Cordyceps là chi nấm ký sinh trên côn trùng thuộc họ Cordycipitaceae. Đây là chi được nghiên cứu nhiều bởi sự đa dạng số lượng loài (với khoảng 176 loài đã biết) và các giá trị dược liệu. Trong quá trình nghiên cứu tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia, Sơn La chúng tôi đã thu được mẫu nấm Cordyceps sp. V4. Mẫu nấm ký sinh trên kén sâu và sâu bướm (bộ Lepidoptera).
BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ DOI: 10.15625/vap.2020.00025 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG NẤM Cordyceps sp V4 TẠI KHU BẢO TỒN THIÊN NHIÊN COPIA - SƠN LA Nguyễn Đình Việt1, Trịnh Thúy Nga1, Nguyễn Thị Thùy Vân2, Trương Xuân Lam3, Dương Minh Lam1,* Tóm tắt: Cordyceps chi nấm ký sinh côn trùng thuộc họ Cordycipitaceae Đây chi nghiên cứu nhiều đa dạng số lượng loài (với khoảng 176 loài biết) giá trị dược liệu Trong trình nghiên cứu Khu bảo tồn thiên nhiên Copia, Sơn La thu mẫu nấm Cordyceps sp V4 Mẫu nấm ký sinh kén sâu sâu bướm (bộ Lepidoptera) Kết nghiên cứu đặc điểm hình thái phân tích trình tự ADN số đoạn gen cho thấy mẫu nấm nghiên cứu thuộc chi Cordyceps có lồi gần gũi C militaris C rosea Tuy nhiên, mức độ phân biệt đặc điểm hình thái sinh học phân tử chưa đủ để khẳng định mẫu nghiên cứu lồi cơng bố cơng nhận chi Đây lồi cho khoa học Những nghiên cứu sinh học phân tử đặc điểm sinh học khác cần tiến hành để khẳng định vị trí xếp loại lồi nấm Từ khóa: Cordyceps, nấm ký sinh côn trùng, Copia, Sơn La MỞ ĐẦU Nấm túi họ Cordycipitaceae họ Ophiocordycipitaceae hai họ nấm có số lượng loài lớn thuộc ngành Nấm túi Ban đầu hai họ nấm xếp chung vào họ Clavicipitaceae với đặc điểm hình thái nhận biết như: túi bào tử hình trụ, có đỉnh túi dày bào tử túi phân rã thành nhiều bào tử thứ cấp Các đặc điểm hình thái sở để định loại nấm (Kobayashi, 1982) Tuy nhiên, Sung nnk (2007) dựa phân tích di truyền - vùng gen mục tiêu là: nrSSU, nrLSU, tef1, rpb1, rpb2, β-tubulin (tub) atp6 tách họ nấm Clavicipitaceae thành họ Clavicipitaceae, Cordycipitaceae, Ophiocordycipitaceae (Sung et al., 2007) Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái hai chi nấm Cordycipitaceae Ophiocordycipitaceae có nhiều đặc điểm hình thái phân biệt như: hình thái, xếp thể, hình thái asci, ascospores, part-spores; Đối với loài thuộc chi Cordyceps phần chất (stroma) thường có màu sắc đậm, mềm Quả thể xếp theo trật tự, nằm chìm hồn tồn nửa nổi, nửa chìm chất Bào tử túi khơng màu (hyaline), hình trụ, có vách ngăn sâu đứt gãy; Các lồi nấm thuộc họ Ophiocordycipitaceae có đặc điểm như: chất sẫm màu có màu sắc rực rỡ, cứng rắn Các thể nấm (perithecia) nằm nghiêng chìm chất 1Trường Đại học Sư phạm Hà Nội viện Cảnh sát; 3Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam *Email: duong.minhlam@gmail.com 2Học PHẦN I NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 209 nằm rời rạc bề mặt chất Các túi bào tử (asci) khơng màu, hình trụ, thường có cấu trúc phần đỉnh dày Bào tử túi hình trụ, phân rã thành part-spores không phân rã (Sung et al., 2007) Sự giống nhiều đặc điểm hình thái khả biến đổi cao theo điều kiện môi trường, vùng địa lý, biến đổi thể vô tính, thể hữu tính thành phần lồi phong phú nguyên nhân gây nhiều khó khăn cho việc định danh lồi nấm ký sinh trùng (Sung et al., 2007; Shrestha et al., 2014) Việt Nam có điều kiện tự nhiên lý tưởng cho sinh trưởng phát triển loài nấm Tuy nhiên, nghiên cứu nấm học nói chung Việt Nam nghiên cứu chi nấm Cordyceps nói riêng cịn Ngồi ra, nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng Việt Nam tập trung vào nghiên cứu đặc điểm hình thái Khi nghiên cứu Vườn Quốc gia Cát Tiên, Lê Tấn Hưng (2010) ghi nhận có 12 lồi thuộc chi họ Cordycipitaceae; Nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng Vườn Quốc gia Pù Mát, Nghệ An, Phạm Quang Thu ghi nhận 10 loài, nghiên cứu Trương Xuân Sinh ghi nhận 97 loài thuộc 21 chi; Tại Tam Đảo - Vĩnh Phúc tác giả Phạm Quang Thu mô tả nấm Cordyceps gunnii (Berk.) Berk (Phạm Quang Thu nnk., 2011; Phạm Quang Thu, 2009; Trương Xuân Sinh, Nguyễn Thị Thúy, 2013) Như vậy, so với số lượng loài miêu tả công nhận thuộc chi Cordyceps giới, hiểu biết ghi nhận nhóm nấm cịn hạn chế Tiềm phát triển, nghiên cứu khai thác ứng dụng nấm thuộc họ nước ta lớn Trong đợt khảo sát tháng 12/2016 Khu bảo tồn thiên nhiên Copia, Sơn La, phát mẫu nấm ký sinh cá thể sâu trưởng thành thuộc Lepidoptera Mẫu nấm có trạng thái hữu tính, đặc điểm hình thái giống lồi nấm thuộc chi Cordyceps họ Cordycipitaceae Để định loại xác tới lồi mẫu này, nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học phân tử tiến hành trình bày báo VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Mẫu nấm V4 thu Khu bảo tồn thiên nhiên Copia, Sơn La ngày 24, tháng 12, năm 2016, vị trí tọa độ: 21,19345 oN - 103,36546 oE; Độ cao 1450 m Mẫu có trạng thái hữu tính, loại bỏ đất cây, đựng túi giấy vô trùng, đảm bảo giữ ẩm cho mẫu chuyển phịng thí nghiệm Mẫu nấm bảo quản oC trong tuần để nghiên cứu đặc điểm hình thái phân lập Sau đó, mẫu làm khô điều kiện oC, sấy khô điều kiện nhiệt độ 45 oC bảo quản lâu dài môn Công nghệ sinh học - Vi sinh, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.2 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp phân lập bảo quản chủng nghiên cứu Mẫu phân lập quan sát trực tiếp kính hiển vi soi Olympus SZ61, kính hiển vi Olympus CX31 Bào tử tách, hịa tan 100 µl nước vơ trùng, sau chuyển qua môi trường PDA: khoai tây 200 g, dextrose 20 g, agar 17 g, nước cất 1000 ml, SDAY: dextrose 40 g, peptone 10 g, yeast extract 10 g, agar 17 g, có bổ sung 100 mg/L chloramphenicol Sau 24 - 48 nuôi cấy bào tử nẩy chồi quan sát kính hiển BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM 210 vi soi Các khuẩn lạc không bị tạp nhiễm tách cấy chuyển (Choi et al., 1999) Các ống nghiệm chứa giống nấm sau - ngày nuôi cấy bảo quản oC cấy truyền định kỳ - tháng lần phục vụ cho mục đích nghiên cứu Phân tích đặc điểm hình thái, định loại mẫu Việc phân loại, định danh mẫu đến mức độ chi loài thực phương pháp hình thái học dựa đặc điểm ký chủ, chất nền, thể, túi bào tử, bào tử túi… sau so sánh dựa tài liệu khóa định loại xuất (Kobayashi, 1982) Chất nền: chất đặc điểm hình thái quan sát mắt thường sử dụng kính hiên vi soi Olympus SZ61 để quan sát ghi nhận đặc điểm: Vị trí xuất vật chủ, hình dạng, màu sắc, kích thước phần vơ tính, hữu tính, vị trí xuất thể (chìm, nửa chìm, nổi,…) Quả thể: thể quan sinh sản hữu tính nấm Cordyceps Bề mặt chứa thể quan sát kính hiển vi soi Olympus SZ61 để xác định hình dạng, kích thước, màu sắc, đặc điểm hình thái bề mặt Các đặc điểm quan sát miêu tả lát cắt ngang kính hiển vi Olympus CX31, hình dạng thể (đối với thể chìm nửa chìm), độ dày thành, cách phân bố thể chất Túi bào tử quan sát ghi nhận kính hiển vi quang học đặc điểm hình dạng, kích thước, màu sắc, thể đỉnh, số lượng bào tử túi, khả bắt màu thuốc nhuộm Melzers, cấu trúc paraphyses Bào tử túi quan sát ghi nhận đặc điểm số lượng, hình dạng, kích thước chuỗi, phân đoạn, màu sắc, bề mặt, khả bắt màu thuốc nhộm Melzer’s Phương pháp sinh học phân tử Tách ADN 300 mg sinh khối nấm cho vào ống Eppendorf chứa 500 µL dung dịch đệm 2XCTAB nghiền nhỏ Hỗn hợp dịch sau nghiền ủ 65 oC thời gian 60 phút; Sau 500 ml hỗn hợp Chloroform: isoamyl alcohol (24:1) bổ sung, trộn đều, ly tâm 13.000 vòng/phút, thu dịch (bước lặp lại lần); Sau 2/3 thể tích Isopropanol (lạnh) bổ sung hỗn hợp để điều kiện (-20 oC) 24 giờ, ly tâm 13000 vòng/phút thời gian 20 phút Kết tủa ADN thu lại rửa với 1ml ethanol 70% cách đảo trộn ly tâm 13.000 vòng/p phút Kết tủa ADN thu lại, để khô tủ hút vô trùng, sau bổ sung 50 µl nước khử ion vô trùng Sản phẩm ADN bảo quản -20 oC để phục vụ cho nghiên cứu (Doyle, 1987) Phản ứng PCR Cặp mồi ITS4 - ITS5, LROR- L7 (Vilgalys & Hester, 1990) Crpb1A- RPB1Cr (Castlebury et al., 2004) sử dụng để khuếch đại trình tự tương ứng ITS đầy đủ; phần LSU vùng gen Rpb1 Thành phần chất cho phản ứng PCR (50 µl) bao gồm: PCR master mix 25 µl, loại mồi 1,5 µl (10 pM), H2O 19 µl ADN µl Các ống PCR đặt máy luân nhiệt với 35 chu kỳ: (1) biến tính 94 oC 40 giây; (2) bắt cặp mồi 48 oC 40 giây; (3) kéo dài đoạn 72 oC PHẦN I NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 211 phút 20 giây; Thời gian kéo dài cuối phút 72 oC Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1% chứa ethidium bromide, 80 V 30 - 40 phút hiển thị đèn cực tím Phân tích trình tự ADN phát sinh phân loại Giải trình tự ADN thực Công ty First Base sử dụng mồi xi mồi ngược phản ứng PCR Sau đó, trình tự xi, ngược dóng hàng cho trình tự thống cách sử dụng phần mềm BioEdit Các trình tự ADN liên quan phân tích lấy từ ngân hàng gen NCBI thơng qua cơng cụ tìm kiếm Blast dóng hàng với trình tự nghiên cứu sử đụng phần mềm ClustalX1.83 Tất trình tự nghiên cứu trình tự ADN cần thiết (Bảng 1) dóng hàng sử dụng để phân tích mối quan hệ phân loại, quan hệ phát sinh chủng loại (Hall, 2011; Thompson et al., 1997) Phân tích xây dựng phát sinh lồi thực dựa phương pháp Neighbor Joining ClustalX1.83; Cây phát sinh loài hiển thị phần mềm Mega KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc điểm hình thái Ký hiệu mẫu V4 nấm ký sinh sâu bướm (bộ Lepidoptera), thu Copia, tọa độ: 21,19345 oN - 103,36546 oE; Độ cao 1450 m; thảm mục rừng tre nứa Chất thể có màu vàng cam, mọc đơn độc ký chủ, có dạng xốp mềm, kích thước 2-5 cm (Hình A, B) Quả thể nửa nửa chìm chất nền, có vỏ mềm, màu vàng cam, kích thước thể 312 x 450 µm, thể có dạng cổ ngắn, hình trứng (Hình B, C) Túi bào tử suốt, kích thước trung bình 1818,59 x µm, hình trụ, trịn, dài, mịn, lớp vỏ, cấu trúc đỉnh túi dày tạo thành hình bán cầu (3,24-3,59 µm), khơng bắt màu với thuốc nhuộm Melzer’s (J-), khơng có cấu trúc paraphyses, (Hình D, E, F) Bào tử túi nằm bó xếp song song túi bào tử Bào tử túi trưởng thành tách khỏi chuỗi thành phần (part-spores) có dạng hình elip hai đầu, kích thước bảo tử túi 4,53-4,59 x 1,03-1,53 µm ( Hình F) Tổng hợp đặc điểm hình thái cho thấy mẫu nấm nghiên cứu thuộc chi Cordyceps số loài có đặc điểm hình thái gần gũi Cordyceps militaris C rosea Đặc điểm túi bào tử bào tử túi cho thấy chủng nấm V4 có nhiều đặc điểm giống với loài nấm Cordyceps militaris Tuy nhiên, nấm Cordyceps militaris có thể dạng dẹt, cong, nằm chìm phần lớn, gần hồn tồn phần chất nền, khác biệt so với mẫu Cordyceps nghiên cứu (Shrestha et al., 2005) Cordyceps rosea có kích thước phần chất bé, có màu hồng Quả thể hình trứng, chìm phần lớn chất nền, bào tử túi hình chữ nhật nên khơng trùng với đặc điểm Cordyceps V4 Như vậy, đặc điểm hình thái cho phép khẳng định mẫu nấm nghiên cứu loài thuộc chi Cordyceps 212 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Hình A Nấm Cordyceps sp V4 mọc ký chủ; B Quả thể bề mặt chất; C Quả thể tiêu kính hiển vi quang học; D, E, F: Túi bào tử bào tử túi nấm Cordyceps V4 Bảng Các trình tự sử dụng để xây dựng phát sinh phân loại vùng gen ITS, nrLSU, Rpb1 TT Tên loài Ký hiệu chủng Đoạn gen ITS nrLSU rpb1 Beauveria bassiana ATCC 20872 KU729042 KU729127 KU933455 C brongniartii NBRC 101394 JN943297 JN941381 JN992350 C gunnii ARSEF 6828 HM140630 HM140633 HM140639 C militaris NBRC 100741 JN943437 JN941386 JN992489 C militaris NBRC 9787 JN943433 JN941384 JN992491 C militaris NBRC 5298 JN943299 JN941383 JN992492 C militaris J1 KC242657 KC242632 KC242729 C militaris OSC 93623 JN049825 AY184966 DQ522377 C pseudomilitaris NBRC 101413 JN943310 JN941396 JN992479 C sp voucher PDD108762 MF574421 MF574422 MF595798 C rosea spat 09-053 MF416637 3.2 Đặc điểm sinh học phân tử Nghiên cứu hình thái kết hợp việc phân tích trình tự cặp mồi ITS 4-5, LROR- L7, Crpb1A- Crp1cr thấy chủng nấm thu có tỉ lệ tương đồng so sánh NCBI với loài Cordyceps militaris 92% (Hình 3) Đối với vùng gen mục tiêu Rpb1 chủng Cordyceps sp có quan hệ gần gũi lồi Cordyceps rosea (Hình 2) Sự sai khác hình thái qua phân tích phát sinh chủng loại sử dụng đơn lẻ vùng gen mục tiêu ITS, nrLSU, Rpb1 kết hợp ba vùng gen cho kết chủng nấm thu thuộc chi Cordyceps, họ Cordycipitaceae (Hình 2, 3) Với kết thu PHẦN I NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 213 nghiên cứu này, thời điểm nhiều khả loài cho khoa học Các nghiên cứu nhằm cung cấp minh chứng cho giả định cần tiếp tục triển khai Hình Kết xây dựng phát sinh lồi dựa vùng gen rpb1 Hình Kết xây dựng phát sinh loài dựa vùng gen ITS-LSU-RPB1 KẾT LUẬN Mẫu nấm ký sinh côn trùng thu tai Khu bảo tồn thiên nhiên Copia xác định ký chủ thuộc Lepidoptera miêu tả hình thái chi tiết, đặc điểm sinh học phân tử 03 đoạn gen ITS, LSU Rpb1 Kết phân tích hình thái trình tự ADN cho phép xác định mẫu nấm nghiên cứu thuộc chi Cordyceps khác biệt với loài chấp nhận Điều chứng tỏ lồi cho khoa học cần nghiên cứu sâu để khẳng định giả thiết Kết nghiên cứu đa dạng nấm Việt Nam lớn cần có nhiều nghiên cứu để mở rộng kho tri thức khoa học nấm học Việt Nam 214 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Tấn Hưng, Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng, Trần Thạnh Phong, Trương Thị Hồng Vân, Somsak Sivichai, 2010 Nấm côn trùng Vườn Quốc gia Cát Tiên; nguồn tài nguyên quý cho ứng dụng sinh học Kỷ yếu Hội nghị khoa học Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Phạm Quang Thu, 2009 Phát nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps gunnii (Berk.) Berk Vườn Quốc gia Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn, (6): 96-99 Phạm Quang Thu, Lê Thị Xuân, Đặng Như Quỳnh, Nguyễn Hoài Thu, 2011 Thành phần loài nấm ký sinh côn trùng Vườn Quốc gia Pù Mát - Nghệ An Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn, 11 (2): 88-94 Trương Xuân Sinh, Nguyễn Thị Thúy, 2013 Đa dạng sinh học nấm ký sinh côn trùng Vườn Quốc gia Pù Mát, tỉnh Nghệ An Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn, 10 (2): 28-35 Castlebury L A., Rossman A Y., Sung G H., Hyten A S., Spatafora J W., 2004 Multigene phylogeny reveals new lineage for Stachybotrys chartarum, the indoor air fungus Mycological Research, 108 (8): 864-872 Choi Y W., Hyde K D., Ho W H., 1999 Single spore isolation of fungi Fungal Diversity, (1): 29-38 Doyle J., 1987 A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochemical Bulletin, 19 (1): 11-15 Hall, T.A., 2011 Bioedit: An important software for molecular biology GERF Bulletin of Biosciences, (1): 60-61 Kobayashi Y., 1982 Keys to the taxa of the genera Cordyceps and Torrubiella Trans Mycol Soc Jpn., 23 (3): 329-364 Schoch C L., Seifert K A., Huhndorf S., Robert V., Spouge J L., Levesque C A., Chen W., 2012 Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (its) region as a universal DNA barcode marker for fungi Proc Natl Acad Sci USA, 109 (16): 6241-6246 Shrestha B., Han S K., Yoon K S., Sung J M., 2005 Morphological characteristics of conidiogenesis in Cordyceps militaris Mycobiology, 33 (2): 69-76 Shrestha B., Hyun M W., Oha J., Han G J., Lee T H., Cho J Y., Kange H., Kim S H., Sunga G H., 2014 Molecular evidence of a teleomorph-anamorph connection between Cordyceps scarabaeicola and Beauveria sungii and its implication for the systematics of Cordyceps sensu stricto Mycoscience, 55 (3): 231-239 Sung, G.H., Hywel J N L., Sung J M., Luangsa-Ard J J., Shrestha B., Spatafora J W., 2007 Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi Stud Mycol, 57 (1): 5-59 Thompson J D., Gibson T J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D G., 1997 The clustal x windows interface: Flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools Nucleic Acids Res, 25 (24): 4876-4882 Vilgalys R., Hester M., 1990 Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species Journal of Bacteriology, 172 (8): 42384246 PHẦN I NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 215 MORPHOLOGICAL AND MOLECULAR CHARACTERISTICS OF Cordyceps sp V4 COLLECTED FROM COPIA NATURAL RESERVE, SON LA PROVINCE Nguyen Dinh Viet1, Trinh Thuy Nga1, Nguyen Thi Thuy Van1,2, Truong Xuan Lam3 and Duong Minh Lam1,* Abstract: Cordyceps is one of the most famous entomopathogenic fungi that belongs to Cordycipitaceae family This genus has been well studied because of its diversity (172 accepted species) and its medicinal values During field trips in Copia natural reserve, Son La province, a beautiful sample of insect fungus grown on an insect host that belonged to Lepidoptera order was collected and named V4 The morphological and DNA sequence analysis showed that the studied fungus belonged to Cordyceps genus with two closely related species of C militaris and C rosea However, the identification resolution of the combination morphology and molecular data was not good enough to confirm it belongs to any known species of the genus The result suggested that this could be a new species of Cordyceps but more studies are needed Keywords: Cordyceps, insect fungi, Copia Son La 1Hanoi National University of Education Police Academy; 3Institute of Ecology and Biological Resources, Vietnam Academy of Science and Techonology *Email: duong.minhlam@gmail.com 2People’s ... thước bảo tử túi 4,5 3-4 ,59 x 1,0 3-1 ,53 µm ( Hình F) Tổng hợp đặc điểm hình thái cho thấy mẫu nấm nghiên cứu thuộc chi Cordyceps số lồi có đặc điểm hình thái gần gũi Cordyceps militaris C rosea Đặc. .. Lepidoptera Mẫu nấm có trạng thái hữu tính, đặc điểm hình thái giống lồi nấm thuộc chi Cordyceps họ Cordycipitaceae Để định loại xác tới lồi mẫu này, nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học phân tử tiến... điểm Cordyceps V4 Như vậy, đặc điểm hình thái cho phép khẳng định mẫu nấm nghiên cứu loài thuộc chi Cordyceps 212 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Hình A Nấm Cordyceps