Phương pháp PCR trong định lượng định tính covid 19

Phương pháp PCR trong định lượng định tính covid 19 Phương pháp PCR trong định lượng định tính covid 19 Phương pháp PCR trong định lượng định tính covid 19 Phương pháp PCR trong định lượng định tính covid 19 Phương pháp PCR trong định lượng định tính covid 19 Phương pháp PCR trong định lượng định tính covid 19 Phương pháp PCR trong định lượng định tính covid 19 Phương pháp PCR trong định lượng định tính covid 19 Phương pháp PCR trong định lượng định tính covid 19 Phương pháp PCR trong định lượng định tính covid 19 Phương pháp PCR trong định lượng định tính covid 19

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG TIỂU LUẬN MÔN GENOMIC PHÂN TỬ PHƯƠNG PHÁP PCR TRONG ĐỊNH LƯỢNG/ĐỊNH TÍNH COVID 19 Giáo viên hướng dẫn: TS PHẠM ĐÌNH CHƯƠNG Người thực hiện: TRẦN ĐỖ BẢO NHI_619H0049 NGUYỄN THỊ VÂN ANH_619H0106 ĐÀO CẨM QUYỀN_619H0134 PHẠM QUỐC TUẤN_619H0075 Nhóm : 04 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 Contents Tổng quan RealTime PCR Real time RT-PCR ? .4 2.1 Realtime PCR làm việc với COVID - 19 2.2 Thành phần Real time PCR 2.3 Material .6 Phương pháp .8 3.1 Công nghệ phân tích Real-time PCR .8 3.2 Phân tích định lượng RT-qPCR 3.2.1 Định nghĩa qPCR 3.2.2 Phản ứng 3.2.3 Ưu điểm .10 3.2.4 Nhược điểm .10 3.3 3.3.1 Định nghĩa ddPCR .10 3.3.2 Phản ứng 11 3.3.3 Ưu điểm .12 3.3.4 Nhược điểm .12 3.4 Kết .13 3.5 qPCR 13 3.6 ddPCR 14 3.7 Compararision 14 3.7.1 Phát đột biến, SNP, allen bổ trợ 15 3.7.2 Biểu gene 15 3.7.3 Chỉnh sửa gen 16 3.7.4 Số lượng chép .16 3.8 Phân tích định lượng ddPCR 10 Chọn phương pháp PCR phù hợp với ứng dụng 17 Reference 17 MỤC LỤC HÌNH ẢN Hình Máy Real-time PCR Hình Cơng thức hóa chất nhuộm SYBR® Green I Hình Tạo tín hiệu suốt trình kiểm tra RT-qPCR .9 Hình Quy trình phản ứng ddPCR 11 Hình Các giai đoạn khuyết đại qPCR 13 Hình Kết PCR vi giọt kỹ thuật số cho phản ứng khác 14 Hình So sánh ddPCR qPCR 14 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DNA RNA RT - PCR dd PCR acid deoxyribonucleic acid ribonucleic Real Time Polymerase Chain Reaction Droplet Digital Polymerase Chain SARS-CoV-2 Reaction Severe acute qPCR dPCR RT corona virus qualitattive PCR digital PCR Reverse Transcriptase respiratory syndrome Tổng quan RealTime PCR Bùng phát vào cuối tháng 12/2019, bắt nguồn từ chợ hải sản Hồ Nam, Vũ Hán, miền Trung Trung Quốc, virus Corona ban đầu xác nhận loại bệnh “viêm phổi lạ” “viêm phổi không rõ nguyên nhân” Các nhà khoa học tiến hành nghiên cứu phân lập chủng corona virus mới, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) tạm thời gọi SARS-CoV-2 có trình tự gen giống với SARS-CoV trước đây, với mức tương đồng lên tới 79,5% Đây dạng virus nên người chưa có miễn dịch, kể miễn dịch chéo trước Khi virus xâm nhập vào thể, vào số tế bào chiếm lấy máy tế bào (gây tổn thương viêm đặc hiệu đường hô hấp), đồng thời virus chuyển hướng máy để phục vụ cho nó, tạo virus nhiễm tiếp người khác Xét nghiệm sinh học phân tử realtime RT-PCR phương pháp xét nghiệm xác định diện virus thông qua phát vật liệu di truyền virus SARSCoV-2, phương pháp có độ xác cao Xét nghiệm realtime RT-PCR cho kết định lượng nồng độ virus thời điểm xét nghiệm Kết giúp bác sĩ tiên lượng tiến triển bệnh, đánh giá hiệu điều trị Hiện có nhiều xét nghiệm khác dựa kỹ thuật qPCR, cho việc phát virus, phịng thí nghiệm tồn giới điều chỉnh xét nghiệm PCRs cho SARS-CoV-2 họ qua việc sử dụng đoạn mồi khác nhắm vào phần khác trình tự gen virus Các xét nghiệm RT-PCR nhắm vào RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRp)/helicase, protein gai (spike) nucleocapsid SARS-CoV-2 giúp cải thiện chẩn đốn COVID-19 phịng xét nghiệm PCR định lượng, real time PCR, (qPCR) PCR phiên mã ngược (RTPCR) sử dụng tuyến tính khuếch đại DNA để xác định số lượng tuyệt đối tương đối chuỗi biết mẫu Bằng cách sử dụng phóng viên huỳnh quang phản ứng, đo tạo DNA xét nghiệm qPCR Real time RT-PCR ? Trong PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại (amplicon) phát phân tích điểm cuối (end-point), cách chạy DNA gel agarose sau phản ứng kết thúc Ngược lại, Real time RT-PCR cho phép phát đo lường tích tụ sản phẩm khuếch đại tiến triển phản ứng, nghĩa "thời gian thực" Kỹ thuật realtime PCR phương pháp sử dụng để khuếch đại phân tử DNA in vitro Tuy nhiên, Realtime PCR khác phản ứng PCR thơng thường chỗ có khả phát định lượng trực tiếp sản phẩm PCR sau chu kỳ phản ứng Phương pháp đòi hỏi máy luân nhiệt đặc biệt, có thiết bị đo cường độ phát huỳnh quang từ giếng mẫu trang bị chương trình phần mềm cho phép xử lý kết quả, xác định biến đổi cường độ huỳnh quang phản ứng khuếch đại Hình Máy Real-time PCR Ưu điểm Real time PCR so với PCR truyền thống Real time PCR cho phép bạn xác định số mẫu với độ xác độ nhạy cao dải động rộng Kết Real time PCR định tính (sự diện vắng mặt trình tự) định lượng (số lượng DNA) Real time PCR định lượng gọi qPCR Ngược lại, PCR thơng thường bán định lượng tốt Ngồi ra, liệu Real time PCR đánh không cần điện di gel, dẫn đến giảm thời gian thí nghiệm tăng thơng lượng Cuối cùng, phản ứng chạy liệu đánh giá hệ thống ống kín, hội ô nhiễm giảm nhu cầu thao tác hậu khuếch đại loại bỏ 2.1 Realtime PCR làm việc với COVID - 19 Một mẫu lấy từ phận thể nơi tập trung virus COVID-19, chẳng hạn mũi cổ họng người Mẫu xử lý số dung dịch hóa học loại bỏ chất protein chất béo chiết xuất RNA có mẫu RNA chiết xuất pha trộn vật liệu di truyền người và, có, RNA virus RNA chép ngược thành DNA cách sử dụng enzyme cụ thể (Phương pháp Reverse Transcription PCR) Sau đó, nhà khoa học thêm mảnh DNA ngắn bổ sung cho phần cụ thể DNA virus phiên mã Nếu virus có mẫu, mảnh vỡ tự gắn vào phần mục tiêu DNA virus Một số mảnh di truyền thêm vào sử dụng để xây dựng sợi DNA trình khuếch đại, mảnh khác sử dụng để xây dựng DNA thêm nhãn đánh dấu vào sợi, sau sử dụng để phát virus Đây cách mà người ta dung để định tính COVID-19 virus Hỗn hợp sau đặt máy real time RT-PCR Máy chu kỳ qua nhiệt độ làm nóng làm mát hỗn hợp để kích hoạt phản ứng hóa học cụ thể tạo mới, giống hệt phần mục tiêu DNA virus Chu kỳ lặp lặp lại nhiều lần để tiếp tục chép phần mục tiêu DNA virus Mỗi chu kỳ tăng gấp đơi số trước đó: hai trở thành bốn, bốn trở thành tám, v.v Một thiết lập real time RT-Real time PCR tiêu chuẩn thường trải qua 35 chu kỳ, có nghĩa là, vào cuối trình, khoảng 35 tỷ phần DNA virus tạo từ sợi virus có mẫu Khi phần DNA virus xây dựng, nhãn đánh dấu gắn vào sợi DNA sau giải phóng thuốc nhuộm huỳnh quang, đo máy tính máy trình bày thời gian thực hình Máy tính theo dõi lượng huỳnh quang mẫu sau chu kỳ Khi mức huỳnh quang định bị vượt qua, điều xác nhận virus có mặt Các nhà khoa học theo dõi cần chu kỳ để đạt đến mức để ước tính mức độ nghiêm trọng nhiễm trùng: chu kỳ ít, nhiễm virus nghiêm trọng 2.2 Thành phần Real time PCR Thời gian thực phát sản phẩm PCR thực cách bao gồm phản ứng phân tử huỳnh quang báo cáo gia tăng lượng DNA với gia tăng tỷ lệ tín hiệu huỳnh quang Các hóa chất huỳnh quang sử dụng cho mục đích bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA đầu dị đánh dấu cụ thể trình tự nhãn huỳnh quang probe Các tuần hoàn nhiệt chuyên dụng trang bị mô-đun phát huỳnh quang sử dụng để theo dõi huỳnh quang trình khuếch đại xảy Huỳnh quang đo phản ánh lượng sản phẩm khuếch đại chu kỳ 2.3 Material Chìa khố kỹ thuật kỹ thuật realtime PCR hai loại hóa chất sử dụng để phát sản phẩm PCR thiết bị Real time PCR: Hóa chất nhuộm SYBR® Green I Màu huỳnh quang chèn vào sợi đơi DNA có lực cao có diện sợi đôi DNA lực làm cho sợi đôi phát ánh sáng huỳnh quang nhận nguồn sáng kích thích Do đó, máy xác định cường độ ánh sáng huỳnh quang phát tăng lên sau chu kỳ phản ứng Hình Công thức hóa chất nhuộm SYBR® Green I Đây phương pháp phát thứ Người ta sử dụng thuốc nhuộm xen kẽ kết hợp vào DNA sợi kép Trong số thuốc nhuộm huỳnh quang này, thuốc nhuộm SYBR® Green I sử dụng phổ biến Phương pháp phát phù hợp amplicon nghiên cứu, thuốc nhuộm xen kẽ vào DNA sợi kép tạo Bất kể phương pháp liên kết, có hai yêu cầu DNA thuốc nhuộm liên kết để phát thời gian thực sản phẩm PCR:  Tăng huỳnh quang bị ràng buộc với DNA sợi kép  Không ức chế PCR Các điều kiện cho phép sử dụng SYBR ® Green I tồn PCR mà khơng có ức chế PCR tăng độ nhạy phát so với Ethidium bromide Đầu dị phát huỳnh quang (Taqman® probes) Là đoạn oligonucleotide sợi đơn có trình tự bắt cặp bổ sung với trình tự đặc hiệu DNA đích Đầu dị oligonucleotide gắn phân tử phát huỳnh quang Sự phát quang thơng thường xuất có mặt kết cặp đầu dị (probe) với phân tử DNA đích Vì cường độ phát quang thay đổi sau chu kỳ phản ứng PCR Qua máy Realtime giúp định lượng số nhân lên thời điểm Ngồi cịn nhiều chế phát quang nhà nghiên cứu phát triển Nhưng nhìn chung dựa vào thay đổi cường độ huỳnh quang sau chu kỳ phản ứng, phân tử DNA đích tạo nhiều Phương pháp phát thứ hai sử dụng Primer oligonucleotide mục tiêu đặc hiệu, TaqMan® probes, Molecular Beacons Scorpion primers Oligonucleotide dán nhãn thuốc nhuộm huỳnh quang Quencher Bản thân oligonucleotide khơng có huỳnh quang đáng kể, phát huỳnh quang ủ vào mẫu (như Molecular Beacons) thuốc nhuộm cắt từ oligo trình mở rộng (như đầu dò TaqMan) TaqMan Probe sử dụng đầu dò phát huỳnh quang phép phát sản phẩm PCR cụ thể tích lũy chu kỳ PCR Thiết kế đầu dò phát huỳnh quang chế tạo cách kết hợp thuốc nhuộm Reporter đầu 5′ thuốc nhuộm Quencher đầu 3′, đơn giản hóa đáng kể thiết kế tổng hợp hiệu đầu dò 5’ nuclease phát huỳnh quang thử nghiệm Phương pháp 3.1 Công nghệ phân tích Real-time PCR Tổng số 56 bệnh nhân nhập viện (nhập viện từ ngày 21 tháng đến ngày 12 tháng năm 2020) xác nhận nhiễm SARS-CoV-2 chi nhánh (Hán Khẩu, Thành phố Trung-Pháp Thung lũng Quang học) Bệnh viện Đồng Tế Bệnh viện Đồng Tế thuộc Đại học Hoa Trung Khoa học Công nghệ Vũ Hán, Trung Quốc, đưa vào nghiên cứu Tất bệnh nhân tham gia chẩn đoán xác định COVID-19 theo hướng dẫn chẩn đoán điều trị SARS-CoV-2 Ủy ban Y tế Quốc gia Trung Quốc hướng dẫn tạm thời Trung tâm Kiểm sốt Phịng ngừa Dịch bệnh Mẫu ngốy họng mẫu ngoáy mũi sâu thu thập từ bệnh nhân vào ngày khác sau bắt đầu xuất triệu chứng SARS-CoV-2 phát xét nghiệm RT-Real time PCR sử dụng phát acid nucleic COVID-19 theo quy trình nhà sản xuất (Shanghai Huirui Biotechnology Co, Ltd) Cụ thể, gen mục tiêu, bao gồm khung đọc mở 1ab (ORF1ab) protein nucleocapsid (N), kiểm tra thử nghiệm RT-Real time PCR Nếu kết âm tính liên tiếp đạt được, khoảng thời gian từ bắt đầu triệu chứng đến ngày có kết xét nghiệm RT-PCR âm tính xác định thời gian chuyển đổi acid nucleic virus Tất liệu (ngày xét nghiệm kết xét nghiệm RT-PCR) thu thập đến ngày theo dõi cuối (ngày tháng năm 2020) 3.2 Phân tích định tính RT-qPCR 3.2.1 Kiểm tra RT-qPCR gì? Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) phương pháp đặc hiệu có độ nhạy cao để khuếch đại phát acid deoxyribonucleic (DNA) Sự đơn giản mặt khái niệm khiến trở nên rộng rãi kỹ thuật sử dụng sinh học phân tử lý thuyết, phát đoạn DNA đơn lẻ.Do đó, Hình 3.2.11 Cấu hình nhiệt thử nghiệm RT-qPCR điển hình chạy thiết bị sử CFX dụng qPCR rộng rãi xét nghiệm chẩn đoán cho loạt vi khuẩn, nấm, BioRad virú ký sinh trùng mầm bệnh Tuy nhiên, gen coronavirus bao gồm acid ribonucleic (RNA) DNA Trong RNA tương tự DNA, đủ khác biệt với Taq polymerase, enzyme tiêu chuẩn sử dụng để khuếch đại DNA, chép hiệu Do đó, RNA phát biến thể thử nghiệm PCR, gọi phiên mã ngược (RT) -PCR Điều bao gồm hai bước phương pháp, thường bao gồm hai enzym; bước sử dụng DNA polymerase phụ thuộc RNA, gọi enzyme chép ngược, để chép RNA thành DNA (cDNA), bước thứ hai sau chuyển sử dụng Taq polymerase, khuếch đại cDNA xét nghiệm PCR tiêu chuẩn Bước phiên mã ngược thực 50°C 15 phút, vơ hiệu hóa RT phút bước kích hoạt Taq polymerase Tiếp theo giai đoạn PCR, bao gồm bước biến tính giây, sợi DNA phân tách thành sợi đơn, ủ nhiệt / polyme hóa 45 giây 60°C , mồi khuếch đại (và đầu dị phát hiện) lai với sợi đơn(cDNA) Khuôn mẫu DNA cho phép polymerase chép khuôn mẫu, tạo DNA sợi kép Trong q trình polyme hóa thành cơng, đầu dò dịch chuyển thủy phân, tách fluorophore(một hợp chất hóa học huỳnh quang phát lại ánh sáng bị kích thích ánh sáng.) dập tắt giải phóng huỳnh quang Q trình lặp lại, thường khoảng 40 lần (40 chu kỳ) Một lần chạy RT-qPCR điển hình, ví dụ đây, hoàn thành khoảng 27 phút Vì RT-qPCR, định lượng đạt cách đo cường độ tín hiệu huỳnh quang cuối chu kỳ để suy lượng sản phẩm PCR tạo 3.2.2 Phản ứng Tạo tín hiệu trình kiểm tra RT-qPCR Thuốc thử kiểm tra bao gồm chất đệm, enzyme, đoạn mồi DNA cụ thể mục tiêu đầu dò DNA cụ 10 Hìnhđánh Tạodấu tín ởhiệu suốt kiểm tra RT-qPCR thể mục tiêu mộttrong đầu nhãntrình huỳnh quang đầu chất dập tắt Các mẫu bên trái bên phải chứa đoạn mồi mẫu dò, mẫu bên trái chứa RNA mục tiêu, mẫu bên phải khơng A RT: Các mẫu ủ nhiệt độ khoảng 50°C, dẫn đến RT phiên mã cDNA đích cụ thể từ mồi đặc hiệu sợi bên trái, khơng có phiên mã ngược bên phải B Biến tính: Mẫu đun nóng đến 95°C, làm biến tính RNA giữ nguyên cDNA C Ủ: nhiệt độ hạ xuống khoảng 60°C, với nhiệt độ thực tế phụ thuộc vào khảo nghiệm Điều cho phép mồi đầu dò mục tiêu cụ thể liên kết với mục tiêu tương ứng chúng bên trái, mồi đầu dị khơng bị ràng buộc bên phải D Polyme hóa: bước kết hợp với bước ủ Ở bên trái, polymerase mở rộng trình tổng hợp DNA, ban đầu từ mồi, sau chu kỳ từ hai, thay thủy phân mẫu dò liên kết Điều tách fluorophore chất dập tắt dẫn đến phát ánh sáng fluorophore kích thích bước sóng thích hợp Ở bên phải, khơng có điều xảy khơng có ánh sáng phát Chu kỳ theo sau số chu kỳ xa hơn, người dùng xác định, biểu thị mũi tên cố định dẫn trở lại bước B E Biểu đồ khuếch đại thu mẫu theo dõi phát xạ ánh sáng ngày tăng đặc tính kết dương tính từ mẫu bên trái (ô màu xanh cây), mẫu khơng có mục tiêu khuếch đại bên phải ghi lại khơng có phát xạ ánh sáng kết âm tính 3.2.3 Ưu điểm Một ưu điểm có giá trị RT-qPCR dễ dàng định lượng RNA nói chung tải lượng virus nói riêng, thông số xét nghiệm đầy đủ thiết lập đối chứng thích hợp đưa vào Chu kỳ định lượng (Cq) trọng tâm 11 việc định lượng xác tái tạo RT-qPCR Các giá trị huỳnh quang ghi lại chu kỳ đại diện cho lượng sản phẩm khuếch đại đến thời điểm phản ứng khuếch đại Càng có nhiều tiêu thời điểm bắt đầu phản ứng, cần chu kỳ để đạt điểm mà tín hiệu huỳnh quang lần ghi lại có ý nghĩa thống kê trên Điểm định nghĩa Cq xảy giai đoạn khuếch đại theo hàm mũ Do đó, việc định lượng không bị ảnh hưởng thành phần phản ứng trở nên hạn chế 3.2.4 Nhược điểm qRT-PCR bị hạn chế phụ thuộc vào đường chuẩn, độ nhạy với chất ức chế mẫu lâm sàng hiệu suất không quán nồng độ thấp Hơn nữa, xét nghiệm COVID-19 qRT-PCR yêu cầu nhiều bước xử lý ngược dòng, bao gồm thu thập mẫu, ly giải virus tinh chế RNA, quy trình làm việc bị hạn chế thiếu hụt nguồn cung cấp phịng thí nghiệm dụng cụ chiết xuất RNA dẫn đến chai cổ chai thử nghiệm COVID-19 3.3 Phân tích định lượng ddPCR 3.3.1 Định nghĩa ddPCR PCR kỹ thuật số giọt (ddPCR) phương pháp thực PCR kỹ thuật số dựa công nghệ giọt nhũ tương dầu nước Một mẫu phân đoạn thành 20.000 giọt khuếch đại PCR phân tử khuôn mẫu xảy giọt riêng lẻ Dùng để định lượng DNA có độ xác cao 3.3.2 Phản ứng Đầu tiên, hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm mồi đích dấu huỳnh quang chuẩn bị (Hình A), nói chung, điểm đánh dấu huỳnh quang đầu dò Taqman thuốc nhuộm gắn kết DNA huỳnh quang Thông thường, kỹ thuật Taqman sử dụng để phát SARS ‐ CoV ‐ 2, gen nucleocapsid gen orf1ab chọn làm mục tiêu 12 Sau đó, giọt nhũ tương dầu nước tạo cách sử dụng chip vi lỏng có kênh cắt ngang (Hình B) Các giọt tạo có đường kính từ 90 đến 120 μm chứa không, nhiều phân tử mục tiêu Sự phân bố mục tiêu phân vùng tuân theo phân phối Poisson Các giọt sau làm nóng tuần hồn nhiệt để khuếch đại (Hình D) Sau chu kỳ nhiệt, số lượng phân tử đích giọt chứa nhiều phân tử tăng lên hàng chục tỷ, đó, tín hiệu huỳnh quang giọt phát Tiếp theo, giọt kiểm tra hệ thống phát quang điện bao gồm tia laser ống nhân quang Sự phát huỳnh quang giọt chứa phân tử mục tiêu đủ mạnh để phân biệt với huỳnh quang (Hình E) Theo biên độ tín hiệu, giọt phân loại tích cực tiêu cực Sử dụng phân bố Poisson, Hình Quy trình phản ứng ddPCR phần giọt dương tính tốn để xác định số lượng tuyệt đối phân tử mục tiêu hỗn hợp phản ứng ban đầu Hình F minh họa kết phân tích phản ứng dPCR đích kép, cụm chế độ xem 2D có kết hợp mục tiêu khác 3.3.3 Ưu điểm Đây phương pháp định lượng tuyệt đối: dPCR nhạy cảm với chất ức chế qPCR việc tính tốn số khơng dựa vào tài liệu tham khảo 13 Độ nhạy cao: dPCR phân chia hỗn hợp phản ứng thành hàng chục nghìn giao dịch Do đó, số lượng DNA khơng mục tiêu bị giảm vài bậc độ lớn phản ứng có chứa mục tiêu (ví dụ: PCR tùy biến thành 10.000 đơn vị phản ứng, DNA không mục tiêu đơn vị giảm bậc độ lớn) Kết là, nhiễu không đặc hiệu tác động lên mục tiêu giảm số bậc cường độ, điều có lợi cho việc khuếch đại hợp lệ mục tiêu Do đó, dPCR trang bị độ nhạy cao định lượng xác mục tiêu Độ ổn định tốt: Nó tự tách chất ức chế khuếch đại hỗn hợp phản ứng thành nhiều đơn vị phản ứng riêng lẻ, làm giảm tổng số chất ức chế đơn vị cải thiện khả chống lại chất ức chế Hơn nữa, chất ức chế ảnh hưởng đến khuếch đại PCR xét nghiệm dPCR, phản ứng phụ bị ảnh hưởng xác định xác cường độ huỳnh quang chúng cao đáng kể so với huỳnh quang Độ xác cao: qPCR thường xun giải khác biệt gấp đôi số lượng xét nghiệm tiêu tăng gấp đôi chu kỳ cường độ huỳnh quang cao hai lần sau chu kỳ Trong dPCR, mặt lý thuyết phát khác biệt phân tử mục tiêu thông qua việc tùy ý hóa hỗn hợp phản ứng PCR việc tăng số lượng phân vùng cải thiện độ xác 3.3.4 Nhược điểm  Đắt so với qPCR  Phạm vi phát động hạn chế  Sự cố với amplicon lớn  Luồng công việc phức tạp so với qPCR 3.4 Kết Mặc dù qPCR dPCR cung cấp khả phát nhạy định lượng xác, điểm mạnh riêng biệt chúng mang lại lợi khác cho ứng dụng khác 14 qPCR cung cấp thông lượng cao dải tác động rộng, hữu ích để sàng lọc số lượng lớn mẫu dPCR cung cấp độ nhạy cho phân biệt phân số (tỷ lệ kiểu đột biến / kiểu ) độ xác tin cậy Cả hai cơng nghệ có khả bổ sung, kết hợp hai phương pháp cung cấp cho nhà nghiên cứu loạt giải pháp cho ứng dụng gen khác 3.5 qPCR Sự gia tăng số lượng DNA chu kỳ đo thay đổi cường độ tín hiệu huỳnh quang So sánh với mẫu tham chiếu xác định số lượng gốc DNA mẫu phản ứng Hình Các giai đoạn khuyết đại qPCR 3.6 ddPCR 15 Mỗi phân vùng phân tích sau chu trình PCR điểm cuối để tìm diện hay khơng có tín hiệu huỳnh quang số lượng phân tử tuyệt đối có mẫu tính tốn dPCR khơng u cầu đường cong chuẩn để định lượng Hình Kết PCR vi giọt kỹ thuật số cho phản ứng khác Hạt dương tính màu xanh dương Hạt âm tính màu đen nằm ngưỡng 3.7 Compararision Hình So sánh ddPCR qPCR 3.7.1 Phát đột biến, SNP, allen bổ trợ Do mức độ đặc hiệu cao, ddPCR khuyến nghị để phát đột biến SNP, phân biệt alen ddPCR cung cấp độ nhạy cần thiết để phát 16 đột biến gặp kiểu không thuần, dạng đơn bội mục tiêu có mức độ phong phú thấp sinh thiết lỏng (chẳng hạn tế bào khối u lưu hành DNA khơng có tế bào) Đối với mẫu có mục tiêu mà sai lệch khuếch đại xảy ra, ddPCR cung cấp định lượng xác tuyệt đối qPCR phù hợp tần số đột biến biết 1% để phân tích tan chảy có độ phân giải cao (HRM) ddPCR  Phát tỷ lệ đột biến 1%  Phù hợp kinh tế cho nghiên cứu sàng lọc lớn  HRM  Phạm vi tác động rộng 3.7.2 Biểu gene qPCR khuyến nghị để nghiên cứu biểu gen, phạm vi tác động rộng nó, với khả định lượng mức độ biểu khác phân biệt biến thể mối nối, khả cho ứng dụng thông lượng cao tự động hóa Ngồi ra, qPCR tiết kiệm xử lý số lượng lớn mẫu Trong số trường hợp, ví dụ, cần phát thay đổi mức thấp ( 1%  Phù hợp kinh tế cho nghiên cứu sàng lọc lớn  Khả ghép kênh  HRM 3.7.4 Số lượng chép ddPCR khuyến nghị để phân tích thay đổi số lượng sao, phát xác thay đổi với qPCR Với qPCR, khác biệt số lượng giảm, số lượng cần thiết tăng lên nhanh chóng dPCR phát thay đổi nhỏ nếp gấp thay đổi số sao, thay đổi từ đến qPCR hữu ích cho ứng dụng thơng lượng cao nơi có khác biệt lớn số lượng 18 ddPCR  Phát thay đổi số lượng nhỏ - biểu thị độ xác 10% thay đổi hình thay đổi phạm vi thử nghiệm  Phân biệt số xác nhạy cảm  Cần qPCR  Phù hợp để phát biến thể lớn  Phổ thông lượng cao  Phạm vi động rộng 3.8 Chọn phương pháp PCR phù hợp với ứng dụng Reference R T Hayden, Z Gu, J Ingersoll, D Abdul-Ali, L Shi, S Pounds, A M Caliendo 2012 “Comparison of Droplet Digital PCR to Real-Time PCR for Quantitative Detection of Cytomegalovirus” Yan Danga , Ning Liua , Chianru Tanb , Yingmei Fenga , Xingxing Yuana , Dongdong Fanb , Yanke Pengb , Ronghua Jina , Yong Guob, Jinli Lou 2020 “Comparison of qualitative and quantitative analyses of COVID-19 clinical sample” 19 Luca Falzone, Nicolò Musso, Giuseppe Gattuso, Dafne Bongiorno, Concetta Ilenia Palermo, Guido Scalia, Massimo Libra, Stefania Stefani 2020 “Sensitivity assessment of droplet digital PCR for SARS-CoV-2 detection” Nicole Jawerth, IAEA Office of Public Information and Communication 2020 “How is the COVID-19 Virus Detected using Real Time RT-PCR?” Applied Biosystems “Real-Time PCR Systems” Phiên Tiếng Việt: Khanh Phan Nguyen Quoc, Ha Xuan Nam, Kim Le Thi Anh “CÁC QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM CHẨN ĐỐN” Marisa L Wong & Juan F Medrano 2018 “Real-time PCR for mRNA quantitation” ThermoFisher scientific “Essentials of Real-Time PCR” Real-time PCR Applications Guide – Bio Rad Caterina Morcia, Roberta Ghizzoni, Chiara Delogu, Lorella Andreani, Paola Carnevali and Valeria Terzi 2020 Review “Digital PCR: What Relevance to Plant Studies?” 20 ... xuất RNA dẫn đến chai cổ chai thử nghiệm COVID- 19 3.3 Phân tích định lượng ddPCR 3.3 .1 Định nghĩa ddPCR PCR kỹ thuật số giọt (ddPCR) phương pháp thực PCR kỹ thuật số dựa công nghệ giọt nhũ tương... Số lượng chép .16 3.8 Phân tích định lượng ddPCR 10 Chọn phương pháp PCR phù hợp với ứng dụng 17 Reference 17 MỤC LỤC HÌNH ẢN Hình Máy Real-time PCR. .. .10 3.3 3.3 .1 Định nghĩa ddPCR .10 3.3.2 Phản ứng 11 3.3.3 Ưu điểm .12 3.3.4 Nhược điểm .12 3.4 Kết .13 3.5 qPCR