Đề tài: Nghiên cứu phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens vào cây lily

Phần 1: mở đầu 1.1. Đặt vấn đề Sản xuất và kinh doanh hoa là một ngành đem lại lợi nhuận kinh tế rất cao. Tổng giá trị sản lượng hoa hàng năm của thế giới ước tính khoảng 37 tỷ đô la tập trung ở các nước phát triển như Nhật Bản, Hà Lan, Mỹ,… Ngành sản xuất hoa cũng đang trở nên rất phát triển ở các nước châu á, điển hình là Trung Quốc, ấn Độ, Thái Lan, Malaysia, Singgapo, Philipin… ở Việt Nam sản xuất và kinh doanh hoa đang trở thành vấn đề cần được quan tâm đầu tư và là lĩnh vực đầy triển vọng. Lilium thuộc họ liliaceae, có khoảng 85 loài phân bố chủ yếu ở các vùng ôn đới và cận nhiệt đới thuộc phía bắc bán cầu lily là một trong các loài hoa đẹp đang rất được ưa chuộng trên thị trường hoa hiện nay. Với kiểu dáng đẹp sang trọng, một số chủng loại có hương thơm quyến rũ và độ bền hoa rất cao (915 ngày), dễ thu hoạch, bảo quản, trên thế giới lilium cùng với tulip, freesia là ba loại hoa dang thân củ chủ yếu, quan trọng trong ngành hoa thương mại, chiếm 24% giá trị sản phẩm hoa thương mại (Robinson và Pizarobady, 1993) ở Việt Nam hiện nay, hoa lily đã được trồng thành công ở nhiều tỉnh ở nước ta như Lâm Đồng (Sapa), Hà Nội, Mộc Châu, Thái Bình, Quảng Ninh có hiệu quả kinh tế rất cao nhưng phải nhập nội củ giống. Tuy nhiên điều kiện khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều của nước ta đã tạo điều kiện rất thuận lợi cho các loài cỏ dại phát triển đây là một trong những yếu tố hạn chế chủ yếu đến sản xuất hoa lily. Do đó tạo giống lily kháng được cỏ dại và sâu bệnh là niềm mơ ước của cả các nhà chọn tạo giống và người sản xuất hoa thương mại. Việc tiến hành nghiên cứu phương pháp chuyển gen vào cây hoa lily nhờ vi khuẩn Agrobecterium tumefaciens để tạo ra cây lily có khả năng kháng sâu hiên đang là mong mỏi của ngành nông nghiệp. Mặt khác, đề tài tiến hành trên đối tượng hoa chứ không phải là một đối tượng thực phẩm nên được Nhà nước khuyến khích và cho phép. Đến nay trên thế giới việc tạo giống cây trồng chuyển gen ngày càng phát triển và thu được nhiều thành tựu. Năm 2004 diện tích cây trồng chuyển gen đạt 81 triệu ha... Các loại cây trồng chuyển gen chủ yếu được chuyển nạp đặc tính kháng thuốc trừ cỏ và kháng sâu. Các nỗ lực chính trong nghiên cứu chuyển gen vào cây lily đã được thực hiện bởi các phương pháp chuyển gen trực tiếp như bắn gen (Nishihara và cộng sự, 1993; Sanford và cộng sự, 1993; Wilmink và cộng sự, 1995; Tsuchiya và cộng sự, 1996), sử dụng xung điện (Miyoshi và cộng sự, 1995). Trong một số năm gần đây, sự thành công trong nghiên cứu chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium đã được công bố trên một số loài thuộc họ liliace bao gồm: Asparagus officinalis (Kiasaka và Kameya, 1998), Allium sativum (Kondo và cộng sự, 2000), và Muscari armeniacum (Suzuki và Nakano, 2002). Gần đây nhất, Y. Hoshi và cộng sự đã nghiên cứu thành công quy trình tạo cây chuyển gen cho cây Oriental hybrid lily, lilium ev. Acapulco bằng vi khuẩn Agrobacterium . Tuy nhiên cho đến nay việc nghiên cứu chuyển gen cho cây lily còn hoàn toàn chưa được đề cập ở Việt Nam. Trong bối cảnh nêu trên chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens vào cây lily” nhằm tạo tiền đề cho việc tạo giống lily chuyển gen ở nước ta. 1.2. Mục đích, yêu cầu của đề tài Mục tiêu của đề tài là xây dựng được những khâu cơ bản trong hệ thống kỹ thuật chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ cho cây hoa lily nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Để đạt được mục tiêu đề ra ở trên chúng tôi cần hoàn thành các yêu cầu sau: 1. Xây dựng hệ thống tái sinh cho cây lily 2. Xác định được các thông số cần thiết trong quy trình chuyển gen môi trường diệt khuẩn (kháng sinh cefotaxime),môi trường đồng nuôi cấy, môi trường chọn lọc PPT. 3. Bước đầu thử nghiệm chuyển gen gus, gen bar (gen kháng thuốc trừ cỏ PPT) và gen cryIA(c) vào cây hoa lily thông qua vi khuẩn Agrobecterium tumefaciens. Phần II Tổng quan tài liệu 2.1 Giới thiệu chung về cây hoa lily 2.1.1 Nguồn gốc Cây hoa lily có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản, Nam Triều Tiên, California (Mỹ) và một số nơi khác. 2.1.2 Vị trí phân loại thực vật Trong hệ thống phân loại thực vật cây hoa lily được xếp vào nhóm cây một lá mầm (Monocotyledones), phân lớp hành (Lilidae), bộ hành (Liliales), họ hành (liliaceae), chi lilium (theo Dương Đức Tiến, Võ Văn Chi, 1978). Cây hoa lily là cây thân thảo, thân dạng hành có vảy. Thân thường mọc đơn có lá. Lá luôn có hình mũi mác hay hình vạch ít khi rộng, hình tim và mọc xung quanh thân. Hoa lưỡng tính, kích thước lớn mọc ở nách lá hay ở ngọn, có rất nhiêu màu sắc khác nhau. Hoa có thể mọc riêng lẻ hay thành cụm gồm nhiều hoa, bao hoa 6 mảnh dạng cánh, nhị 6, bầu hình trụ, đầu nhụy hình đầu, chia 5 thùy. Quả nang có 3 góc và 3 nang, quả nang có nhiều hạt. 2.1.3 Đặc tính sinh vật học hoa lily Đặc trưng hình thái. Lily là cây thân thảo lâu năm, thân cao từ 50200 cm. Phần dưới đất là thân vẩy, màu trắng hoặc màu hồng nhạt, phía ngoài không có màng bao bọc, nên gọi là thân vẩy trần (không vỏ, thân vẩy là củ giống để trồng). Bộ phận trên mặt đất là thân, lá, và hoa, quả, là phần thương phẩm của lily. Rễ lily có hai tầng, rễ mọc ở gốc của thân vẩy gọi là rễ gốc, to, mềm, có ngay trên củ giống hoặc mọc ra ngay sau khi trồng. Rễ mọc ở nơi tiếp giáp giữa củ và thân trên mặt đất gọi là rễ thân. Đa số giống sản xuất những thân vẩy( củ) mọc ra từ rễ này làm thực liệu để nhân giống.

Lơng Văn Mạnh Lớp CNSH 02-02 Phần 1: mở đầu 1.1 Đặt vấn đề Sản xuất kinh doanh hoa ngành đem lại lợi nhuận kinh tế cao Tổng giá trị sản lợng hoa hàng năm giới ớc tính khoảng 37 tỷ đô la tập trung nớc phát triển nh Nhật Bản, Hà Lan, Mỹ, Ngành sản xuất hoa trở nên phát triển nớc châu á, điển hình Trung Quốc, ấn Độ, Thái Lan, Malaysia, Singgapo, Philipin Việt Nam sản xuất kinh doanh hoa trở thành vấn đề cần đợc quan tâm đầu t lĩnh vực đầy triển vọng Lilium thuộc họ liliaceae, có khoảng 85 loài phân bố chủ yếu vùng ôn đới cận nhiệt đới thuộc phía bắc bán cầu lily loài hoa đẹp đợc a chuộng thị trờng hoa Với kiểu dáng đẹp sang trọng, số chủng loại có hơng thơm quyến rũ độ bền hoa cao (9-15 ngày), dễ thu hoạch, bảo quản, giới lilium với tulip, freesia ba loại hoa dang thân củ chủ yếu, quan trọng ngành hoa thơng mại, chiếm 24% giá trị sản phẩm hoa thơng mại (Robinson Pizarobady, 1993) Việt Nam nay, hoa lily đà đợc trồng thành công nhiều tỉnh nớc ta nh Lâm Đồng (Sapa), Hà Nội, Mộc Châu, Thái Bình, Quảng Ninh có hiệu kinh tÕ rÊt cao nhng ph¶i nhËp néi cđ gièng Tuy nhiên điều kiện khí hậu nóng ẩm, ma nhiều nớc ta đà tạo điều kiện thuận lợi cho loài cỏ dại phát triển Lơng Văn Mạnh Lớp CNSH 02-02 yếu tố hạn chế chủ yếu đến sản xuất hoa lily Do tạo giống lily kháng đợc cỏ dại sâu bệnh niềm mơ ớc nhà chọn tạo giống ngời sản xuất hoa thơng mại Việc tiến hành nghiên cứu phơng pháp chuyển gen vào hoa lily nhờ vi khuẩn Agrobecterium tumefaciens để tạo lily có khả kháng sâu hiên mong mỏi ngành nông nghiệp Mặt khác, đề tài tiến hành đối tợng hoa đối tợng thực phẩm nên đợc Nhà nớc khuyến khích cho phép Đến giới việc tạo giống trồng chuyển gen ngày phát triển thu đợc nhiều thành tựu Năm 2004 diện tích trồng chuyển gen đạt 81 triệu Các loại trồng chuyển gen chủ yếu đợc chuyển nạp đặc tính kháng thuốc trừ cỏ kháng sâu Các nỗ lực nghiên cứu chuyển gen vào lily đà đợc thực phơng pháp chuyển gen trực tiếp nh bắn gen (Nishihara cộng sù, 1993; Sanford vµ céng sù, 1993; Wilmink vµ céng sù, 1995; Tsuchiya vµ céng sù, 1996), sư dơng xung điện (Miyoshi cộng sự, 1995) Trong số năm gần đây, thành công nghiên cứu chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium đà đợc công bố sè loµi thuéc hä liliace bao gåm: Asparagus officinalis (Kiasaka vµ Kameya, 1998), Allium sativum (Kondo vµ céng sù, 2000), Muscari armeniacum (Suzuki Nakano, 2002) Gần nhất, Y Hoshi cộng đà nghiên cứu thành công quy trình tạo chuyển gen cho Oriental Lơng Văn Mạnh Lớp CNSH 02-02 hybrid lily, lilium ev Acapulco vi khuẩn Agrobacterium Tuy nhiên việc nghiên cứu chuyển gen cho lily hoàn toàn cha đợc đề cập Việt Nam Trong bối cảnh nêu tiến hành đề tài Nghiên cứu Agrobacterium phơng pháp chuyển gen tumefaciens vào lily nhằm tạo tiền đề cho việc tạo giống lily chuyển gen nớc ta 1.2 Mục đích, yêu cầu đề tài Mục tiêu đề tài xây dựng đợc khâu hệ thống kỹ thuật chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ cho hoa lily nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Để đạt đợc mục tiêu đề cần hoàn thành yêu cầu sau: Xây dựng hệ thống tái sinh cho lily Xác định đợc thông số cần thiết quy trình chuyển gen môi trờng diệt khuẩn (kháng sinh cefotaxime),môi trờng đồng nuôi cấy, môi trờng chọn lọc PPT Bớc đầu thử nghiệm chun gen gus, gen bar (gen kh¸ng thc trõ cá PPT) gen cryIA(c) vào hoa lily thông qua vi khuẩn Agrobecterium tumefaciens Lơng Văn Mạnh Lớp CNSH 02-02 Phần II Tổng quan tài liệu 2.1 Giới thiệu chung vỊ c©y hoa lily 2.1.1 Ngn gèc C©y hoa lily cã nguån gèc tõ Trung Quèc, NhËt B¶n, Nam Triều Tiên, California (Mỹ) số nơi khác 2.1.2 Vị trí phân loại thực vật Trong hệ thống phân loại thực vật hoa lily đợc xếp vào nhóm mầm (Monocotyledones), phân lớp hành (Lilidae), hành (Liliales), họ hành (liliaceae), chi lilium (theo Dơng Đức Tiến, Võ Văn Chi, 1978) Cây hoa lily thân thảo, thân dạng hành có vảy Thân thờng mọc đơn có Lá có hình mũi mác hay hình vạch rộng, hình tim mọc xung quanh th©n Hoa lìng tÝnh, kÝch thíc lín mäc ë nách hay ngọn, có nhiêu màu sắc khác Hoa mọc riêng lẻ hay thành cụm gồm nhiều hoa, bao hoa mảnh dạng cánh, nhị 6, bầu hình trụ, đầu nhụy hình đầu, chia thùy Quả nang có góc nang, nang có nhiều hạt 2.1.3 Đặc tính sinh vật học hoa lily Đặc trng hình thái Lily thân thảo lâu năm, thân cao từ 50-200 cm Phần dới đất thân vẩy, màu trắng màu hồng nhạt, phía màng bao bọc, nên gọi thân vẩy trần (không vỏ, thân vẩy củ giống để trồng) Bộ phận mặt đất thân, lá, hoa, quả, phần thơng phẩm lily RƠ lily cã hai tÇng, rƠ mäc ë gèc cđa thân vẩy gọi rễ gốc, to, mềm, có củ giống mọc sau trồng Rễ mọc nơi tiếp giáp củ thân mặt đất gọi rễ thân Đa số giống Lơng Văn Mạnh Lớp CNSH 02-02 sản xuất thân vẩy( củ) mọc từ rễ làm thực liệu để nhân giống Lá lily thờng mọc chéo nhau, hình dài, hình trứng cuống cuống ngắn, số giống nách có mầm, dùng nhân giống Hoa lily to mọc riêng rẽ mọc thành chùm thành cụm đỉnh thân.Mỗi củ có cành hoa, mầm thân lily bị rụng đi, sau ngắt mọc thân mới, hình thành cành hoa khác Nếu muốn cắt hoa không đợc bÊm ngän, hoa cã h×nh loa kÌn, h×nh phƠu, h×nh sao, hình chén nông Màu sắc hoa phong phú, đẹp có màu trắng, màu vàng lục, màu phấn hồng, màu cam, màu đỏ, màu tím nhiều màu Màu cánh thờng đơn sắc, có đốm màu nâu, màu tím số có hơng thơm Cánh hoa sáu cái, hai vòng, vòng ba cái, nhị đực sáu cái, vòi nhỏ dài, túi phấn to có màu tím,,màu vàng có trục hoa nhỏ đầu phình to 2.1.4 Giá trị kinh tế giá trị sử dụng Loa kèn có hoa to màu sắc phong phú, hơng thơm - loại hoa đợc giới a thích, lả loại hoa có lợng lu thông lớn thị trờng giới, sản lợng đứng hàng thứ thứ hoa cắt Hoa tơi sản phẩm hàng hóa đặc biệt ngành Nông Nghiệp Hiện trồng hoa đà trở thành ngành sản xuất phát triển khắp giới Trong hoa loa kèn đóng góp phần không nhỏ Với u phong phú hình dạng, màu sắc, hơng thơm Hoa loa ken có giá trị kinh tế cao sản xuất lẫn mặt tinh thần Bên cạnh giá trị phong phú tinh thần hoa loa kèn đợc sử dụng để tách chiết tinh chế dầu thơm phục vụ cho số ngành công nghiệp, mỹ phẩm, bánh Lơng Văn Mạnh Lớp CNSH 02-02 kẹo Đối với y học, loài có giá trị định Loài hoa bách hợp L.browni febrown có tác dụng chữa bệnh, sử dụng làm thuốc Với giá trị nh hoa loa kèn hứa hẹn mang lại nguồn doanh thu lớn cho ngành sẩn xuất, kinh doanh mặt hàng Hiện nay, thị trờng Việt Nam, loại hoa loa kèn đợc bán phổ biến từ 10.000 đến 15.000 đồng/cành (theo điều tra thời báo kinh tế) Nh đầu t vốn vào phát triển kinh doanh mặt hàng đem lại cho sản xuất lợi nhuận cao 2.1.5 Các loại sâu hại chủ yếu lily - Rệp Các loại rệp gây hải chủ yếu rệp rệp khoai tây râu dài Triệu chứng: Rệp hại non nụ non tạo nên đốm màu xanh, cong lại biến dạng nhng xanh làm sâu nụ, Rệp truyền virus - Sâu đục rễ Triệu chứng: Ký sinh mặt rễ, hút dịch rễ, ảnh hởng tới sinh trởng làm vàng, nghiêm trọng làm cho chết khô, tác hại chủ yếu vào lúc sinh trởng thời kỳ cất trữ củ - Sâu hại cánh vẩy Chủ yếu ngài đêm cánh trắng ngài dơi(ngài cánh dơi) Lơng Văn Mạnh Lớp CNSH 02-02 Triệu chứng: ấu trùng ngài dơi cắn phá gốc cây, có đục vào thân, ngài cánh trắng chủ yếu hại nụ 2.2 CHUYểN GEN THựC VậT 2.2.1 Kh¸i niƯm vỊ kü tht chun gen Kü tht chuyển gen kỹ thuật đa hay nhiều gen lạ đà đợc thiết kế dạng ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ trồng nói riêng sinh vật nói chung (vi sinh vật, động vật) làm cho gen lạ tồn dạng plasmid tái tổ hợp gắn vào gen tế bào chủ Trong tế bào chủ, gen hoạt động tổng hợp nên protein đặc trng dẫn tới việc xuất đặc tính thể chuyển gen 2.2.2 Các phơng pháp chuyển gen vào thực vật Có nhiều phơng pháp chuyển gen vào thực vật nhng phân loại thành hai nhóm phơng pháp chính: phơng pháp chuyển gen gián tiếp phơng pháp chuyển gen trực tiếp 2.2.2.1 Phơng pháp chuyển gen gi¸n tiÕp a) Chun gen nhê vi khn Agrobacterium Dựa vào chế chuyển gen vi khuẩn A.tumefaciens, ngời ta đà dùng vi khuẩn đất để chuyển gen mong muốn cho sở thiết kế l¹i hƯ thèng Tiplasmid cđa vi khn cho vÉn đảm bảo đợc chức chuyển gen nhng không mang gen gây độc cho Ngời ta đà tạo dạng vectơ để chuyển gen vectơ liên hợp vectơ nhị thể Các hệ thống vectơ đợc tạo thành đợc dựa sở cải tiến Ti-plasmid Phần T-DNA Ti-plasmid bị cắt bỏ gen gây u Lơng Văn Mạnh Lớp CNSH 02-02 gen tổng hợp opine, thay vào gen mong muốn kèm theo gen thị gen khởi động b) Chuyển gen nhờ virus Ngoài vi khuẩn ngời ta dùng virus làm vectơ chuyển gen cho trồng virus dễ thâm nhập lây lan thể thực vật Mặt khác cấu tạo virus có mặt axit nucleic làm sở cho việc gắn gen cần chuyển vào Hiện có hai loại virus đợc sử dụng làm vectơ chuyển gen vào thực vật là: caulimovirus geminivirus Tuy nhiên, việc chuyển gen nhờ virus đợc sử dụng Do virus nguyên tắc không truyền qua hạt việc nhân giống chuyển gen nhờ virus phải tiến hành phơng pháp vô tính Điều thực đợc với tất loại Đây nhợc điểm lớn phơng pháp chuyển gen nhê virus 2.2.2.2 ChuyÓn gen trùc tiÕp a) ChuyÓn gen nhờ kỹ thuật siêu âm (Mild sonication) Kỹ thuật siêu âm dùng để chuyển gen vào protoplast (tế bào trần) Sau tách protoplast, tạo huyền phù protoplast với plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn gen chọn lọc Cắm đầu siêu âm máy phát siêu âm ngập huyền phù protoplast 3mm Cho máy phát siêu âm với tần số 20kHz theo nhịp ngắn 110 millisecond Tổng thời gian tác động khoảng 500 900 millisecond Sau đem protoplast nuôi môi trờng thích hợp môi Lơng Văn Mạnh Lớp CNSH 02-02 trờng chọn lọc để tách protoplast đà nhận đợc ADN Nuôi cấy tái sinh b) Chun gen nhê kü tht ®iƯn xung (electroporation) Kü thuật đợc sử dụng cho việc chuyển gen vào protoplast điện cao thời gian ngắn tạo nên lỗ màng tế bào trần làm cho ADN bên xâm nhập vào gen tế bào Ngời ta chuẩn bị huyền phù protoplast với plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn gen chọn lọc Dùng thiết bị điện xung tạo điện cao 200-600V/cm khoảng thời gian phần nghìn giây Kết làm cho màng tế bào trần xuất lỗ thủng tạm thời giúp cho ADN ngoại lai xâm nhập Quá trình thờng đợc thực cuvet chuyên dụng buồng xung điện có cực kim loại đặt cách khoảng 1-4mm Sau trình điện xung đem protoplast nuôi môi trờng thích hợp môi trờng chọn lọc để tách protoplast đà nhận đợc ADN Nuôi cấy tái sinh tiếp tục chän läc c) Kü thuËt chuyÓn gen nhê silicon carbide Silicon carbide vật liệu dạng sợi có đờng kính nhỏ khoảng 0,6àm dài khoảng 10 - 80àm Khi lắc hỗn hợp huyền phù tế bào đơn plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn, gen chọn lọc với silicon carbide máy lắc vortex khoảng giây, tế bào bị thủng ADN ngoại lai xâm nhập Nuôi cấy tế bào tái Lơng Văn Mạnh Lớp CNSH 02-02 sinh thành mô sẹo cây, chọn lọc để tách đà chuyển gen Thờng huyền phù tế bào đơn đợc thu hoạch vào ngày thứ thứ sau cấy truyền giai đoạn tốt để thực quy trình chuyển gen d) Chuyển gen phơng pháp súng bắn gen Chuyển gen phơng pháp bắn gen Sanford đại học Cornell (Mỹ) đề xuất vào năm 1987 Nguyên tắc chung phơng pháp sử dụng viên đạn có kích thớc nhỏ nhng có tỷ trọng cao để đạt đợc gia tèc cao díi t¸c dơng cđa mét lùc nÐn chúng xuyên qua vỏ màng tế bào đa lớp ADN bọc vào tế bào tiếp cận với gen tế bào Tách mô tế bào nuôi cấy tái sinh thành Gần đây, ngời ta đà cải tiến súng bắn gen theo hớng không sử dụng viên đạn lớn mà dùng phận nén khí mạnh tạo áp lực đẩy vi đạn Thờng sử dụng luồng khí heli áp lực cao (súng Finer Finer đại học Ohio (Mỹ) đề xuất 1992, súng Sautter (1991) e) Phơng pháp trực tiếp chuyển gen thông qua ống phấn (pollen tube) Phơng pháp chuyển gen đợc xem phơng pháp chuyển gen không qua nuôi cấy mô Phơng pháp đợc nhóm Ray Wu đại học Cornell (Mỹ) đề xuất năm 1988 đối tợng lúa Đề xuất dựa kế thừa công trình tác giả Trung Quốc Duan Chen (1985) Theo phơng pháp ADN chuyển vào theo đờng ống phấn chui vào bầu nhuỵ chuyển gen sau hạt phấn mọc qua vòi nhụy bắt đầu đa tinh tử vào thụ tinh Theo tác giả 10 Lơng Văn Mạnh Lớp CNSH 02-02 tợng thời gian chọn lọc lần cha đủ dài nên chồi lily tái sinh cha chết Tồn tại: Từ trình thí nghiệm kết nghiên cứu thu đợc nhận thấy để chuyển gen vào lily cách hiệu cần tập trung giải tốt vấn đề sau + Xây dựng hệ thống tái sinh phù hợp cho lily Siberia chồi Siberia tái sinh thờng không suất từ vết cắt vảy củ mà từ vị trí phía Mà điều kiện dẫn đến biến nạp vi khuẩn A.tumefacins tiếp xúc vật lý vi khuẩn mô thực vật chỗ bị thơng Do chồi tái sinh đợc, từ phần mô đà đợc chuyển gen + Cây lily ký chủ A.tumefaciens nên chuyển đồng thời gen GUS, Bar CryIA(c) với độ lớn gen ngoại lai lớn, dẫn đến hiệu chuyển gen thấp Cần phải lựa chọn vectơ phù hợp cho việc chuyển gen vào c©y lily 70 Hình 4.7 Sự tái sinh tạo chồi t vy c lily Siberia Lơng Văn Mạnh Lớp CNSH 02-02 Phần Kết luận đề nghị 5.1 Kết luận 5.1.1 Đà xác định đợc môi trờng tái sinh tạo chồi callus từ vẩy củ cho lily Siberia - Môi trờng tái sinh thích hợp cho lily Siberia môi trờng MS (1962) + mg/lít 2,4D vµ 0,2 mg/lÝt BA + g agar - Cã thĨ sư dơng m«i trêng MS (1962) + 1mg 2,4D/lÝt + 0,2mg BA/lÝt cã bỉ sung 10 g ®êng gluco 30 g đờng sacaro để tạo callus bæ sung 10g gluco + 20g sacaro + 40 g manitol để tái sinh tạo chồi từ vảy củ lily trắng 5.1.2 Có thể dùng kháng sinh cefotaxime nồng độ ®Õn 500mg/lÝt ®Ĩ diƯt vi khn Agrobacterium tumefaciens 5.1.3 Cã thĨ sư dơng PPT ë nång ®é 4mg/lÝt ®Ĩ chän läc chåi lily chuyÓn gen gièng lily Siberia 5.1.4 Cã thể sử dụng PPT nồng độ 1,5mg/lít để làm nồng độ chọn lọc mô vẩy củ đà đợc chuyển gen giống lily Siberia 71 Lơng Văn Mạnh Lớp CNSH 02-02 5.1.5 Môi trờng đồng nuôi cấy thích hợp cho vi khuẩn A.tumefaciens sinh trởng phát triển là: MS (1962) NH4NO3, 20mg/l AS, 30g/l sucrose, 10g/l gluco, 1mg/l 2,4D, 0.2mg/l BA, 1g/l cassamino acid, 700mg/l asparagine, 7g/l agar, pH = 5,2 5.1.6 Thêi gian ®ång nuôi cấy cần thiết là: từ đến 15 ngày 5.1.7 Dùng vectơ chủng vi khuẩn A.tumefaciens EHA105 mang plasmid PCAMBIA 1305.1 m· ho¸ cho gen gus gen kháng kháng sinh hygromycin, chuyển gen GUS cho lily Siberia đà thu đợc kết bớc đầu 29,6% mô chuyển gen có biểu tạm thời gen GUS 5.1.6 Sử dụng vectơ chủng EHA105 mang vector ITB2c để chuyển đồng thời gen GUS, Bar CryIA(c) cho lily Siberia cha mang lại kết cuối 5.2 Đề nghị 5.2.1 Cần tiếp tục nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh thích hợp cho lily Siberia 5.2.2 Tiếp tục nghiên cứu chuyển gen cho lily Siberia 72 Lơng Văn Mạnh Lớp CNSH 02-02 Phần VI Tài liệu tham khảo Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Quang Thạch Báo cáo tổng kết đề tài Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh hoa đồng tiền lily phục vụ tạo giống hoa míi b»ng kü tht chun gen”, 2006 §inh Ngäc Hạnh, 2005 Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh in vitro lily phục vụ chuyển gen Báo cáo tốt nghiệp khoa Nông học, lớp trồng 46A, 2005 GS TS Nguyễn Quang Thạch (chủ biên), TS Nguyễn Thị Lý Anh, TS Nguyễn Phơng Thảo, 2004 Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp Nguyễn Thị KiỊu Thu, 2006 Nghiªn cøu chun gen nhê vi khn Agrobacterium tumefaciens vào vải, 2006 Luận án thạc sỹ, Trờng Đại học Cần Thơ A.Lipsky, A.Cohen, R Barg, S Shabtai, Y Salts, V Gaba, K Kamo, A Gera A Watad Development of Lilium longiflorum cell cultures of high competence for transformation by particle bombarment and of high embryogenic capacity A.Mercuri, L.De Benedetti, S Bruna, R Begliano, C Bianchini, G.Foglia, T.Schiva Agrobacterium-Mediated transformation with rol genes of Lilium longiflorum Thunb ISHS Acta Horticluturae 612 73 L¬ng Văn Mạnh Lớp CNSH 02-02 Byung Joon Ahn, Young Hee Joung, Kathryn K Kamo, 2004 J Transgenic Plants of Eastr lily (Lilium longiflorum) with Phosphinothricin Resitance J Plant Biotechnology (2004) Vol 6(1).pp.9-13 C.C EADY, 1995 Towords the transformation of onions (Allium cepa) New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science, 1995, Vol 23: 239-250 In-Har Park, Hee-Sung Park, 2002 Lily pollen growth in vitro and Agrobacterium-mediated transformation via gus vacuum-infiltration gen J.Plant Biotechnology (2002) Vol 4(4).pp.151-154 10 Purnima Tyagi and S L Kothari, 2004 Rapid in vitro regeneration of Gerbera jamesonii from different explants Indian Journal of Biotechnology Vol 3, October 2004, pp 584-588 11 Sakae SUZUKI and Agrobacterium-Mediated ornamental plants Masaru NAKANO, transformation JARQ 36(3), in 2002 Liliaceous 119-127(2002) http://www.jircas.affrc.go.jp 12 Teresa Orlikowska, Elzbieta Nowak, Agnieszka Marasek, Danuta Kucharska Plant CellTissue and Organ Culture, 1999 Effects of growth regulators and incubation period on in vitro regeneration of adventitious shoots from gerbera petioles 13 V Nagaraju, G.S.L.Srinivas G.Lakshmi Sita, 1998 Agrobacterium-mediiated genetic 74 transformation in L¬ng Văn Mạnh Lớp CNSH 02-02 Gerbera hybrida Current science, Vol.74, No.7,10 April 1998 14 Y.Hoshi, M.Kondo, S.Mori, Y.Adachi, M.Nakano, H.Kobayashi, 2004 Production of transgenic lily plants by Agrobacterium-mediated transformation, Plant Cell Rep (2004) 22:359-364 75 Lơng Văn Mạnh Lớp CNSH 02-02 Phụ lục Phụ lục Thành phần môi trờng MS (1962) Thành phần nồng độ Nồng độ dung dịch mẹ (mg/l) (mg/l) Khoáng đa lợng 20X NH4NO3 1650 33000 KNO3 1900 38000 CaCl2.2H2O 440 8800 MgSO4.7H2O 370 7400 KH2PO4 170 3400 Fe-EDTA 100X FeSO4.7H2O 27,85 2780 Na2-EDTA.2H2O 37,25 3725 MnSO4.4H2O 22,300 2230,0 ZnSO4.7H2O 8,600 860,0 H3PO4 6,200 620,0 KI 0,830 83,0 Na2MoO4.2H2O 0,250 25,0 CuSO4.7H2O 0,025 2,5 CoCl2.6 H2O 0,025 2,5 Khoáng vi lợng 100X Các vitamin MS 100X Glycin 2,0 Acit nicotinic 0,5 200 50 76 Lơng Văn M¹nh Líp CNSH 02-02 Pyridoxin HCl 0,5 Thiamin HCl 1,0 50 100 Phụ lục Thành phần môi trờng YEP (An vµ ctv, 1988) Bacto pepton 10 g/l ChÊt trÝch nÊm men NaCl g/l Bacto Agar 15 g/l 10 g/l PH 7,0 (bằng NaOH) 77 Lơng Văn Mạnh Lớp CNSH 02-02 danh mục chữ viết tắt luận văn 2,4D Dichlorrophenoxyacetic acid BA benzyl adenin ĐC Đối chứng IAA Indol Axetic acid MS Murashige and Skoog, 1962 PPT Phosphinotricine 78 Lơng Văn Mạnh Lớp CNSH 02-02 Mục lục Phần 1: mở đầu Phần 1: mở đầu 1.1 Đặt vÊn ®Ị 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích, yêu cầu đề tài 1.2 Mục đích, yêu cầu đề tài PhÇn II PhÇn II Tỉng quan tµi liƯu Tỉng quan tµi liƯu 2.1 Giíi thiƯu chung vỊ c©y hoa lily 2.1 Giíi thiƯu chung vỊ c©y hoa lily 2.1.1 Nguån gèc 2.1.1 Nguån gèc 2.1.2 Vị trí phân loại thực vật 2.1.2 Vị trí phân loại thực vật 2.1.3 Đặc tính sinh vËt häc hoa lily 2.1.3 §Ỉc tÝnh sinh vËt häc hoa lily 2.1.4 Giá trị kinh tế giá trị sử dụng 2.1.4 Giá trị kinh tế giá trị sử dụng 2.1.5 Các loại sâu hại chủ yếu lily 2.1.5 Các loại sâu hại chủ yếu lily 2.2 CHUYểN GEN ë THùC VËT 2.2 CHUYÓN GEN ë THùC VËT 79 Lơng Văn Mạnh Lớp CNSH 02-02 2.2.1 Kh¸i niƯm vỊ kü tht chun gen 2.2.1 Kh¸i niƯm vỊ kü tht chun gen 2.2.2 Các phơng pháp chuyển gen vào thực vật .7 2.2.2 Các phơng pháp chuyển gen vào thực vật .7 2.2.2.1 Phơng pháp chun gen gi¸n tiÕp 2.2.2.2 Chun gen trùc tiÕp 2.3 Cơ sở khoa học phơng pháp chuyển gen vào thùc vËt nhê vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens .11 2.3 Cơ sở khoa học phơng pháp chun gen vµo thùc vËt nhê vi khn Agrobacterium tumefaciens .11 2.3.1 C¬ së khoa häc khả tái sinh thực vật .11 2.3.1 Cơ sở khoa học khả tái sinh thực vật .11 2.3.2 Khả chuyển nạp gen vi khuÈn Agrobacterium tumefacienns 15 2.3.2 Khả chuyển nạp gen vi khuẩn Agrobacterium tumefacienns 15 2.3.2.1 Ti-plasmid 17 2.3.2.2 Chức cña T-DNA 18 2.3.2.3 Chøc gen Vir 20 2.3.2.4 Cơ chế lây nhiễm 23 2.4 Tình hình chung phát triển trồng biến đổi gen toàn cầu .27 2.4 T×nh h×nh chung phát triển trồng biến đổi gen toàn cÇu .27 2.5 Nghiên cứu tái sinh chuyển gen hoa lily 30 2.5 Nghiên cứu tái sinh chuyển gen hoa lily 30 Phần 34 PhÇn 34 80 Lơng Văn Mạnh Lớp CNSH 02-02 vật liệu nội dung phơng pháp nghiên cøu .34 vËt liƯu néi dung vµ phơng pháp nghiên cứu .34 3.1 Vật liƯu nghiªn cøu .34 3.1 VËt liƯu nghiªn cøu .34 3.2 Néi dung nghiªn cøu 35 3.2 Néi dung nghiªn cøu 35 3.2.1 X©y dùng hƯ thống tái sinh 35 3.2.1 Xây dùng hƯ thèng t¸i sinh 35 3.2.2 Các nghiên cứu tiền chuyển gen 36 3.2.2 Các nghiên cứu tiền chuyển gen 36 3.2.3 Nghiên cứu chuyển gen lily Siberia 38 3.2.3 Nghiên cứu chuyển gen lily Siberia 38 3.3 Phơng pháp nghiên cứu .40 3.3 Phơng pháp nghiên cứu .40 3.4 ChØ tiªu theo dâi 42 3.4 ChØ tiªu theo dâi 42 3.5 Địa điểm thời gian thực 43 3.5 Địa điểm thời gian thực 43 3.6 Phơng pháp xử lý sè liÖu 43 3.6 Phơng pháp xử lý số liệu 43 PhÇn 44 PhÇn 44 KÕt qu¶ nghiên cứu thảo luận 44 Kết nghiên cứu thảo luận 44 4.1 X©y dùng hƯ thống tái sinh .44 4.1 Xây dùng hƯ thèng t¸i sinh .44 81 Lơng Văn Mạnh Lớp CNSH 02-02 4.1.1 Thí nghiệm ảnh hởng tổ hợp BA + 2,4D tới khả tái sinh vảy củ lily Siberia 44 4.1.1 ThÝ nghiƯm ¶nh hëng tổ hợp BA + 2,4D tới khả tái sinh cđa v¶y cđ lily Siberia 44 4.1.2 Thí nghiệm ảnh hởng tổ hợp BA + 2,4D tới khả tái sinh vẩy cđ lily Siberia (sau 24 ngµy) 46 4.1.2 ThÝ nghiệm ảnh hởng tổ hợp BA + 2,4D tới khả tái sinh vẩy củ lily Siberia (sau 24 ngày) 46 4.1.3 Nghiên cứu ảnh hởng nồng độ đờng đến khả tái sinh lily Siberia 50 4.1.3 Nghiªn cứu ảnh hởng nồng độ đờng đến khả t¸i sinh cđa lily Siberia 50 4.2 Các nghiên cứu tiền chuyển gen .55 4.2 Các nghiên cứu tiền chuyển gen .55 4.2.1 Nghiên cứu ảnh hởng kháng sinh cefotaxime đến tỷ lệ sống khả tái sinh mô vẩy củ 55 4.2.1 Nghiên cứu ảnh hởng kháng sinh cefotaxime đến tỷ lệ sống khả tái sinh mô vẩy củ 55 4.2.2 Nghiên cứu ảnh hởng PPT đến tỷ lệ sống khả tái sinh m« vÈy cđ lily 58 4.2.2 Nghiên cứu ảnh hởng PPT đến tỷ lệ sống khả tái sinh mô vẩy củ lily 58 4.2.3.Nghiên cứu ảnh hëng cđa PPT ®Õn tû lƯ sèng cđa chåi lily in vitro 60 4.2.3.Nghiên cứu ảnh hởng PPT đến tỷ lệ sèng cña chåi lily in vitro 60 4.3 Nghiªn cøu chun gen lily Siberia .62 4.3 Nghiên cứu chuyển gen lily Siberia .62 82 Lơng Văn Mạnh Lớp CNSH 02-02 4.3.1 Xác định môi trờng đồng nuôi cấy thích hợp vừa cho tái sinh mÉu cÊy lily ®ång thêi cho phÐp vi khuÈn sinh trởng phát triển 62 4.3.1 Xác định môi trờng đồng nuôi cấy thích hợp vừa cho tái sinh mẫu cấy lily đồng thời cho phép vi khuẩn sinh trởng phát triĨn 62 4.3.2 Nghiªn cứu ảnh hởng thời gian lây nhiễm đến khả phát triển vi khuẩn A.tumefaciens .65 4.3.2 Nghiên cứu ảnh hởng thời gian lây nhiễm đến khả phát triển vi khuẩn A.tumefaciens .65 4.3.3 Thư nghiƯm chun gen GUS cho v¶y cđ Siberia 66 4.3.3 Thư nghiƯm chun gen GUS cho v¶y cđ Siberia 66 4.4 Kết áp dụng quy trình chuyển gen nhê vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens dßng EHA 105 mang plasmid cã chøa gen gus, gen bar vµ gen cryIA(c) .67 4.4 Kết áp dụng quy trình chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dòng EHA 105 mang plasmid cã chøa gen gus, gen bar vµ gen cryIA(c) .67 4.4.1 Kết nuôi cấy phục hồi sau đồng nuôi cấy 68 4.4.1 Kết nuôi cấy phục hồi sau đồng nuôi cÊy 68 4.4.2 KÕt qu¶ chän läc mÉu sau phơc håi .69 4.4.2 KÕt qu¶ chän läc mÉu sau phơc håi .69 PhÇn 71 PhÇn 71 Kết luận đề nghị 71 Kết luận đề nghÞ 71 5.1 KÕt luËn .71 5.1 KÕt luËn .71 5.2 Đề nghị 72 83 Lơng Văn Mạnh Lớp CNSH 02-02 5.2 Đề nghị 72 Phần Tài liệu tham khảo 56 84 Phần Tài liệu tham khảo 56 84 PhÇn Phơ lơc……………….…………………………… ……………………… 58 .84 PhÇn Phơ lôc……………….…………………………… ……………………… 58 .84 Phần Tài liệu tham khảo 56 Phần Phô lôc……………….…………………………… ……………………… 58 84 ... toàn cha đợc đề cập Việt Nam Trong bối cảnh nêu tiến hành đề tài Nghiên cứu Agrobacterium phơng pháp chuyển gen tumefaciens vào lily nhằm tạo tiền đề cho việc tạo giống lily chuyển gen nớc ta 1.2... Việt Nam, việc nghiên cứu chuyển gen cho lily, đặc biệt vi khuẩn A .tumefaciens cha đợc đề cập Do nghiên cứu phơng pháp để xây dựng đợc quy trình chuyển gen vào hoa lily vi khuẩn A .tumefaciens hoàn... gen vào thực vật Có nhiều phơng pháp chuyển gen vào thực vật nhng phân loại thành hai nhóm phơng pháp chính: phơng pháp chuyển gen gián tiếp phơng pháp chuyển gen trực tiếp 2.2.2.1 Phơng pháp chuyển