BÁO CÁO THỰC HÀNH PHÂN TÍCH SẮC KÝ

GVGD: ThS Trần Nguyễn An Sa Lớp Học tên SV Mã Tuyết Huê Nhóm: MSSV: 2004180112 Nguyễn Thị Trang 2004180029 BÁO CÁO THỰC HÀNH PHÂN TÍCH SẮC KÝ BÀI 1: SẮC KÝ BẢN MỎNG Cơ sở lý thuyết phương pháp SKBM (TLC) (2,5đ) Pha tĩnh: Trong kỹ thuật TLC, pha tĩnh thường tráng thành lớp mỏng lên mộ thủy tinh nhơm nhựa có kích thước tùy chọn Các thủy tinh trơ mặt hóa học, chịu nhiệt tốt, rửa dễ dàng, sử dụng lại dễ vỡ khó cắt Các nhơm nhựa cắt kéo, nhơm khơng chịu vết axit oxy hóa mạnh, nhựa khơng chịu nhiệt độ cao Các TLC kỹ thuật TLc chuẩn bị phịng thí nghiệm, nhiên chúng mua nhiều Khi lựa chọn pha tĩnh nên lưu ý đến tính chất mẫu Silicagel sử dụng riêng cho axit amin hydrocacbon Cũng cần lưu ý silicagel có tính axit Do đó, chất phân tích mang tính bazơ khơng bền với axit phân tách TLC phủ silicagel cho kết Điều với TLC phủ alumina dung dịch axit Lưu ý có khác biệt silicagel alumina Alumina có tính bazơ không phân tsch mẫu cỡ lớn silicagel đó, sử dụng TLC phủ alumina cần lưu ý đến tính chất chất nhóm hợp chất nhiều Việc lưu ý tránh phân hủy mẫu Bảng 1: Pha tĩnh đối tượng mẫu phân tích Pha tĩnh Cơ chế sắc ký Silica gel Hập phụ Alumium oxide Hập phụ PEI cellulose Trao đổi ion Chất phân tích Steroids, amino acid, alcohols, hydrocarbons, lipids, aflaxtoxin, vitamins, alkaloids Amines, alcohols, steroids, lipids, aflatoxins, vitamins, alkaloids Nucleic acids, nucleotides, steroids, nucelosides, purones, pyrimidines GVGD: ThS Trần Nguyễn An Sa Lớp Học tên SV Mã Tuyết Huê Nhóm: MSSV: 2004180112 Nguyễn Thị Trang Silica gel RP Săc ký pha đảo Magnesium silicate Hập phụ 2004180029 Fatty acids, vitamins, steroids, hormones, carotrnoids Steroids, pesticides, lipids, alkaloids Trong thí nghiệm pha tĩnh là: mỏng silicagel Merck 60 F254 Pha động: Việc quan trọng kỹ thuật TLC lựa chọn dung môi rửa giải (pha động) phù hợp để tách chất mẫu phân tích Để chọn dung môi phù hợp, cần lưu ý đến tính chất vật lý hóa học chất phân tích Axit, Bazơ hợp chất phân cực mạnh thường tạo vệt dài đốm trịn dung mơi trung tính Các vệt gây khó khăn việc tính tốn Rf bao gồm điểm khác (các chất chồng lên nhau) Thêm vài phần trăm axit axetic axit formic vào dung mơi điều chỉnh vệt cho axit Tương tự bazơ, thêm vài phần trăm triethylamine cải thiện kết Đối với hợp chất phân cực, thêm vài phần trăm methanol cải thiện kết Tính dễ bay dung mơi cần lưu ý Bất kỳ dung mơi cịn lưu lại mỏng phản ứng với vết bẩn (nếu có) Và che giấu cấc điểm Dung môi dễ bay nên sử dụng để rửa giải lần Nếu pha động sử dụng nhiều lần, kết không quán khơng có độ lặp lại Chất phân tích – tính chất chất phân tích: thứ tự độ phân cực giảm dần Diphenylmethanol  Benzophenone  Biphenyl Cơ chế tách: Trong sắc ký, chất phân tsich phân bố pha tĩnh pha động Trong hầu hết tất ứng udjng TLC, pha tĩnh chất hấp phụ silica alumina pha động dung môi hữu hỗn hợp dung môi Sắc ký tiến hành cho pha động di chuyển qua pha tĩnh đặt chât cần tách Giọt dung dịch mẫu nhỏ đường xuất, cịn rìa nhúng vào dung mơi thích hợp Dưới tác dụng lực mao quản, dung môi chuyển động GVGD: ThS Trần Nguyễn An Sa Lớp Học tên SV Mã Tuyết Huê Nhóm: MSSV: 2004180112 Nguyễn Thị Trang 2004180029 dọc theo lớp hấp phụ chuyển vận cấu tử chứa hỗn hợp với vận tosc khác đưa đến việc tách cấu tử Sự khuếch tán cấu tử lớp hấp phụ vừa theo chiều dọc vừa theo chiều ngang, vậy, xem qua trình sắc ký thực theo chiều Dự đoán thứ tự tách: hai chất dung môi phân cực tỷ lệ nên ta có hỗn hợp dung mơi phân cực Áp dụng nguyên tắc chất giống có lực giống thứ tự độ phân cực giảm dần chất phân tích Diphenylmethanol  Benzophenone  Biphenyl nên thứ tự tách di chuyển vết TLC giảm dần Cách phát vết sắc ký: vết dễ thấy nhìn thấy mắt thường dùng đèn UV để vết sắc ký cho chất khó thấy Qui trình thực nghiệm: (sơ đồ khối hình chụp thực tế) (2,5đ)  Quy trình chung sắc ký mỏng Chuẩn bị pha tĩnh Chuẩn bị mỏng Chấm mẫu lên vạch xuất phát Triển khai sắc ký  Pha chế dung dịch chuẩn đơn, chuẩn hỗn hợp Xử lý kết GVGD: ThS Trần Nguyễn An Sa Học tên SV Mã Tuyết Huê Lớp MSSV: 2004180112 Nguyễn Thị Trang Cân 5mg chất chuẩn đơn Hòa tan 0,5ml dung Nhóm: 2004180029 Lọ thủy tinh 10ml có nắp đậy Mơi Dd chuẩn đơn dùng để phân tích Lấy 2-3 giọt Vào lọ thủy tinh 10ml Dung dịch chuẩn hỗn hợp  Pha chế dung dịch mẫu phân tích 5mg mẫu 0,5ml methanol Lọ thủy tinh 10ml Dán nhãn Dung dịch mẫu phân tích  Chuẩn bị mỏng ống vi quản Chuẩn bị mỏng sau: Dùng kéo cắt mỏng silicagel Merck 60 F254 thành nhỏ theo kích thước dài x rộng = x cm Mỗi nhóm cần nhỏ cho loại dung môi rửa giải Sau đó, dùng bút chì vạch nhẹ nét xuất phát (cách mép 1cm) mức tiền tuyến dung môi (cách mép 0,5 cm) GVGD: ThS Trần Nguyễn An Sa Học tên SV Mã Tuyết Huê Nguyễn Thị Trang Lớp Nhóm: MSSV: 2004180112 2004180029 Chuẩn bị ống vi quản sau: Vi quản hơ xoay tròn lửa xanh đèn cồn để vi quản nóng chảy Khi vi quảng nóng chảy, vừa đem vi quản khỏi lửa đèn cồn, vừa kéo đầu vi quản hướng khác nhau, sau giữ yên cho thủy tinh nguội GVGD: ThS Trần Nguyễn An Sa Học tên SV Mã Tuyết Huê Nguyễn Thị Trang Lớp MSSV: 2004180112 2004180029 Nhóm: GVGD: ThS Trần Nguyễn An Sa Học tên SV Mã Tuyết Huê Nguyễn Thị Trang Lớp Nhóm: MSSV: 2004180112 2004180029  Quy trình triển khai Chuẩn bị cốc chứa loại dung môi rửa giải khác acetone, CH2Cl2, ethyl acetate, hexane, methanol toluene sau: Cho 10ml dung môi rửa giải vào cốc thủy tinh 250ml Chiều cao dung môi cốc thấp 5mm để mẫu sau chấm lên mỏng khơng bị chìm vào dung môi Đặt bên cốc mảnh giấy lọc để dung mơi bão bên cốc Đậy cốc mặt kính dán nhãn đánh số cho cốc GVGD: ThS Trần Nguyễn An Sa Học tên SV Mã Tuyết Huê Nguyễn Thị Trang Lớp MSSV: 2004180112 2004180029 Nhóm: GVGD: ThS Trần Nguyễn An Sa Học tên SV Mã Tuyết Huê Nguyễn Thị Trang Lớp Nhóm: MSSV: 2004180112 2004180029 Chấm bản: Dùng ống vi quản vừa chuẩn bị để chấm dung dịch chuẩn đơn, chuẩn hỗn hợp mẫu phân tích lên mỏng Mỗi điểm có đường kính 1-2mm, cách khoảng cm, lượng mẫu khoảng 10µL Sau chấm, để khơ khơng khí GVGD: ThS Trần Nguyễn An Sa Học tên SV Mã Tuyết Huê Nguyễn Thị Trang Lớp MSSV: 2004180112 2004180029 Nhóm: GVGD: ThS Trần Nguyễn An Sa Lớp Học tên SV Mã Tuyết Huê Nhóm: MSSV: 2004180112 Nguyễn Thị Trang 2004180029 Chất tách tối ưu R R A 4.6   0.39 73 S 6.7 A 1.2    0.18 f3 S 6.7 f1  Nhận xét: Chất di chuyển 39% khoảng cách dung mơi có Rf1=0,39 chất di chuyển 73% khoảng cách dung mơi cố Rf2=0,73 chất di chuyển 18% khoảng cách dung mơi cố Rf2=0,18 chênh lệch khoảng cách có nên chất tách khỏi dung mơi rủa giải phù hợp Mẫu mà Gv đưa nằm vị trí thứ mỏng hiển thị bao gồm chất chất thứ chất thứ GVGD: ThS Trần Nguyễn An Sa Lớp Học tên SV Mã Tuyết Huê Nhóm: MSSV: 2004180112 Nguyễn Thị Trang 2004180029 BÁO CÁO THỰC HÀNH PHÂN TÍCH SẮC KÝ BÀI 2: SẮC KÝ CỘT Cơ sở lý thuyết phương pháp sắc ký cột (2,5đ) Pha tĩnh: Có loại là: Silica gel, Alumina, Gel Silicagel  Slicagel pha thường Silica gel chế tạo cách thủy phân silicat natri để thành acid polysilisic, ngưng tụ polyme hóa để đạt tiêu vật lý cần thiết kích cỡ hạt, thể tích lỗ rỗng bề mặt, diện tích bề mặt, yêu cầu Silica gel sử dụng sắc ký cột có đường kính hạt trung bình khoảng 40-200 µm, lỗ rỗng có đường kính trung bình khoảng 30-300 A o, diện tích bề mặt khoảng 100-800 m2/g Các vị trí hoạt động bề mặt silicagel nhóm silanol -OH Khi silicagel hấp phụ nước, phân tử nước che khuất tâm hoạt động này, muốn điều chỉnh hoạt tính silicagel cần thêm loại bỏ bớt nước Các tâm hoạt động tạo nối hydrogen mạnh với hợp chất sắc ký, hợp chất phân cực bị silicagel giữ chặt cột giải ly muộn so với hợp chất phân cực  Silica gel chế hóa Có thể chế hóa silicagel cách cho nhóm silanol tác dụng với nhiều loại chloride silyl khác để tạo thành chất hấp phụ với đặc tính vật lý thay đổi gọi silicagel tạo nối Tùy thuộc vào loại chloride silyl mà loại silicagel dùng cho pha thường hay pha đảo Thường dùng silicagel pha thường hầu hết trình phân lập hợp chất Do mục sau chủ yếu đề cập đến silicagel pha thường Alumina Alumina oxit aluminium Al2O3 điều chế với quy trình tương tự silicagel với nguyên liệu ban đầu hydroxid aluminium Hơn điều chỉnh pH để tạo thành mạng khơng gian, tính kiềm hay trung tính Thường sử dụng alumina trung tính làm pha tĩnh Gel GVGD: ThS Trần Nguyễn An Sa Học tên SV Mã Tuyết Huê Lớp Nhóm: MSSV: 2004180112 Nguyễn Thị Trang 2004180029 Gel tên gọi chung cho loại pha tĩnh điều chế từ tinh bột, agar polyacrylamid, chuỗi dây dài nối mạng ngang để tạo thành mạng không gian chiều Có nhiều loại gel thương phẩm với đặc tính khác tùy thuộc vào nhà sản xuất Phổ biến gel dextran có tên thương mại Sephadex G Pha động: Lần lượt giải ly cột từ dung môi khơng phân cực đến dung mơi phân cực Có thể sử dụng hệ dung môi đơn nồng độ dung mơi có tính phân cực tăng dần để rửa giải Dưới dung môi thường dùng sắc ký cột với số phân cực tăng dần Bảng 2: Các loại dung môi thường sử dụng sắc ký cột Dung môi đơn Hệ hai dung môi Các hydrocacbon như: Ether với ether dầu pentane, ether dầu hỏa, hỏa/hexane/pentan hexane e Hexane với ethyl Ether dichloromethane Ethyl acetate acetate/ dichloromethane Dichloromethane với methanol Hệ dung môi đặc biệt N-butanol với acid axetic nước 2-melthyl-1-propanol với acid acetic nước 1-propanol với NH4OH nước Chất phân tích – tính chất chất phân tích: Cơ chế tách: Hỗn hợp đưa qua cột thẳng đứng có chứa vật liệu hấp phụ (pha tĩnh) dùng dung môi hay hệ dung môi (pha động) phù hợp để rửa giải, chất thu lại thành phần nhỏ đầu cột Tùy thuộc vào tương tác chất hỗn hợp với vật liệu hấp phụ dung môi rửa giải, chất thu lại thành phần nhỏ hay phân đoạn nhỏ đầu cột Tùy thuộc vào tương tác chất hỗn hợp với vật liệu hấp phụ dung môi rửa giải mà thành phần khác mẫu phân tách GVGD: ThS Trần Nguyễn An Sa Học tên SV Mã Tuyết Huê Lớp Nhóm: MSSV: 2004180112 Nguyễn Thị Trang 2004180029 Dự đoán thứ tự tách: Yêu cầu nạp pha tĩnh, nạp mẫu giải ly Bột silica alumina chất kích thích phổi Và phải ln xử lý cẩn thận tủ hút Bụi bị đổ nên xử lý cách lau khăn giấy ướt (Vì ướt, hạt mịn phân tán hơn) Trong tồn q trình rửa giải Cột phải ln ướt không để mực dung môi rửa giải sát bề mặt lớp pha tĩnh Phải đảm bảo có đủ thời gian để chạy cột trước đưa mẫu lên, không nên dừng cột phút Không ngừng cột lần Khi cột chạy rồi, việc dừng cột phút dẫn tới dải bị mở rộng Qui trình thực nghiệm: (sơ đồ khối hình chụp thực tế) (2,5đ)  Quy trình nhồi cột sắc ký Bước 1: Tráng rửa cột nước cất, để khô, tráng lại chloroform Kẹp cột lên giá, cho vào miếng bơng nhỏ để bịt đầu cột Để cột hũ bi để hứng dung môi Bước 2:Cân khoảng 6g silica gel vào cốc thủy tinh, cho tiếp vào khoảng 30ml chloroform, khuấy GVGD: ThS Trần Nguyễn An Sa Học tên SV Mã Tuyết Huê Nguyễn Thị Trang Lớp MSSV: 2004180112 2004180029 Nhóm: GVGD: ThS Trần Nguyễn An Sa Học tên SV Mã Tuyết Huê Lớp Nhóm: MSSV: 2004180112 Nguyễn Thị Trang 2004180029 Dùng pipette pastuer chuyển hỗn hợp vào cột Tiếp tục cho chloroform đến silaca cột lắng ổn định Quá trình cần khoảng 30ph GVGD: ThS Trần Nguyễn An Sa Học tên SV Mã Tuyết Huê Nguyễn Thị Trang Lớp MSSV: 2004180112 2004180029 Nhóm: GVGD: ThS Trần Nguyễn An Sa Lớp Học tên SV Mã Tuyết Huê MSSV: 2004180112 Nguyễn Thị Trang  Nhóm: 2004180029 Quy trình triển khai sắc ký Bước 1: Xử lý mẫu cây, chuẩn bị hệ dung môi Cốc 10g mẫu Cối sứ + 10ml dm CHCl Cao Nghiền 3-5 lần Dung dịch Becher Cô cách thủy Lọc Dung dịch Mẫu sau rửa sạch, để khô, sau giã nhuyễn, hịa với chloroform GVGD: ThS Trần Nguyễn An Sa Học tên SV Mã Tuyết Huê Nguyễn Thị Trang Lớp MSSV: 2004180112 2004180029 Nhóm: GVGD: ThS Trần Nguyễn An Sa Học tên SV Mã Tuyết Huê Lớp Nhóm: MSSV: 2004180112 Nguyễn Thị Trang 2004180029 Bước 2: Chuyển mẫu lên cột tiến hành sắc ký - Dùng pipet pasteur chuyển mẫu lên cột sắc ký theo phương pháp ướt - Pha hỗn hợp dung môi chạy cột (CHCl3) Chờ cho dung mơi hịa tan mẫu chạm sát xuống bề mặt pha rắn cho dung môi chạy vào cột sắc ký - Dùng hũ bi hứng dung dịch chảy khỏi cột theo phân đoạn khác GVGD: ThS Trần Nguyễn An Sa Học tên SV Mã Tuyết Huê Nguyễn Thị Trang Lớp MSSV: 2004180112 2004180029 Nhóm: GVGD: ThS Trần Nguyễn An Sa Học tên SV Mã Tuyết Huê Nguyễn Thị Trang Lớp Nhóm: MSSV: 2004180112 2004180029 Kết thực nghiệm (2đ) - cao CHCl3 a Kết lựa chọn dung môi giải ly TLC Dung CH3Cl_MeOH CH3Cl_MeOH CH3Cl_MeOH MeOH mơi Hình (2:3) DM1 (1:1) DM2 (3:2) DM3 DM5 kết chiếu UV Nhận Vết đẹp, rõ Các vết tách Có số vết tách Các vết kéo xét ràng, tách nhau tạm ổn cịn lại dính dài từ vết với thành lên loan vào loan vào vết, tách không tốt hiệu tách Kết luận dung mơi tối ưu: nhìn vào hình ta thấy dung môi tách nhiều màu (5 màu) Nên dung môi dung môi tối ưu b Kết sắc ký cột GVGD: ThS Trần Nguyễn An Sa Học tên SV Mã Tuyết Huê Nguyễn Thị Trang Lớp MSSV: 2004180112 2004180029 Nhóm: GVGD: ThS Trần Nguyễn An Sa Học tên SV Mã Tuyết Huê Nguyễn Thị Trang Lớp Nhóm: MSSV: 2004180112 2004180029 Hình chụp cột Chai chứa phân đoạn Nhận xét kết sắc ký cột cao (1đ) - Về kết ta thấy mẫu pha MeOH tạo cao MeOH cho phân đoạn sản phẩm, cao CHCl pha từ mẫu với CHCl3 lai cho phân đoạn cho thấy hiệu tách sử dụng cao CHCl cao cao MeOH GVGD: ThS Trần Nguyễn An Sa Học tên SV Mã Tuyết Huê Nguyễn Thị Trang Lớp Nhóm: MSSV: 2004180112 2004180029 - Khi thực sắc ký cột củng nên ưu tiên sử dụng cao mẫu với CHCl dễ cho kết tốt hơn, CHCl3 hịa tan nhiều chất giúp kết thí nghiệm hay nghiên cứu xác