảng – Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Pseudomonas aeruginosa môi trường chọn lọc Môi trường chọn lọc Môi trường thạch Cetrimid Sinh sắc tố màu lục nhạt, phát huỳnh quang màu lục ánh ánh sáng tia cực tím Định danh Pseudomonas aeruginosa Ự 9.4.2 Đặc điểm khuẩn lạc Pseudomonas aeruginosa D 9.4.2.1 Quy định chung Tiến hành thử ngiệm sau khuẩn lạc nghi ngờ phân lập môi trường thạch cetrimid Sự diện Pseudomonas aeruginosa khẳng định mơi trường phản ứng sinh hóa thích hợp khác 9.4.2.2 Nhuộm Gram Phép thử mô tả TCVN …(xem ISO 21148) Quan sát kính hiển vi tế bào vi khuẩn trực khuẩn Gram âm 9.4.2.3 Phản ứng oxidase Phép thử mô tả TCVN … (xem ISO 21148) Phản ứng oxidase dương tính TCVN 08 9.4.2.4 Nuôi cấy môi trường thạch Pseudomonas để phát pyocyanin Lấy phần nhỏ khuẩn lạc vi khuẩn que cấy vịng ria lên bề mặt mơi trường Pseudomonas P, cho tạo thành khuẩn lạc riêng lẻ Ủ 32,5 oC ± 2,5 oC Sau 24 giờ, 48 72 mở nắp đĩa petri kiểm tra phát triển vi khuẩn Xung quanh khuẩn lạc Pseudomonas aeruginosa có vùng màu xanh dương đến xanh có pyocyanin có màu đỏ đến màu nâu thẫm có pyorubin 9.4.2.5 Báo cáo kết (phát Pseudomonas aeruginosa) Nếu kết định danh xác định có mặt vi khuẩn kết ghi sau: - Phát Pseudomonas aeruginosa mẫu thử Nếu không thấy có phát triển mơi trường tăng sinh và/ kết định danh khuẩn lạc - VN khơng xác định có mặt vi khuẩn kết ghi sau: Khơng phát Pseudomonas aeruginosa mẫu thử TC 10 Trung hòa chất kháng khuẩn có sản phẩm 10.1 Quy định chung TH ẢO Các phép thử khác mô tả dùng để chứng minh vi sinh vật phát triển điều kiện thử nghiệm 10.2 Chuẩn bị chủng cấy Trước tiến hành thử nghiệm, cấy chủng Pseudomonas aeruginosa lên bề mặt môi thạch casein đậu tương (SCDA) môi trường thích hợp khác (mơi trường khơng chọn lọc, khơng chứa Ự chất trung hòa) Ủ đĩa 32,5 oC ± 2,5 oC 18 đến 24 D Để thu hoạch vi sinh vật nuôi cấy, sử dụng que cấy vịng vơ trùng, lấy vệt khuẩn lạc bề mặt môi trường trộn lại dung dịch pha loãng để hỗn dịch chủng điều chỉnh hỗn dịch để thu hỗn dịch chứa khoảng x 108 CFU/mL [có thể sử dụng máy đo quang phổ để xác định nồng độ tương đối, TCVN… (ISO 21148:2017), Phụ lục C] Sử dụng hỗn dịch chủng hỗn dịch chủng pha lỗng từ vịng 10.3 Tính phù hợp phương pháp phát 10.3.1 Cách tiến hành 11.3.1.1 Pha loãng dung dịch xác định nồng độ ống nghiệm chứa mL dung dịch pha loãng để nồng độ cuối khoảng 100 - 500 CFU/mL Đếm nồng độ cuối vi sinh vật sống lại dung dịch pha loãng, chuyển mL huyền phù vào đĩa Petri đổ 15 20 mL môi trường thạch tan chảy giữ ấm bể điều nhiệt nhiệt độ không 48 oC Ủ đĩa 32,5 oC ± 2,5 oC 20 đến 24 TCVN 08 11.3.1.2 Chuẩn bị hai ống chai dung dịch huyền phù ban đầu theo điều kiện lựa chọn cho thử nghiệm (ít g mL sản phẩm thể tích xác định môi trường tăng sinh lỏng) Khi sử dụng phương pháp màng lọc, lọc dung dịch trên, mL sản phẩm chuyển màng lọc vào ống nghiệm chai chứa môi trường tăng sinh lỏng điều kiện lựa chọn cho thử nghiệm 11.3.1.3 Bằng phương pháp vô trùng chuyển 0,1 mL dung dịch pha loãng từ huyền phù xác định vi sinh vật vào ống nghiệm chai (thử nghiệm tính phù hợp) Trộn đều, sau ủ ống nghiệm chai (thử nghiệm phù hợp mẫu đối chứng không chứa vi sinh vật) 32,5 oC ± 2,5 oC 20 đến 24 11.3.1.4 Cấy phân lập cho ống nghiệm hay chai (thử nghiệm tính phù hợp mẫu đối chứng khơng chứa vi sinh vật) Sử dụng que cấy vịng vơ trùng, lấy vòng hỗn dịch ủ, cấy lên 32,5 oC ± 2,5 oC 24 đến 48 TC 10.3.2 Giải thích kết thử nghiệm tính phù hợp VN bề mặt đĩa Petri (đường kính 85 -100 mm) chứa khoảng 15 - 20 mL môi trường thạch cetrimid Ủ đĩa Kiểm tra số lượng vi sinh vật hỗn dịch chủng sau pha loãng (xem mục 11.3.1.1) phải chứa từ 100 500 CFU/mL TH ẢO Nếu Pseudomonas aeruginosa phát triển đặc trưng đĩa kiểm tra khơng có phát triển đĩa đối chứng phương pháp trung hịa có hiệu và phương pháp phát phù hợp Nếu Pseudomonas aeruginosa phát triển đặc trưng đĩa kiểm tra khơng có phát triển đĩa đối chứng phương pháp trung hịa có hiệu và phương pháp phát phù hợp Ự Khi đĩa đối chứng có vi sinh vật phát triển (sản phẩm tạp nhiễm), phương pháp trung hịa có hiệu và phương pháp phát phù hợp Pseudomonas aeruginosa phục hồi đĩa D kiểm tra tính phù hợp Khi khơng thấy phát triển vi sinh vật đĩa kiểm tra phù hợp chứng tỏ hoạt tính kháng khuẩn cần phải điều chỉnh điều kiện phương pháp việc tăng thể tích môi trường dinh dưỡng lỏng mà giữ nguyên lượng mẫu, cách kết hợp lượng đủ tác nhân khử hoạt tính mơi trường tăng sinh lỏng kết hợp biện pháp điều chỉnh để Pseudomonas aeruginosa phát triển Mặc dù có kết hợp tác nhân khử hoạt tính thích hợp gia tăng đáng kể thể tích mơi trưởng lỏng vi sinh vật không sống lại mơ tả kết luận mẫu thử không nhiễm Pseudomonas aeruginosa 11 Báo cáo thử nghiệm 10 TCVN 08 Báo cáo thử nghiệm ghi rõ thông tin sau: a) Tham chiếu Tiêu chuẩn Quốc tế này, tức ISO 22717: 2015 (TCVN…); b) Tất thông tin cần thiết sản phẩm; c) Phương pháp sử dụng; d) Các kết thu được; e) Chi tiết bước tiến hành chuẩn bị hỗn dịch mẫu ban đầu; TH ẢO TC VN Chứng minh phù hợp phương pháp Ự g) Mô tả phương pháp với chất trung hịa mơi trường sử dụng; D f) 11 TCVN 08 Phụ lục A (Cung cấp thông tin) Môi trường tăng sinh lỏng khác A.1 Môi trường soybean-casein-digest-lecithin-polysorbat 80 (SCDLP 80 lỏng) A.1.1 Thành phần Pepton casein 17,0 g 3,0 g Natri clorid (NaCl) 5,0 g Dikali hydrophosphat (K2HPO4) 2,5 g Glucose 2,5 g VN Pepton đậu nành 1,0 g TC Lecithin Polysorbat 80 7,0 g Nước Chuẩn bị TH ẢO A.1.2 1000 mL Hòa tất thành phần mơi trường khơ hồn chỉnh nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình tích thích hợp Hấp tiệt khuẩn nhiệt độ 121 oC 15 phút Sau hấp để nguội, pH phải đạt 7,2 ± 0,2 đo nhiệt độ phịng Mơi trường trung hịa D/E lỏng (Mơi trường trung hịa Dey / Engley lỏng) Ự A.2 A.2.1 Thành phần Glucose  Lecithin đậu nành 7,0 g  Natri thiosulfat pentahydrat (H10Na2O8S2) 6,0 g  Polysorbat 80 5,0 g  Casein thủy phân pancreatin 5,0 g  Natri bisunfit (NaHSO3) 2,5 g  Cao nấm men 2,5 g  Natri thioglycolate (C2H3NaO2S) 1,0 g  Bromcresol đỏ tía  Nước D  10,0 g 0,02 g 1000 mL 12 TCVN 08 A.2.2 Chuẩn bị Hòa tất thành phần mơi trường khơ hồn chỉnh nước cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình tích thích hợp Hấp tiệt khuẩn nhiệt độ 121 oC 15 phút Sau hấp để nguội, pH phải đạt 7,6 ± 0,2 đo nhiệt độ phịng Mơi trường letheen lỏng cải tiến A.3.1 Thành phần Cao thịt pepton 20,0 g 5,0 g Cao thịt bò 5,0 g Cao nấm men 2,0 g Lecithin 0,7 g Polysorbate 80 5,0 g TC Casein thủy phân pancreatin Natri clorid 5,0 g 0,1 g Nước TH ẢO Natri bisunfit A.3.2 VN A.3 1000 mL Chuẩn bị Hòa tan polysorbate 80 lecithin nước nóng Hịa tan thành phần cịn lại cách vừa khuấy vừa đun nóng Phân phối mơi trường vào bình tích thích hợp Hấp tiệt D nhiệt độ phòng Ự khuẩn nhiệt độ 121 oC 15 phút Sau hấp để nguội, pH phải đạt khoảng 7,2 ± 0,2 đo 13 TCVN 08 Phụ lục B (Cung cấp thông tin) Các chất trung hịa tương ứng với hoạt tính kháng khuẩn chất bảo quản dung dịch rửa/ lọc Ví dụ thành phần chất trung hịa thích hợp dung dịch rửa Hợp chất hóa học trung hịa hoạt tính kháng khuẩn chất bảo quản Chất bảo quản (dùng cho phương pháp màng lọc) Các hợp chất phenol: Lecithin, Polysorbate 80, 30 g/L + lecithin, g/L - Các paraben, Polysorbate 80, Ethylene oxide ngưng tụ cồn béo, g/L + lecithin, 20 g/L + polysorbate 80, g/L phenoxyethanol, - Phenylethanol, v.v… Ethylene oxide ngưng tụ cồn béo (fatty alcohol) Mơi trường lỏng trung hịa D/E a Dung dịch rửa: nước cất vô trùng; tryptone, g/L + NaCl, g/L; polysorbate 80, g/L Chất hoạt động bề mặt không ion Các hợp chất amoni bậc bốn Lecithin, saponin, polysorbate 80, natri dodecyl sulphat Polysorbate 80, 30 g/L + natri dodecyl sulphat, g/L + lecithin, g/L Các chất hoạt động bề mặt cation Ethylene oxide ngưng tụ cồn béo (fatty alcohol) Polysorbate 80, 30 g/L + saponin, 30 g/L + lecithin, g/L TC VN Các aniline Mơi trường lỏng trung hịa D/E a Các aldehyd TH ẢO Dung dịch rửa: nước cất vô trùng; tryptone, g/L + NaCl, g/L; polysorbate 80, g/L Glycin, histidin Các chất giải phóng formaldehyd Lecithin, g/L + polysorbate 80, 30 g/L + Lhistidin, g/L Polysorbate 80, 30 g/L + saponin, 30 g/L + Lhistidin, g/L + L-cystein, g/L Môi trường lỏng trung hòa D/E a Natri thiosulfat D Các hợp chất oxy hóa Ự Dung dịch rửa: polysorbate 80, g/L + L-histidin, 0,5 g/L Các isothiazolinon, imidazol Các biguanid Lecithin, saponin Các amin, sulfat, mercaptan, natri bisulfit, natri thioglycolat Lecithin, saponin, polysorbate 80 Natri thiosulfat, g/L Dung dịch rửa: Natri thiosulfat, g/L Polysorbate 80, 30 g/L + saponin, 30 g/L + lecithin, g/L Dung dịch rửa: tryptone, g/L + NaCl, g/L; polysorbate 80, g/L Polysorbate 80, 30 g/L + saponin, 30 g/L + lecithin, g/L Dung dịch rửa: tryptone, g/L + NaCl, g/L; polysorbate 80, g/L Các muối kim loại (Cu, Zn, Hg) Các muối thủy ngân hữu a Natri bisulfat, L-cystein Natri thioglycolat, 0,5 g/L hay g/L L-cystein, 0,8 g/L hay 1,5 g/L Các hợp chất sulfhydryl, acid hioglycolic Mơi trường lỏng trung hịa D/E a Dung dịch rửa: Natri thioglycolat, 0,5 g/L Mơi trường lỏng trung hịa D/E (Mơi trường lỏng trung hịa Dey/Engley) – xem Phụ lục B 14 TCVN 08 Tài liệu tham khảo [1] COLIPA, Guidelines on Microbial Quality Management, European Cosmetic, Toiletry and Perfumery Association (COLIPA), 1997 [2] CTFA, Microbiology Guidelines, publish by the Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, 2007, ISBN 1-882621-32-8 [3] EP, Microbiological Examination of non-sterile products, 4th edition, published by the European Pharmacopoeia, 2002 [4] FDA, Bacteriological Analytical Manual, 8th edition, U.S Food and Drug, 1995, VN Administration, http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-23.htmL J.P 14, General Tests – Microbial Limit test, Japanese Pharmacopoeia, 2001 [6] USP 28, Microbial Limit test , U.S Pharmacopoeia, 2005 [7] ATLAS, R.M Handbook of Microbiological Media, CRC Press, ISBN 0-8493-2944-2, 1993 [8] SINGER, S The Use of Preservative neutralizers in diluents and plating media, Cosmetics TC [5] [9] TH ẢO and Toiletries, 1987, 102 (December), pp 55 ISO 21149, Cosmetic – Microbiology – Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria [10] ISO 18415, Cosmetic – Microbiology – Detection of specified and non-specified Ự microorgamisms [11] EN 1040, Chemical disinfectants and antiseptics – Basic bactericidal activity – Test method D and requirements (phase 1) [12] ISO 29621, Cosmetic – Microbiology – Guidelines for the risk assessment and identification of microbiologically low-risk products 15