Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của lá cây giá (excoecaria agallocha l ) và cây đơn lá đỏ (excoecaria cochinchinensis lour ) TT

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Lại Hợp Hiếu NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HỐ HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LÁ CÂY GIÁ (Excoecaria agallocha L.) VÀ CÂY ĐƠN LÁ ĐỎ (Excoecaria cochinchinensis Lour.) Chuyên ngành: Hóa Hữu Mã số: 9.44.01.14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HĨA HỌC Hà Nội – 2021 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Cơng nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS TS Ngô Đại Quang Người hướng dẫn khoa học 2: TS Nguyễn Văn Thanh Phản biện 1: …………………………………………………… Phản biện 2: …………………………………………………… Phản biện 3: …………………………………………………… Luận án bảo vệ hội đồng chấm luận án Tiến sĩ cấp Học viện họp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Vào hồi: ngày tháng năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - Thư viện Quốc gia MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Trải suốt lịch sử nhân loại, nguồn sinh vật biển nguồn thực vật trở thành nguồn nguyên liệu tiềm cho nghiên cứu phát biệt dược phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng Hơn 70% thuốc chống ung thư thị trường có nguồn gốc thiên nhiên tổng hợp theo mẫu hình cấu trúc hợp chất thiên nhiên Song song bệnh ung thư vấn đề đau đầu nhà khoa học, bệnh liên quan đến kháng sinh trước điều trị cách dùng thuốc kháng sinh penicillin, cephalosporin Tuy nhiên, xuất tình trạng lạm dụng thuốc kháng sinh Việt Nam giới, nguyên nhân thường gặp quốc gia khác, cịn có ngun nhân từ thói quen tự chữa trị “bắt chước” đơn thuốc người dân Chính nguyên nhân làm xuất hiện tượng gọi kháng kháng sinh Kháng kháng sinh tình trạng vi sinh vật vi khuẩn, vi rút, nấm ký sinh trùng thay đổi cách thức hoạt động, làm cho thuốc trị bệnh chúng gây trở nên vô hiệu Vai trò quan trọng hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học khẳng định từ y học cổ truyền y học đại Giá trị chúng khơng có cơng dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh mà cịn dùng làm nguyên mẫu cấu trúc dẫn đường cho phát phát triển nhiều dược phẩm Trong việc nỗ lực điều tra, nghiên cứu tìm kiếm nguồn dược liệu phục vụ cho chương trình chăm sóc sức khỏe cộng đồng, việc thực nghiên cứu, tìm kiếm hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên có hoạt tính gây độc tế bào, ức chế phát triển tế bào ung thư, nguồn kháng sinh hệ mới… để ứng dụng phòng ngừa, chữa trị bệnh ung thư, kháng sinh, kháng lao… nhiệm vụ đặc biệt quan trọng nhà khoa học nước quan tâm Bên cạnh nguồn tài nguyên thực vật có mạch đất liền, nguồn tài nguyên sinh vật biển, nguồn tài nguyên thực vật rừng ngập mặn thực vật tham gia ngập mặn trở thành đối tượng thu hút nhiều quan tâm nhà khoa học lĩnh vực y sinh-dược học Nhiệm vụ điều tra, tìm kiếm chất có hoạt tính sinh học loài thực vật thuộc rừng ngập mặn triển khai, nhiều sở nghiên cứu quan tâm theo đuổi nghiên cứu Vì đề tài “Nghiên cứu thành phần hoá học hoạt tính sinh học Giá (Excoecaria agallocha L.) Đơn đỏ (Excoecaria cochinchinensis Lour.)” thực nhằm mục tiêu phát hoạt chất có tiềm từ Giá Đơn đỏ góp phần làm rõ cơng dụng chữa bệnh y học cổ truyền đồng thời làm tăng giá trị khoa học Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu luận án  Phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ Giá (Excoecaria agallocha) Đơn đỏ (E cochinchinensis)  Đánh giá tác dụng gây độc tế bào, hoạt tính kháng viêm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định cặn chiết tổng hợp chất phân lập nhằm tìm kiếm hợp chất có hoạt tính sinh học, làm sở khoa học cho nghiên cứu Các nội dung nghiên cứu luận án  Phân lập hợp chất từ Giá Đơn đỏ phương pháp sắc ký kết hợp Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập phương pháp vật lý, hóa học  Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính kháng viêm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định hợp chất phân lập nhằm tìm kiếm hợp chất có hoạt tính sinh học, làm sở khoa học cho nghiên cứu CHƢƠNG I TỔNG QUAN Những nghiên cứu giới nước thành phần hóa học hoạt tính sinh học Giá (E agallocha) Đơn đỏ (E cochinchinensis) CHƢƠNG II ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1 Đối tƣợng nghiên cứu Hình II.1 Tiêu Giá Hình II.2 Tiêu Đơn đỏ Mẫu thực vật TS Nguyễn Thế Cường (Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam) xác định tên khoa học, tiêu lưu Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật Viện Hóa sinh biển II.2 Phƣơng pháp nghiên cứu II.2.1 Phương pháp ngâm chiết Mẫu thực vật rửa sạch, phơi khơ bóng râm sau xay nhỏ, chiết siêu âm/hoặc ngâm nhiệt độ phòng với methanol Dịch chiết gom lại cô cạn áp suất giảm thu cặn chiết methanol Cặn chiết hoà với nước chiết lỏng lỏng với chloroform thu cặn chiết CHCl3 phần dịch nước II.2.2 Phương pháp phân lập tinh chế hợp chất Việc ngâm chiết, phân lập, tinh chế phần dịch chiết Giá Đơn đỏ thực phương pháp: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột thường (CC) silica gel với cỡ hạt khác nhau, sắc ký cột pha đảo RP-18 sephadex LH-20 II.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học Cấu trúc hợp chất xác định kết hợp thông số vật lý với phương pháp phổ đại: điểm nóng chảy (Mp), độ quay cực ([α]D), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối phun mù điện tử (ESIMS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân: phổ chiều (1H NMR, 13C NMR DEPT) phổ chiều (COSY, HSQC, HMBC NOESY/ROESY) II.2.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học  Hoạt tính gây độc ba dòng tế bào ung thư người: tế bào ung thư vú người (MCF-7), ung thư phổi người (LU-1) ung thư biểu mô người (KB) sử dụng phương pháp MTT SBR  Hoạt tính tính ức chế sản sinh NO tế bào đại thực bào RAW264.7 kích thích LPS  Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định thực dựa phương pháp pha loãng đa nồng độ Tám chủng vi sinh vật kiểm định thử nghiệm là: hai chủng vi khuẩn Gram (–) (Escherichia coli ATCC 25922 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853), hai chủng Gram (+) (Bacillus subtillis ATCC 11774 Staphylococcus aureus ATCC 11632), hai chủng nấm sợi (Aspergillus niger 439 Fusarium oxysporum M42) hai chủng nấm men (Candida albicans ATCC 7754 Saccharomyces cerevisiae SH 20) Chƣơng III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ II.1 Phân lập hợp chất II.1.1 Phân lập hợp chất từ Giá Lá Giá (Excoecaria agallocha, 2,5 kg khô) A: Acetone CC: Cột sắc ký D: Dichloromethane M: Methanol H: n-Hexane W: Nước cất Siêu âm lặp lại 3lần với MeOH 45 phút, nhiệt độ 50-60oC Cặn MeOH (A, 200 g) Bổ sung nước (1L) Bổ sung CHCl3 (1L×3lần) CHCl3/H2O 1:1 Cặn CHCl3 (94 g) Phần H2O Bổ sung EtOAc (1L×3lần) n-Hexane/60% Aq MeOH Cặn n-Hexane (H, 80 g) Lớp H2O (W) Cặn EtOAc (E, g) Cặn MeOH (C, 14 g) n-Hexane, n-Hexane-acetone tăng dần độ phân cực 100:1, 70:1, 0:100 C-1 C-2 (2.6 g) ( 1.1 g) C-3 CC, Silica gel HA 3:1, DA 4:1 C-3A (10.1 g) C-3B RP-18, CC, MW 1:1 C-3C RP-18, CC, MW 1:2 EA-5 EA-3 (5,8 mg) (8 mg) Hình III.1 Sơ đồ phân lập hợp chất từ cặn chiết CHCl3 Giá Cặn EtOAc (E, g) RP-18, CC, H2O-MeOH (2:1) E-1 E-2 E-3 E-4 (0,45 g) (1,5 g) (2,7 g) (2,24 g) Sephadex LH-20, CC MeOH- H2O (1:2) E-2B Silica gel CC, MeOH-CH2Cl2 (1:2) E-2A EA-9 (8,2 mg) Sephadex LH-20 CC, Methanol-H2O (1:1) RP-18 CC, Methanol-H2O (1:2) E-3A E-3B (285 mg) E-3C (78 mg) Sephadex LH-20 CC, Methanol-H2O (1:1) EA-6 EA-7 EA-4 (12 mg) (7 mg) (10,2 mg) Hình III.2 Sơ đồ phân lập hợp chất từ cặn chiết EtOAc Giá Phần nƣớc Diaion HP-20 MeOH-H2O (gradient 0:100, 25:75, 50:50, v/v) W-1 W-4 W-3 W-2 Silica gel CC, CHCl3-MeOH (30:1, 20:1, v/v) W-3C W-3A W-3B YMC RP-C18 CC MeOH-H2O (3:3, v/v) W-3A1 Silica gel CC, n-Hexane-acetone (5:2) W-3D YMC RP-C18 CC Acetone-H2O (1:3,5, v/v) W-3A2 W-3B1 Sephadex LH-20 (MeOH-H2O, 1:2) W-3B2 W-3B3 Sephadex LH-20 (MeOH-H2O, 1:2) EA-8 EA-1 EA-2 (4 mg) (3,5 mg) (5 mg) Hình III.3 Sơ đồ phân lập hợp chất từ dịch chiết nước Giá II.3.2 Phân lập hợp chất từ Đơn đỏ Hình III.4 Sơ đồ phân bố phân đoạn từ cặn MeOH Đơn đỏ Phần nƣớc Diaion HP-20 MeOH-H2O (gradient 0:100, 25:75, 50:50, v/v) W-1 W-3 W-2 Silica gel CC, CHCl3-MeOH (50:1, 25:1, v/v) W-2A W-4 (85 g) Silica gel CC, CHCl3-MeOH (30:1, 20:1, v/v) W-2B W-3A W-3B W-3C W-3D YMC RP-C18 CC Acetone-H2O (1:3,5, v/v) W-3B1 W-3B3 W-3B2 Sephadex LH-20 (MeOH-H2O, 1:2) EC-6 EC-2 (3 mg) (8 mg) Silica gel CC, n-Hexane-acetone (5:2); Sephadex LH-20, MeOH-H2O (1:1) EC-11 EC-10 EC-9 EC-8 (2,7 mg) (6,6 mg) (3 mg) (3 mg) Silica gel CC, CH2Cl2-MeOH-H2O (5:1:0,1); YMC RP-C18, MeOH-H2O (1:1) EC-5 EC-4 EC-3 EC-1 (5,5 mg) (2 mg) (2 mg) (2,2 mg) Silica gel CC, CH2Cl2-MeOH-H2O (6:1:0,05); Sephadex LH-20, MeOH-H2O (1:1) EC-13 EC-12 EC-7 (20 mg) (21 mg) (3 mg) Hình III.5 Sơ đồ phân lập hợp chất từ phần nước Đơn đỏ III.1.3 Thông số vật lý kiện phổ hợp chất Phần trình bày thơng số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập từ Giá Đơn đỏ III.2 Kết thử hoạt tính hợp chất phân lập đƣợc III.2.1 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư Giá Bảng III.1 Kết sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào cặn chiết MeOH Giá Mẫu Cặn chiết MeOH Đối chứng dương (Ellipticine 10 µg/mL) Dịng tế bào thử nghiệm LU-1 MCF7 IC50 % ức IC50 % ức IC50 (µg/mL) (µg/mL) (µg/mL) chế chế 19,77 85,03 15,23 65,38 57,57 KB % ức chế 81,90 97,18 0,39 96,35 0,50 95,73 0,48 Kết sàng lọc cặn chiết MeOH cho thấy cặn chiết MeOH Giá có khả ức chế lớn 50% phát triển tế bào sống ba dòng tế bào ung thủ thử nghiệm KB, LU-1 MCF7 Chất đối chứng dương ellipticine hoạt động ổn định thí nghiệm Các kết xác với r2 ≥ 0,99 III.2.2 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Giá Kết sàng lọc cặn chiết MeOH Giá cho thấy có hoạt tính kháng VSVKĐ vi khuẩn Gram dương B subtillis (MIC = 200 µg/mL) Các hợp chất phân lập được thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tám chủng vi khuẩn bao gồm hai chủng vi khuẩn Gram (–): E coli, P aeruginosa, hai chủng vi khuẩn Gram (+): B subtillis, S aureus, hai chủng vi khuẩn nấm mốc: A niger, F oxysporum, hai chủng vi khuẩn nấm men: S cerevisiae C albicans Hợp chất blumenol A (EA-6) thể hoạt tính kháng VSVKĐ chủng F oxysporum (MIC = 50 µg/mL) Bảng III.3 Kết sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định hợp chất cặn chiết từ Giá Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (g/mL) Ký hiệu mẫu Streptomycin (57,5 g/mL) Nystatin (92,5 g/mL) Tetracyclin (44 g/mL) EA-1 EA-2 EA-3 EA-4 EA-5 EA-6 EA-7 EA-8 EA-9 Cặn chiết MeOH Gram (-) Gram (+) Nấm mốc Nấm men Ec* Pa* Bc* Sa* An* Fo* Sc* Ca* - - 7.188 14.375 - - - - - - - - 23.125 11.563 5.781 11.563 5.5 11 - - - - - - >50 >50 >50 - >50 >50 - - >50 >50 >50 50 - >50 >50 - - - 200 - - - - - Nồng độ mẫu đầu tương đương với 0,1 mM; Streptomycin, nystatin tetracyclin sử dụng kháng sinh chuẩn *Ec (Escherichia coli), Pa (Pseudomonas aeruginosa), Bc (Bacillus subtillis), Sa (Staphylococcus aureus), An (Aspergillus niger), Fo (Fusarium oxysporum), Sc (Saccharomyces cerevisiae) Ca (Candida albicans) (-) Không xác định # III.2.3 Kết thử hoạt tính kháng viêm Đơn đỏ Bảng III.4 Kết sàng lọc hoạt tính ức chế trình sản sinh nitric oxide (NO) đại tế bào RAW264.7 hợp chất Hợp chất Nồng độ (µM) Ức chế (%) Tế bào sống (%) EC-1 38,72 ± 0,56 76,12 ± 1,36 EC-2 46,78 ± 0,35 78,89 ±1,32 EC-3 75,83 ± 0,77 86,65 ±1,54 EC-4 31,09 ± 1,60 56,49 ±0,97 EC-5 42,02 ± 1,01 75,51 ±1,52 EC-6 68,18 ± 0,67 73,59 ±0,67 39,22 ± 1,07 78,60 ±2,18 EC-8 94,96 ± 0,26 80,41 ±1,66 EC-9 82,91 ± 1,03 83,19 ±2,37 EC-10 27,87 ± 0,81 84,55 ±0,98 EC-11 30,47 ± 0,69 82,91 ±1,43 EC-12 38,38 ± 0,19 70,16 ±1,77 EC-13 Đối chứng dương (Cardamonin) 35,01 ± 0,76 55,50 ±2,54 0,3 33,89 ± 0,51 95,35 ±0,75 88,80 ± 0,51 86,00 ±1,55 EC-7 100 Cardamonin sử dụng chất chuẩn chứng Các thí nghiệm lặp lại lần Bảng II.5 Kết IC50 hợp chất thể hoạt tính Hợp chất EC-3 EC-6 EC-8 EC-9 Đối chứng dương (Cardamonin) Giá trị IC50 (µM) 13,80 ± 1,23 58,10 ± 2,04 6,17 ± 0,25 12,02 ± 0,73 1,57 ± 0,24 Cardamonin sử dụng làm chất chuẩn dương Các thí nghiệm lặp lại lần 11 Hình IV.6 Phổ HMBC hợp chất EA-1 Hình IV.7 Phổ COSY hợp chất EA-1 Phân tích chi tiết tương tác phổ HSQC, HMBC COSY cho thấy hợp chất EA-1 có cấu trúc phẳng tương tự hợp chất agallochin I (trước phân lập từ này), ngoại trừ có mặt thêm tín hiệu nhóm hydroxy vị trí C-17 Các tương tác xa HMBC δH 3,40/3,45 (H-17) với δC 28,0 (C-12), 51,1 (C-13), 56,6 (C-14) 135,2 (C16) cho thấy nhóm OH liên kết với C-17, tương tác hai chiều phổ COSY proton H-18/H-4/H-5/H6/H-7 lần khẳng định nhóm methyl liên kết với C-4 nhóm hydroxy liên kết với C-6 Ngồi ra, dịch chuyển hóa học phía trường yếu carbon hemiketal δC 98,69 (C-3) kết hợp với tương tác HMBC δH 3,80/3,89 (H20) với δC 32,7 (C-1), 98,6 (C-3), 57,9 (C-5) 37,5 (C-10) cho phép khẳng định liên kết cầu eter C-20 với C-3 nhóm hydroxy cịn lại phân tử liên kết C-3 (Hình IV.5-IV.6) 12 Bảng IV.1 Số liệu phổ NMR (δ ppm) EA-1 hợp chất tham khảo δCa,b [35] δCc,d 31,2 32,7 26,9 28,2 98,3 41,5 98,6 42,7 1,96 (1H, m) 56,9 57,9 1,03 (1H, dd, 5,0, 11,0) 69,5 71,1 3,75 (1H, ddd, 4,0, 11,0, 11,5) 44,7 46,2 1,43 (1H, dd, 11,5, 13,0) 1,85 (1H, dd, 4,0, 13,0) 49,4 44,5 50,2 46,4 1,20 (1H, dd, 4,5, 12,5) 10 11 12 36,3 20,7 31,9 37,5 21,4 28,0 1,08 (1H, m)/1,72 (1H, m) 1,28 (1H, m)/1,36 (1H, m) 13 14 43,7 60,4 51,1 56,6 1,09 (1H, m) 1,67 (1H, dd, 2,5, 9,5) 15 133,3 135,5 5,73 (1H, d, 6,0) 16 137,9 135,2 5,66 (1H, d, 6,0) 17 24,4 68,6 18 20 19,3 68,5 19,6 69,4 3,40 (1H, d, 11,0) 3,45 (1H, d, 11,0) 1,12 (3H, d, 7,0) 3,80 (1H, dd, 5,0, 9,5) 3,89 (1H, dd, 3,5, 9,5) Vị trí # δCc,e (dạng pic, J = Hz) 1,27 (1H, m) 2,09 (1H, ddd, 3,5, 12,5, 12,5) 1,71 (1H, m) 2,02 (1H, ddd, 3,5, 12,0, 13,5) HMBC NOESY 5, 10 20a 2, 3, 5, 6, 18 1, 4, 6, 10, 18, 19 5, 6, 8, 9, 14, 15 1, 5, 8, 10, 14, 15, 19 8, 9, 13 9, 11, 13, 14, 16 7, 8, 9, 12, 13, 15, 16, 17 8, 13, 14, 16 15, 14, 13, 12, 13, 14, 16 3, 4, 1, 3, 5, 10 18, 20a 7a, 4, 7b, 15, 20b 5, 6, 9, 14a, 14b 5, 7a 20a 7a, 7b 17 6, 16, 20b 15 14b 2b 1b, 2a, 6, 11a, 15 a Đo CDCl3, b75MHz; cđo CD3OD, d125MHz, e500MHz #δC số liệu phổ agallochin I tham khảo tài liệu sơ [35] Cấu hình tương đối hợp chất EA-1 xác định dựa vào giá trị số tương tác (JH-H) tương tác phổ NOESY Các vị trí H5, H-6, H-7a H-9 xác định axial giá trị JH-H lớn (J = 11,0 - 13 Hình IV.8 Các tương tác NOESY hợp chất EA-1 Hình IV.9 Phổ NOESY hợp chất EA-1 12,5 Hz) Thêm nữa, tương tác NOESY proton H-5/H-9, H-1a, H7a; H-7a/H-14a, H-9; H-20b/H-15; H-15/H-16 H-20a/H-11a, H-1b, H-2a xác nhận cấu hình khung beyer-15-ene diterpenoid Cuối cùng, tương tác H-6/H-20b, H-15, H-4 H3-18/H-2b cho phép khẳng định cấu hình β H-6 H-4 (Hình IV.8-IV.9) Từ phân tích phổ nêu trên, hợp chất EA-1 xác định 3β,20-epoxy-3,6α,17-trihydroxy-19-nor-beyer15-ene, chất hợp chất dạng 19-nor-beyerene diterpenoid phân lập từ E agallocha đặt tên excoecarin L Chi tiết xác định cấu trúc hợp chất cịn lại Luận án tóm tắt Hình IV.26 đây: 14 Hình IV.26 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ Giá IV.2 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập đƣợc từ Đơn đỏ IV.2.1 Hợp chất 6α,7α-epoxy-4β,5β,9α,13α-tetrahydroxy-rhamnofola-1,15dien-3-one 20-O-β-D-glucopyranoside (EC-1, Chất mới) Hợp chất EC-1 phân lập có dạng bột, màu trắng Phổ HRESI-MS cho pic ion giả phân tử [M - H]- m/z 541,2297 (tính tốn theo lý thuyết C26H37O12-, 541,2291), 577,2063 [M + Cl]- (tính tốn theo lý thuyết C26H38ClO12-, 577,2057) 587,2346 [M + HCOO]- (tính tốn theo lý thuyết C27H39O14-, 587,2345), phù hợp với cơng thức phân tử C26H38O12 (Hình IV.28) Hình IV.27 Cấu trúc EC-1 hợp chất tham khảo 15 Hình IV.28 Phổ HR-ESI-MS hợp chất EC-1 Hình IV.29 Phổ 1H NMR hợp chất EC-1 Hình IV.30 Phổ 13C NMR hợp chất EC-1 Phổ 13C NMR phổ HSQC cho tín hiệu cộng hưởng 26 carbon, bao gồm sáu carbon khơng liên kết với hydro, 13 nhóm methine, bốn nhóm methylene ba nhóm methyl Phân tích độ chuyển dịch hóa học tín hiệu cho phép nhận dạng nhóm carbonyl [δC 209,9 (C-3)], bốn carbon olefin [δC 163,0 (C-1), 134,7 (C-2), 145,9 (C-15) 117,2 (C-16)], sáu carbon thuộc gốc đường glucose [δC 104,8 (carbon anome, H-1'), 75,2 (C-2'), 78,0 (C-3'), 71,6 (C-4'), 78,0 (C-5') 62,8 (C-6')], ba carbon không 16 mang hydro liên kết với oxy [δC 74,7 (C-4), 64,6 (C-6) 77,3 (C-9)], ba nhóm oxymethine [δC 68,1 (C-5) 62,3 (C-7) 71,4 (C-13)], với nhóm oxymethylen [δC 74,2 (C-20)] Phổ 1H NMR cho tín hiệu hai nhóm methyl [δH 1,70 (3H, s, H-17) 1,76 (3H, d, J = 2,0 Hz, H-19)], nhóm methyl bậc hai [δH 0,96 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-18)], proton olefin thuộc liên kết đôi ba vị trí [δH 7,66 (1H, br s, H-1)], hai proton olefin khác thuộc liên kết đôi dạng >C=CH2 [δH 4,98 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-16a)/5,04 (1H, br s, H-16b), proton anome gốc đường glucose có cấu hình β [δH 4,33 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1') tín hiệu nhóm oxymethine/oxymethylene vùng dịch chuyển hóa học từ δH 3,20 – 4,20 ppm (Hình IV.28-IV.29) Hình IV.31 Các tương tác COSY, HMBC NOESY EC-1 Hình IV.31 Phổ HSQC hợp chất EC-1 Hình IV.32 Phổ HMBC hợp chất EC-1 17 Hình III.33 Phổ COSY hợp chất EC-1 Hình III.34 Phổ NOESY hợp chất EC-1 Phân tích chi tiết phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều HSQC, COSY, HMBC cho thấy cấu trúc phần aglycon EC-1 có nhiều vị trí tương đồng với hợp chất venenatin (EC-2) phân lập từ Đơn đỏ (E cochinchinensis), ngoại trừ khác vị trí C-13 C-14 (Bảng IV.9) Ở hợp chất EC-2, vị trí C-13 carbon khơng liên kết với hydro có hai nhóm hydroxy isopropenyl, vị trí C-14 có nhóm hydroxy, cịn hợp chất EC-1 vị trí C-13 có nhóm hydroxy vị trí C-14 có nhóm isopropenyl Hơn nữa, tương tác COSY proton H-7/H-8/H14/H-13/H-12/H-11/H-8 tương tác HMBC H-17 với C-14, C-15, C-16, H-16 với C-14, C-15, C-17, H-8 với C-9, C-11, C-13, C-14, C-15 khẳng định nhận định cấu trúc vòng C Gốc đường glucose liên kết với aglycon vị trí C-20 nhờ tương tác HMBC H-1' với C-20 H-20 với C-1' Ngoài ra, tương tác COSY HMBC khác hình khẳng định cấu trúc phẳng vòng A B phân tử EC-1 Với cấu hình phẳng xác định cho thấy EC-1 diterpenoid dạng khung rhamnofolane hợp chất EC-2 thuộc dạng khung daphnane Trong thực tế ba dạng khung rhamnofolane, daphnane, tigliane có cấu trúc ba vịng A, B C tương tự dạng [5-7-6] tricyclic khác vị trí nhóm isopropyl 18 Bảng IV.9 Số liệu phổ NMR (δ ppm) EC-1 hợp chất tham khảo Vị trí Venenatin [106] 162,2 163,0 δHa,c (dạng pic, J = Hz) 7,66 (1H, br s) 135,5 209,9 74,6 70,5 64,0 134,7 209,9 74,7 68,1 64,6 4,30 (1H, br s) - 65,4 62,3 3,19 (1H, br s) 39,1 40,0 3,10 (1H, br d, 12,5) 10 11 12 79,8 51,0 39,5 39,1 77,3 51,5 39,4 41,1 4,15 (1H, dd, 2,5, 3,0) 2,10 (1H, m) 1,60 (1H, m) 1,73 (1H, m) 13 75,4 71,4 3,52 (1H, m) 14 79,4 54,2 15 16 147,2 114,7 145,9 117,2 17 19,3 18,9 1,70 (3H, s) 18 19 20 18,3 9,9 65,0 18,9 9,9 74,2 1' 2' 3' 4' 5' 6' - 104,8 75,2 78,0 71,7 78,0 62,8 0,96 (3H, d, 7,0) 9, 11, 12 1,76 (3H, d, 2,0) 1, 2, 3,45 (1H, d, 11,0) 5, 6, 7, 1' 4,27 (1H, d, 11,0) 4,33 (1H, d, 7,5) 20 3,20 (1H, *) 1' 3,36 (1H, *) 4' 3,27 (1H, *) 3' 3,26 (1H, m) 3,64 (1H, dd, 5,5, 5' 12,0) 3,86 (1H, dd, 1,0, 12,0) δCa,b HMBC COSY NOESY 2, 3, 4, 10, 19 10 10, 18 3, 6, 7, 20 6, 8, 9, 14, 20 6, 7, 9, 11, 13, 14, 15 9, 11, 13, 14, 18 15 2,80 (1H, dd, 10,0, 8, 13, 15, 12,5) 16, 17 4,98 (1H, d, 2,0) 15, 17 5,04 (1H, br s) 10 7, 14 8, 17, 20a 7, 11, 13 17 18, 12 11, 13 1, 8, 12a 11, 13 12, 14 8, 12a, 17 8, 13 16a 14, 17 14, 15, 16 11 7, 8, 13, 16b 2' 1', 3' 2', 4' 3', 5' 4', 6' 5' a Đo CD3OD, b125 MHz, c500 MHz *Tín hiệu chập pic Tham khảo số liệu phổ 13C NMR venenatin theo tài liệu số [106] 19 Cấu hình β nhóm OH-4 H-8, cấu hình α H-10 OH-9 hợp chất EC-1 xác định nhờ phù hợp độ chuyển dịch hóa học vị trí C-4, C-8, C-9, C-10 H-10 hợp chất EC-1 EC-2 Các tương tác NOESY H-10 với H-5, H-8 với H-7, H-11, H13, H-17, H-7 với H-20, H-17 với H-16b, H-16a với H-14, H-18 với H-1 khẳng định cấu hình tương đối vị trí C-6, C-7, C-11, C-13 C-14 hợp chất EC-1 Chi tiết xác định cấu trúc 12 hợp chất lại Luận án tóm tắt Hình IV.53 đây: Hình IV.53 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ Đơn đỏ 20 Hình IV.53 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ Đơn đỏ (tiếp) IV.3 Hoạt tính sinh học hợp chất phân lập IV.3.1 Tác dụng gây độc dòng tế bào ung thư cặn chiết hợp chất phân lập từ Giá Kết sàng lọc cặn chiết MeOH cho thấy cặn chiết MeOH Giá có khả ức chế >50% phát triển tế bào sống dòng tế bào ung thư thử nghiệm dòng tế bào ung thư phổi người (LU), ung thư biểu mô người (KB) ung thư vú người (MCF7) Chất đối chứng dương ellipticine hoạt động ổn định thí nghiệm Các kết xác với r2 ≥ 0,99 (Bảng III.1) Tuy nhiên, hợp chất phân lập thể yếu hoạt tính dịng tế bào thử nghiệm (IC50 > 100 µM) Những kết hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu gần liên quan đến khả ức chế tế bào ung thư hợp chất Với hợp chất aquillochin (EA-3) (+)-isolariciresinol (EA-4) đánh giá khả gây độc tế bào số dòng tế bào ung thư KB, SK-LU-1, MCF-7, HepG2, SW-480, PC-3, HT-29, A549, MDA-MB231, KB-VIN HCT-116, SGC-7901 Các kết cho thấy, mức độ ức chế hai hợp chất EA-3 EA-4 dòng ung thư thử nghiệm đạt mức độ yếu hoạt tính Blumenol A (EA-6) nhà khoa học Trung Quốc đánh giá khả ức chế hai dòng tế bào ung thư HepG2 SMMC-7721 Tuy nhiên, EA-6 khơng có tác dụng ức chế rõ ràng hai dòng tế bào thử nghiệm Sử dụng phương pháp thực nghiệm MTT, khả gây độc dòng tế bào ung thư HeLa, HGC-27, HT-29, HCT-8 BGC-823 hợp chất blumenol B (EA-7) thể mức độ yếu qua thử nghiệm S.D Xue cộng Ngoài khả chống oxi hóa tốt EA-8, hợp chất khơng chất thúc đẩy mạnh mẽ trình tự chết tế bào ung thư A549 MCF-7, 21 mà cịn ngăn ngừa tổn thương DNA, thúc đẩy biến đổi thành tế bào ung thư gây ROS tế bào thường HEK293 Venenatin (EC-2), thể tác dụng ức chế tăng sinh dòng tế bào bạch cầu người (HL60, IC50 = 28,1 μM) Khả kháng virus HIV-1 EC-2 đánh giá cách thử nghiệm ức chế tế bào HIV-1 (EC50) độc tính dòng tế bào C8166 (phương pháp MTT) Tuy nhiên, kết cho thấy khả ức chế virus EC-2 khơng đáng kể Khả kháng lại dịng tế bào ung thư A549 (IC50 = 32,5 μM) HL-60 (IC50 = 41,8 μM) syringin (EC-8) mức độ vừa phải, làm giảm đáng kể khối u chuột S180 thực nghiệm Cuối phải kể đến hợp chất EC-13 nhóm nghiên cứu Ning-Hua Tan cộng thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ba dòng tế bào ung thư BGC-823, Hela A549 Tuy nhiên, kết không cho thấy khả gây độc tế bào ba dòng tế bào ung thư thử nghiệm III.3.2 Tác dụng kháng vi sinh vật kiểm định Giá Kết sàng lọc cặn chiết MeOH Giá cho thấy có hoạt tính kháng VSVKĐ vi khuẩn Gram dương B subtillis (MIC = 200 µg/mL) Các hợp chất phân lập được thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tám chủng vi khuẩn bao gồm hai chủng vi khuẩn Gram (-): E coli, P aeruginosa, hai chủng vi khuẩn Gram (+): B subtillis, S aureus, hai chủng vi khuẩn nấm mốc: A niger, F oxysporum, hai chủng vi khuẩn nấm men: S cerevisiae C albicans Hợp chất blumenol A (EA-5) thể hoạt tính kháng VSVKĐ chủng F oxysporum (MIC = 50 µg/mL) (Bảng III.3) Trước đó, hợp chất EC-13 Gabriela Mazzanti đánh giá kháng VSVKĐ chủng Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella thyphimurium Candida albicans Tuy nhiên, kết cho thấy hợp chất khả kháng VSVKĐ chủng thử nghiệm Kết nghiên cứu phần giải thích cơng dụng dân gian sử dụng để chữa tiêu chảy, kiết lỵ người Đây nghiên cứu liên quan đến hoạt tính kháng VSVKĐ Giá hợp chất phân lập từ thực đến IV.3.3 Tác dụng kháng viêm hợp chất phân lập từ Đơn đỏ Quá trình sản sinh NO phản ứng tự bảo vệ thể nhiên sản sinh mức lượng NO cho nguyên nhân dẫn đến tổn thương tế bào mơ, thúc đẩy q trình viêm gây bệnh viêm cấp mãn tính Do mức độ sản sinh NO phản ánh mức độ gây viêm coi yếu tố thị cho trình viêm xảy Các hợp chất ức chế trình sản sinh NO coi 22 tác nhân chống viêm Kết đánh giá hoạt tính kháng viêm thông qua ức chế sản sinh NO tế bào RAW264.7 kích thích LPS 13 hợp chất (EC-1 – EC-13) phân lập từ Đơn đỏ (E cochinchinensis) (Bảng II.3-II.4) cho thấy nồng độ 100 µM, hợp chất EC-3, EC-8 EC-9 gây suy giảm đáng kể sản sinh NO tế bào RAW264.7 kích thích LPS (tỷ lệ ức chế > 50%), hợp chất lại có hoạt tính trung bình (tỷ lệ ức chế < 50%) Hoạt tính ức chế sản sinh NO theo nồng độ (100 µM) ba hợp chất EC-3, EC-8 EC-9 cho thấy, hợp chất gây ức chế trình sản sinh NO tế bào RAW264.7 mạnh với giá trị IC50 13,80 ± 1,23, 6,17 ± 0,25 12,02 ± 0,73 µM, so với chất đối chứng dương cardamonin (IC50 = 1,57 ± 0,24 µM) Ở nồng độ 100 µM, hợp chất EC-6 biểu hoạt tính ức chế trình sản sinh NO mức độ trung bình Về tác dụng chống viêm, kaempferol (EA-8) thử nghiệm in vitro ức chế COX-1 COX-2 ức chế trình sản sinh NO LPS gây đại tế bào J774 RAW264.7 Các nghiên cứu EA-9 có tác dụng kháng viêm với tác dụng tiềm chống lại bệnh viêm khớp (làm giảm rõ rệt độ dày khớp gối) kháng lại cytokine trung gian gây viêm liên quan đến viêm khớp CXCL-1/KC, IL-6, TNF-α, IL-1β, LTB4 PGE2 Hơn nữa, EA-9 giúp giảm dần biệt hóa tế bào hủy xương phụ thuộc RANKL sinh tế bào xương, bao gồm cấu trúc F-actin khả phục hồi xương Thêm vào đó, tác động mạnh mẽ glochionionol A (EC-3) biệt hóa tế bào loãng xương đại thực bào RAW264.7 báo cáo Trong hợp chất EC-12 (IC50 = 29,23 µM) cho thấy khả kháng viêm cytokine IL-12 p40 mức độ vừa phải so sánh với chất đối chứng dương sử dụng SB203580 (IC50 = 5,00 µM) Hợp chất EC-13 thể khả ức chế trình sản sinh NO với giá trị IC50 = 45,6 µM so sánh với chất đối chứng L-NMMA (IC50 = 25,2 µM) Các đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa DPPH hai hợp chất EC-12 EC-13 thể mức độ yếu (4%) khơng quan sát hoạt tính Các kết đánh giá khả ức chế trình sản sinh NO hợp chất tinh chế từ từ Đơn đỏ lần khẳng định có tương đồng cao với kết cơng bố liên quan đến nhóm hoạt chất cơng bố trước đó, đặc biệt từ chi Excoecaria Từ góp phần làm rõ công dụng chữa bệnh y học cổ truyền đồng thời làm tăng giá trị khoa học nước ta 23 KẾT LUẬN Về nghiên cứu thành phần hóa học Từ phần hai Giá (Excoecaria agallocha L.) Đơn đỏ (E cochinchinensis Lour.) phân lập xác định cấu trúc 22 hợp chất Trong đó, bốn hợp chất excoecarin L (EA-1), excoecarin O (EA-2), 6α,7αepoxy-4β,5β,9α,13α-tetrahydroxy-rhamnofola-1,15-dien-3-one 20-O-β-Dglucopyranoside (EC-1) acid 3-(2-O-β-D-glucopyranosyl-3hydroxyphenyl) propanoic (EC-9) lần phân lập xác định - Từ Giá (E agallocha) phân lập xác định cấu trúc hợp chất Trong đó, có hai hợp chất excoecarin L (EA-1) excoecarin O (EA-2), với bảy hợp chất biết khác aquillochin (EA3), (+)-isolariciresinol (EA-4), (+)-epipinoresinol (EA-5), blumenol A (EA6), blumenol B (EA-7), kaempferol (EA-8) methyl gallate (EA-9) - Từ Đơn đỏ (E cochinchinensis) phân lập xác định cấu trúc 13 hợp chất Trong đó, có hai hợp chất 6α,7α-epoxy4β,5β,9α,13α-tetrahydroxy-rhamnofola-1,15-dien-3-one 20-O-β-Dglucopyranoside (EC-1) acid 3-(2-O-β-D-glucopyranosyl-3hydroxyphenyl) propanoic (EC-9), với mười hợp chất biết khác venenatin (EC-2), glochionionol A (EC-3), (6R,9S)-roseoside (EC-4), isofraxoside (EC-5), pinoresinol-4'-O-β-D-glucoside (EC-6), liriodendrin (EC-7), rhamnocitrin 3-glucoside (EC-8), sinapyl alcohol 4-O-β-Dglucopyranoside (EC-10), 2,3-dihydroxypropyl-benzoate 3-O-α-(4''methoxyglucuronide) (EC-11), phenethyl rutinoside (EC-12) benzyl-O-αL-rhamnopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranoside (EC-13) Về nghiên cứu hoạt tính sinh học - Đã sàng lọc cặn chiết MeOH Giá cho thấy cặn chiết có khả ức chế lớn 50% phát triển tế bào sống ba dòng tế bào ung thư thử nghiệm KB, LU-1 MCF7 Mặc dù hợp chất phân lập chưa thể rõ ràng độ chọn lọc ba dòng tế bào ung thư thử nghiệm, nhiên, kết thu góp phần hoạt tính chưa xác định từ cặn chiết MeOH - Kết sàng lọc hoạt tính kháng VSVKĐ cặn chiết MeOH Giá cho thấy thể chủng vi khuẩn Gram dương B subtillis (với giá trị MIC = 200 µg/mL) Hợp chất blumenol A (EA-6) thể hoạt tính kháng VSVKĐ chủng Fusarium oxysporum với giá trị MIC = 50 µg/mL Đây lần kết nghiên cứu liên quan đến hoạt tính kháng VSVKĐ hợp chất phân lập từ Giá báo cáo 24 - Đã nghiên cứu hoạt tính kháng viêm in vitro thơng qua ức chế trình sản sinh NO tế bào RAW264.7 mười ba hợp chất (EC-1 – EC-13) phân lập từ E cochinchinensis Kết cho thấy ba hợp chất EC-3, EC-8 EC-9 thể hoạt tính tốt với giá trị IC50 13,80 ± 1,23, 6,17 ± 0,25 12,02 ± 0,73 µM KIẾN NGHỊ Từ kết nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học phần hai E agallocha E cochinchinensis tác giả nhận thấy: Hợp chất EC-8 có hoạt tính kháng viêm tốt ức chế trình sản sinh NO tế bào RAW264.7 kích thích LPS Vì vậy, cần nghiên cứu thêm sâu thí nghiệm kháng viêm hợp chất để định hướng cho thực nghiệm in vivo Ngoài ra, sở chất phân lập từ Giá Đơn đỏ, tiếp tục đánh giá thử nghiệm hoạt tính khác nhằm tìm hoạt chất tiềm NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Từ hai Giá (Excoecaria agallocha L.) Đơn đỏ (E cochinchinensis Lour.) phân lập xác định cấu trúc 04 hợp chất, bao gồm: - Từ Giá (E agallocha) phân lập xác định cấu trúc hợp chất Trong đó, có hai hợp chất excoecarin L (EA-1) excoecarin O (EA-2) - Từ Đơn đỏ (E cochinchinensis) phân lập xác định cấu trúc 13 hợp chất Trong đó, có hai hợp chất 6α,7α-epoxy4β,5β,9α,13α-tetrahydroxy-rhamnofola-1,15-dien-3-one 20-O-β-Dglucopyranoside (EC-1) 2-hydroxyphenyl 3-O-β-D-glucopyranosylpropynic acid (EC-9) - Kết sàng lọc hoạt tính kháng VSVKĐ cặn chiết MeOH Giá cho thấy thể chủng vi khuẩn Gram dương B subtillis ( với giá trị MIC = 200 µg/mL) Hợp chất blumenol A (EA-6) có hoạt tính kháng VSVKĐ chủng F oxysporum với giá trị MIC = 50 µg/mL - Đã nghiên cứu hoạt tính kháng viêm thơng qua ức chế trình sản sinh NO tế bào RAW264.7 mười ba hợp chất (EC-1 – EC-13) phân lập từ E cochinchinensis Kết cho thấy ba hợp chất EC-3, EC-8 EC-9 thể hoạt tính tốt với giá trị IC50 13,80 ± 1,23, 6,17 ± 0,25 12,02 ± 0,73 µM, so với chất đối chứng dương cardamonin (IC50 = 1,57 ± 0,24 µM) 25 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyen Van Thanh, Lai Hop Hieu, Phan Thi Thanh Huong, Le Thi Vien, Tran My Linh, Nguyen The Cuong, Nguyen Xuan Cuong, Nguyen Hoai Nam, Ngo Dai Quang, Chau Van Minh Excoecarins L and O from the mangrove plant Excoecaria agallocha L Phytochemistry Letters, 25, 52-55, 2018 Lai Hop Hieu, Nguyen Phuong Thao, Nguyen Van Thanh, Do Hoang Anh, Tran Thi Hong Hanh, Nguyen Duy Cong, Nguyen The Cuong, Nguyen Van Thanh, Nguyen Xuan Cuong, Nguyen Hoai Nam, Ngo Dai Quang, and Chau Van Minh Metabolites of Excoecaria cochinchinensis Lour Phytochemistry Letters, 37, 116-120, 2020 ... phân l? ??p nhằm tìm kiếm hợp chất có hoạt tính sinh học, l? ?m sở khoa học cho nghiên cứu CHƢƠNG I TỔNG QUAN Những nghiên cứu giới nước thành phần hóa học hoạt tính sinh học Giá (E agallocha) Đơn đỏ. .. phần l? ?m rõ công dụng chữa bệnh y học cổ truyền đồng thời l? ?m tăng giá trị khoa học nước ta 23 KẾT LUẬN Về nghiên cứu thành phần hóa học Từ phần hai Giá (Excoecaria agallocha L. ) Đơn đỏ (E cochinchinensis. .. (EA- 1) excoecarin O (EA- 2), với bảy hợp chất biết khác aquillochin (EA 3), ( +)- isolariciresinol (EA- 4), ( +)- epipinoresinol (EA- 5), blumenol A (EA 6), blumenol B (EA- 7), kaempferol (EA- 8) methyl gallate