Cấy tủy xương

Cấy tủy xương

CẤY TỦY XƯƠNG

TÓM TẮT

Đặt vấn đề: Ở Việt Nam chưa thấy có một nghiên cứu nào xác định đặc điểm của

tủy xương liên quan đến khả năng tạo xương của tủy xương Khả năng tạo xương của tủy xương là nhờ các tế bào gốc trung mô, được đánh giá thông qua số lượng CFU-Fs.Vì vậy chúng tôi thực hiện nghiên cứu nuôi cấy tế bào tủy và đếm số lượng CFU-Fs của tủy xương người Việt Nam

Phương pháp Khoảng 2.0 ml tủy xương được lấy vô trùng pha với 0.1 ml heparin

(5000IU/ml) Tủy được cấy vào môi trường IMDM, 15% FBS, kháng sinh Mẫu được nhuộm Giemsa để quan sát và đếm khúm tế bào CFU-Fs sau 7 ngày nuôi cấy Có 20 mẩu tủy được cấy và đếm CFU-Fs

Kết quả: Nồng độ tế bào đơn nhân sau khi phân lập: 43,9x106/ml, Số CFU-Fs trung bình đếm được sau 7 ngày nuôi: 79,95

ABSTRACT

CULTURE BONE MARROW TO EVALUATE MESENCHYMAL STEM CELLS BY MEANS

OF COUNT OF CFU-FS

Tran Cong Toai, Cao Thi * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 12 - Supplement of No 4 - 2008: 488 – 490

Introduction: There aren’t studies about osteogenic potential of bone marrow in

Viet Nam Mesenchymal stem cells (MSCs) are responsible for osteogenic capacity of bone marrow So, to assess quantity of Vietnamese MSCs, we culture bone marrow and count fibroblast colony forming units (CFU-Fs)

Material and results: Average 2ml of non-infected bone marrow is mixed with 500IU heparin and cultured in medium IMDM, 15% FBS and antibiotic Giemsa

stain is used and CFU-Fs is counted after 7 days Twenty individuals are enrolled in this study After isolated, average concentration of nucleated cells is 43.9x106/ml After 7 days of culture, average of CFU-Fs reaches 79.95

ĐẶT VẤN ĐỀ

Khả năng tạo xương của tủy xương đã được Goujon nêu lên từ năm 1869[2] Các thực nghiệm tế bào – sinh hóa, thực nghiệm ứng dụng của tủy xương trên động vật thí nghiệm, cũng như một số các nghiên cứu trên tủy người cho thấy tủy xương có tính chất tạo xương Tủy xương bao gồm nhiều loại tế bào, trong đó có tế bào gốc dòng tạo máu và tế bào gốc trung mô Các tế bào gốc trung mô là các tế bào trong thành phần mô đệm của tủy xương Các tế bào này biệt hóa thành nhiều kiểu hình tế bào khác nhau, trong đó có các tiền tế bào tạo xương Nhờ các tế bào này mà tủy xương có tính chất tạo xương Để đánh giá số lượng của tế bào gốc trung mô trong tủy, cần phải cấy tủy và đếm số lượng các đơn vị tạo khúm nguyên bào sợi

(CFU-Fs) sau khi nuôi cấy Và do đó số lượng CFU-Fs đặc trưng cho khả năng tạo xương của tủy Ở Việt Nam, chưa thấy một báo cáo nào nghiên cứu đặc điểm của tủy xương liên quan đến tính chất tạo xương của tủy, cụ thể là đếm số lượng CFU-Fs Nhằm rút ra đặc điểm tủy xương liên quan đến tính chất tạo xương ứng dụng trong ngành chấn thương chỉnh hình, so sánh với một số y văn thế giới, chúng tôi tiến hành nghiên cứu nuôi cấy tủy xương và đếm số lượng CFU-Fs

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Có 20 bệnh nhân tham gia vào nghiên cứu Các bệnh nhân này là các bệnh nhân chấn thương cơ quan vận động có phẫu thuật và được chọn ngẫu nhiên trong số các bệnh nhân của Khoa Chấn Thương Chỉnh Hình bệnh viện Chợ Rẫy Trong lúc bệnh nhân đang được mổ, 2ml tủy xương được lấy từ mào chậu trước Dùng kim chọc tủy chọc vào mào chậu hút ra 1 ml tủy, thay đổi vị trí đầu kim đến nơi khác trong mào chậu và hút thêm 1ml tủy Cả 2ml tủy được cho vào ống nghiệm vô trùng có pha sẵn 500IU heparin để chống đông Sau đó tủy được đưa về phòng thí nghiệm và xử lý trong vòng 4 giờ sau khi lấy Tại đây, tủy được ly tâm tách và đếm tế bào có nhân Thành phần tế bào được cấy vào môi trường IMDM, 15% FBS, có pha kháng sinh để chống nhiễm khuẩn Sau 7 ngày, khi các khúm tế bào mọc thấy rõ, mẩu cấy sẽ được nhuộm giemsa để quan sát và đếm khúm tế bào Mỗi khúm tế bào được xem là một CFU-F khi khúm phát triển được nhiều hơn 50 tế bào

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Kết quả phân lập tế bào và đếm CFU-Fs được cho trong bảng 1

Kết quả phân lập tế bào

Nồng độ tế bào có nhân biến thiên rất lớn từ 10x106 đến 160x106 tế bào trên mỗi ml tủy Nồng độ tế bào trung bình trong mỗi ml tủy bằng 43,9X106 với độ lệch chuẩn là 41,2X106 Theo nghiên cứu của Major và cộng sự thì trung bình mỗi ml

tủy hút ra từ mào chậu người khỏe mạnh có chứa 46 32,5x106 tế bào có nhân[3] So sánh hai giá trị trung bình cho thấy kết quả của chúng tôi không khác biệt với kết quả của Major (p<0,05) Đối với nghiên cứu của Hernigou, số lượng tế bào có nhân trong tủy của các bệnh nhân khớp giả xương chày chỉ 18 7x106 [1] Số liệu này có thể là do các bệnh nhân bị khớp giả thường có số tế bào tủy ít hơn, hoặc cũng có thể do cách lấy tủy của tác giả này là chích hút mỗi nơi đầu kim trong cánh chậu đến 4ml tủy

Kết quả đếm số CFU-Fs

Số CFU-Fs cũng biến thiên rất rộng từ 29 đến 156, trung bình là 79,95 Độ lệch chuẩn là 73,2 So với nghiên cứu của Seebach và cộng sự thì ở nam giới khỏe mạnh, số CFU-Fs đếm được là 54 17[4] Như vậy theo cách lấy tủy và môi trường cấy của chúng tôi, số CFU-Fs đạt được nhiều hơn Cũng theo nghiên cứu của Seebach thì ở những bệnh nhân đa thương sẽ cho kết quả số CFU-F lớn hơn (59  rong khi đó theo kết quả của Hernigou thì có thể đếm được 612 CFU-Fs trên mỗi cm3 (12-1224) sau 10 ngày nuôi cấy tủy Số lượng tế bào có

nhân ít hơn nhưng thu được nhiều CFU-Fs hơn Điều này cho thấy sự khác biệt là do môi trường cấy và thời gian cấy, chứ không liên quan đến cách lấy tủy

Liên quan giữa số lượng tế bào có nhân và số CFU-Fs

Dùng bảng ANOVA phân tích phương sai 1 yếu tố thì kết quả của chúng tôi không thấy có mối liên hệ giữa số lượng tế bào có nhân và số lượng CFU-Fs đếm được (p=0,11) Hernigou ghi nhận có thể thu được 1 CFU-F trong 3x104 tế bào có nhân của tủy xương, rong khi đó chúng tôi chỉ thu được trung bình là 1 CFU-F trong 53,6x104 tế bào có nhân

Liên quan giữa số CFU-Fs và tuổi, giới

Bằng cách tương tự không thấy mối liên hệ giữa số CFU-Fs so với tuổi (p=0,9) và với giới tính (p=0,88)

Bảng 1: Kết quả phân lập tế bào và đếm số CFU-Fs

STT Năm sinh Giới tính Thể tích mẫu (ml)

Mật độ tb/ml (X107)

Số CFU-FS

1 1965 Nữ 2,5 5,5 138

2 1985 Nam 2,0 3,2 85

3 1959 Nam 2,0 6,9 120

STT Năm sinh Giới tính Thể tích mẫu (ml)

Mật độ tb/ml (X107)

STT Năm sinh Giới tính Thể tích mẫu (ml)

Mật độ tb/ml (X107)

KẾT LUẬN

Chúng tôi xây dựng được qui trình thu nhận tế bào trung mô tủy xương rút ra từ mào chậu Kết quả mỗi ml tủy trung bình chứa 43,9x106 tế bào có nhân Sau khi cấy 7 ngày đếm được 79,95 CFU-Fs Đây là kết quả bước đầu cấy tủy đếm CFU-Fs, là tài liệu tham khảo cho các tác giả có quan tâm đến vấn đề tế bào gốc trung mô