Đang tải... (xem toàn văn)
PHẦN MỞ ĐẦU LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN NGÀNH ENZIM HỌC MỘT SỐ KHÁI NIỆM CHUNG Định nghĩa: xúc tác sinh học; bản chất protein; hoà tan trong nước và dung dịch muối loãng; phân tử lượng lớn. Đặc tính sinh học: Bị biến tính dưới tác dụng của các yếu tố làm biến tính protein Tính đặc hiệu xúc tác cao. Các enzim nguồn gốc tự nhiên không độc Cường lực xúc tác lớn Tác dụng trong điều kiện êm dịu Nguồn nguyên liệu thu enzim Nguồn động vật: dạ dày lợn (pepsin); dạ dày bê (renin); tuỵ tạng (pancreatin) Nguồn thực vật: nhựa đu đủ (papain); lá và vỏ dứa (bromelin); Nguồn vi sinh vật: vô cùng phong phú; thay đổi hệ enzim VSV bằng cách thay đổi điều kiện nuôi cấy; VSV sinh sản phát triển và STH enzim với vận tốc rất lớn; enzim có hoạt tính rất mạnh Các loại chế phẩm enzim sử dụng trong công nghiệp Chế phẩm enzim thô: nhận được sau lên men không qua tinh chế Chế phẩm enzim kỹ thuật: Chế phẩm nhận được sau khi đã tinh chế sơ bộ tách một số protein và enzim tạp Chế phẩm enzim tinh khiết: Chế phẩm enzim đã được loại bỏ hoàn toàn protein và enzim tạp Đơn vị hoạt độ (IU) Lượng enzim xúc tác chuyển hoá 1M cơ chất trong 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn Đơn vi Katal Lượng enzim xúc tác chuyển hoá 1M cơ chất trong 1 giây ở điều kiện tiêu chuẩn 1IU = 160 katal = 16,67 nkatal Hoạt độ riêng Số đơn vị hoạt độ enzim trên đơn vị khối lượng protein của chế phẩm IU hoặc katal 1 mg protein Hoạt độ phân tử Số phân tử cơ chất được chuyển hoá bởi một phân tử enzim trong 1 phút Hoạt độ tâm xúc tác Số phân tử cơ chất được chuyển hoá bởi một trung tâm hoạt động trong 1 phút Những điều lưu ý khi xác định hoạt độ enzim Tránh những yếu tố có thể gây biến tính protein enzim Enzim tồn tại bền vững và ổn định trong điều kiện phản ứng Lượng cơ chất được chuyển hoá khoảng 20 – 30% Thời gian xác định hoạt độ ngắn, nếu dài cần có các giải pháp tránh sự phát triển của VSV Làm mẫu kiểm chứng với enzim bị vô hoạt trước khi cho vào tiếp xúc với cơ chất Xác định thông số động học của chế phẩm enzim Một enzim cấu tạo gồm 2 dưới đơn vị giống nhau về trọng lượng phân tử 50kDa. Enzim xúc tác phản ứng: Ta có chế phẩm enzim chứa 3 mg proteinml và độ tinh khiết của enzim là 80%. Xác định hoạt độ được thực hiện bằng hấp thụ ánh sáng ở 512 nm. Đây là chiêu dài bước sóng mà sản phẩm phản ứng hấp thụ. Hệ số hấp thụ phân tử của sản phẩm là = 5000 mol1. L cm1.Môi trường phản ứng bão hoà cơ chất được điều chỉnh tới pH = 7,0 và duy trì nhiệt độ ở 30oC. Thể tích dịch là 3ml. Người ta sử dụng 100ml tách chiết enzim đã được pha loãng 500 lần. Để xác định dùng phương pháp 2 điểm, bằng cách bổ sung 2ml chất dừng phản ứng vào môi trường phản ứng sau 2 phút tiến hành. Sự thay đổi hấp thụ đọc được là 0,6uA. Đơn vị enzim được định nghĩa là lượng enzim có thể xúc tác thuỷ phân 1 M cơ chất trong 1 phút ở 30oC và pH = 7,0. Tính nồng độ hoạt độ enzim xúc tác trong chế phẩm và hoạt độ riêng. Từ đó rút ra hoạt độ phân tử và hoạt độ tâm xúc tác (Tun Over Number) ở 30oC và pH = 7,0. TÝnh to¸n TÝnh nång ®é ho¹t ®é xóc t¸c (theo ®¬n vÞ ml t¸ch chiÕt) TÝnh ho¹t ®é ®Æc hiÖu cña chÕ phÈm Ho¹t ®é t©m xóc t¸c cña enzim Qui trình xin phép sử dung chế phẩm Enzym mới v Nhµ s¶n xuÊt, Nhµ hoµn thiÖn s¶n phÈm vµ Nhµ kinh doanh. Ho¹t ®é enzym chÝnh, c¸c ho¹t ®é enzym phô, c¸ch thøc t¸c dông lªn c¬ chÊt, chÊt th¶i trao ®æi chÊt. §Æc tÝnh ho¸ chÝnh x¸c tæ chøc s¶n xuÊt hay c¸c tÕ bµo ®éng vËt, thùc vËt sö dông, d÷ liÖu vÒ taxonomiques vµ nhËn biÕt chÝnh x¸c chñng s¶n xuÊt. Trong trêng hîp biÕn ®æi gen: nguån gèc gen, ®o¹n codantes hay diÒu chØnh, vect¬, sù cã mÆt cña gen ®¸nh dÊu… Qui tr×nh thu nhËn chÕ phÈm enzim, kü thuËt t¸ch chiÕt vµ tinh chÕ. Thµnh phÇn cña chÕ phÈm, nh÷ng ®Æc ®iÓm riªng, phï hîp hay kh«ng víi luËt 5.09.89 TÝnh chÊt kh«ng ®éc cña chÕ phÈm vµ c¸c s¶n phÈm t¹o ra do t¸c dông cña enzim (hay c¸c enzim ®îc sö dông trong chÕ phÈm) vµ x¸c ®Þnh ®îc hÖ sè an toµn. CHƯƠNG 1. QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHUNG 1. VI SINH VẬT 1. Các tiêu chí lựa chọn vi sinh vật Không tạo độc tố Các chủng VSV dùng để sản xuất phải tuân theo luật quốc tế. Danh sách các chủng được phép sử dụng trong bảng “Generally recognized As Safe”. Không sinh độc tố thậm chí trong điều kiện thuận lơị cho QT này. Khả năng tách chiết Kết thúc quá trình lên men, tiêu diệt VSV này mà vẫn giữ nguyên hoạt độ enzim mong muốn. Ổn định gen Chủng giống phải được bảo quản và tái tạo mãi mà không có bất cứ lạc hướng nào trong quá trì
PHẦN MỞ ĐẦU LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN NGÀNH ENZIM HỌC MỘT SỐ KHÁI NIỆM CHUNG Định nghĩa: xúc tác sinh học; chất protein; hoà tan nước dung dịch muối lỗng; phân tử lượng lớn Đặc tính sinh học: Bị biến tính tác dụng yếu tố làm biến tính protein Tính đặc hiệu xúc tác cao Các enzim nguồn gốc tự nhiên không độc Cường lực xúc tác lớn Tác dụng điều kiện êm dịu Nguồn nguyên liệu thu enzim Nguồn động vật: dày lợn (pepsin); dày bê (renin); tuỵ tạng (pancreatin) Nguồn thực vật: nhựa đu đủ (papain); vỏ dứa (bromelin); Nguồn vi sinh vật: vô phong phú; thay đổi hệ enzim VSV cách thay đổi điều kiện nuôi cấy; VSV sinh sản & phát triển STH enzim với vận tốc lớn; enzim có hoạt tính mạnh Các loại chế phẩm enzim sử dụng công nghiệp Chế phẩm enzim thô: nhận sau lên men không qua tinh chế Chế phẩm enzim kỹ thuật: Chế phẩm nhận sau tinh chế sơ tách số protein enzim tạp Chế phẩm enzim tinh khiết: Chế phẩm enzim loại bỏ hoàn toàn protein enzim tạp Đơn vị hoạt độ (IU) Lượng enzim xúc tác chuyển hoá 1M chất phút điều kiện tiêu chuẩn Đơn vi Katal Lượng enzim xúc tác chuyển hoá 1M chất giây điều kiện tiêu chuẩn 1IU = 1/60 katal = 16,67 nkatal Hoạt độ riêng Số đơn vị hoạt độ enzim đơn vị khối lượng protein chế phẩm IU katal / mg protein Hoạt độ phân tử Số phân tử chất chuyển hoá phân tử enzim phút Hoạt độ tâm xúc tác Số phân tử chất chuyển hoá trung tâm hoạt động phút Những điều lưu ý xác định hoạt độ enzim Tránh yếu tố gây biến tính protein enzim Enzim tồn bền vững ổn định điều kiện phản ứng Lượng chất chuyển hoá khoảng 20 – 30% Thời gian xác định hoạt độ ngắn, dài cần có giải pháp tránh phát triển VSV Làm mẫu kiểm chứng với enzim bị vô hoạt trước cho vào tiếp xúc với chất Xác định thông số động học chế phẩm enzim Một enzim cấu tạo gồm đơn vị giống trọng lượng phân tử 50kDa Enzim xúc tác phản ứng: Ta có chế phẩm enzim chứa mg protein/ml độ tinh khiết enzim 80% Xác định hoạt độ thực hấp thụ ánh sáng 512 nm Đây chiêu dài bước sóng mà sản phẩm phản ứng hấp thụ Hệ số hấp thụ phân tử sản phẩm = 5000 mol-1 L cm-1 Môi trường phản ứng bão hoà chất điều chỉnh tới pH = 7,0 trì nhiệt độ 30 oC Thể tích dịch 3ml Người ta sử dụng 100ml tách chiết enzim pha loãng 500 lần Để xác định dùng phương pháp điểm, cách bổ sung 2ml chất dừng phản ứng vào môi trường phản ứng sau phút tiến hành Sự thay đổi hấp thụ đọc 0,6uA Đơn vị enzim định nghĩa lượng enzim xúc tác thuỷ phân M chất phút 30oC pH = 7,0 Tính nồng độ hoạt độ enzim xúc tác chế phẩm hoạt độ riêng Từ rút hoạt độ phân tử hoạt độ tâm xúc tác (Tun Over Number) 30oC pH = 7,0 Tính toán Tính nồng độ hoạt độ xúc tác (theo đơn vị/ ml tách chiết) Tính hoạt độ đặc hiệu chế phẩm Hoạt độ tâm xúc t¸c cđa enzim Qui trình xin phép sử dung chế phm Enzym mi v Nhà sản xuất, Nhà hoàn thiện sản phẩm Nhà kinh doanh Hoạt độ enzym chính, hoạt độ enzym phụ, cách thức tác dụng lên chất, chất thải trao đổi chất Đặc tính hoá xác tổ chức sản xuất hay tế bào ®éng vËt, thùc vËt sư dơng, d÷ liƯu vỊ taxonomiques nhận biết xác chủng sản xuất Trong tr-ờng hợp biến đổi gen: nguồn gốc gen, đoạn codantes hay diều chỉnh, vectơ, có mặt gen đánh dấu Qui trình thu nhận chế phẩm enzim, kỹ thuật tách chiết tinh chế Thành phần chế phẩm, đặc điểm riêng, phù hợp hay không với luật 5.09.89 Tính chất không độc chế phẩm sản phẩm tạo tác dụng enzim (hay enzim đ-ợc sử dụng chế phẩm) xác định đ-ợc hệ số an toàn CHNG QUI TRèNH SN XUẤT CHUNG 1 VI SINH VẬT Các tiêu chí lựa chọn vi sinh vật Không tạo độc tố Các chủng VSV dùng để sản xuất phải tuân theo luật quốc tế Danh sách chủng phép sử dụng bảng “Generally recognized As Safe” Không sinh độc tố chí điều kiện thuận lơị cho QT Khả tách chiết Kết thúc trình lên men, tiêu diệt VSV mà giữ nguyên hoạt độ enzim mong muốn Ổn định gen Chủng giống phải bảo quản tái tạo mà khơng có lạc hướng q trình ni cấy liên tục CÁC VI SINH VẬT VÀ ENZIM CHỦ YẾU SỬ DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP Danh mục vi sinh vật enzim liệt kê bảng 3.Phân lập, tuyển chọn cải tạo giống VSV Phân lập tuyển chọn giống VSV Được phân lập từ đất, nước, khơng khí, từ số thực vật từ sưu tập giống VSV có sẵn Tuyển chọn chủng VSV có khả sinh trưởng phát triển nhanh, sinh tổng hợp enzim mong muốn cao ổn định Với mục đích sử dụng CNTP, chế phẩm cần phải kiểm tra kỹ phương diện Độ độc Cải tạo giống VSV mục đích: Tăng hiệu suất tăng trưởng hoạt động đặc hiệu liên quan tới tổng hợp protein enzim Gây đột biến cấu trúc enzim enzim cảm ứng Cải thiện sức đề kháng tốt với sản phẩm chuyển hoá Đột biến tác nhân vật lý hoá học Các tác nhân vật lý: gồm có tia cực tím (tia tử ngoại) tia X (rơnghen), tia , bắn phá hạt nơtron, electron Trong thường sử dụng tia cực tím (UV) Các tác nhân hố học: hợp chất chứa nitơ như: nitrozometylguanidin, metyldicloroetylamin, nitrithydroxylamin, etylmetylsulfonat Đột biến phương pháp sinh học phân tử Phương pháp biến nạp: truyền ADN từ tế bào tế bào nhận xảy ống nghiệm cho tế bào nhận tiếp xúc với dịch chiết từ tế bào cho mà khơng cần có tiếp xúc trực tiếp tế bào Phương pháp tiếp hợp gen: vật liệu di truyền (ADN) truyền từ tế bào tế bào nhận hai tế bào tiếp xúc với nhau, VSV có khả biến nạp khơng có khả tham gia tiếp hợp gen Phương pháp tải nạp: vật liệu di truyền ADN chuyển từ tế bào tế bào nhận nhờ vai trò trung gian thực khuẩn thể (Phage) Trong trình tải nạp đoạn ADN chuyển từ tế bào tế bào nhận tiếp hợp với ADN tế bào nhận làm biến đổi tính chất di truyền tế bào nhận 2 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Các tiêu chí lựa chọn nguyên liệu Đáp ứng luật hiên hành nước tiên tiến: khơng có chất sát trùng, kháng sinh, thuốc trừ sâu, kim loại nặng … Nguồn cung cấp ổn định số lượng chất lượng suốt năm Giá rẻ bao gồm bảo quản vận chuyển Trong thực tế tất sản phẩm sử dụng làm môi trường thường lấy từ nhà máy nông sản thực phẩm Nguyên liệu môi trường lên men bao gồm : Nguồn cacbon: bột ngũ cốc, bột đậu, bột ngơ, khoai tây, cám mì cám gạo, tinh bột, maltodextrin, xenluloza, glucoza, sacaroza, … nguồn phi gluxit glyxerol, axit béo Nguồn nitơ: tách chiết nấm men, casein (13% nitơ), bột cá, khô lạc, khô đậu, sản phẩm thuỷ phân casein (nguồn nitơ hữu cơ) Các muối amôn nitrat … (nguồn nitơ vô cơ) Các muối vô cơ: mang lại lượng tối thiểu kim loại Mg, Ca, K, Fe, Mn, Zn … Photpho dạng muối photphat lưu huỳnh dạng muối sulfat Các chất tăng trưởng chất kích thích tăng trưởng: chất cảm ứng; coenzym (thiamin tăng sản xuất pyruvat cacboxylase); sản phẩm phản ứng enzym (maltodextrin aamylase, maltoza pullulanase) Chuẩn bị trùng môi trường Nguyên tắc chung Vệ sinh môi trường nuôi cấy phải trì thời điểm thu hồi VSV, xử lý tách enzim Không nên trùng tạo sản phẩm bất lợi cho tăng trưởng VSV tổng hợp enzim (phản ứng Maillard) Đối với phương pháp nuôi cấy bề mặt Gồm nguyên liệu tự nhiên: cám gạo, khô cám, cám mỳ, gạo, ngô (chiếm 90 – 95%) Bổ sung trấu nhỏ mùn cưa (5 – 10%) để làm xốp canh trường Trước gieo VSV, môi trường cần làm ẩm đến 50 – 65% trùng at 120oC để diệt VSV lạ, sau hạ nhiệt độ xuống 30 – 40oC tiến hành gieo cấy VSV Đối với phương pháp ni cấy chìm Dịch dinh dưỡng cho vào thùng lên men Sau đưa trực tiếp nước nống vào trùng nhiệt đô 118 – 125oC 45 – 60 phút Hạ nhiệt độ bổ sung VSV 3 QUÁ TRÌNH LÊN MEN Các phương pháp lên men sử dụng Ph-ơng pháp lên men bề mặt Nguyờn tc: s dng chất mang rắn, ni cấy VSV (thường nấm sợi)) Q trình ni cấy diễn thiết bị dạng giàn làm ẩm hay dạng thùng quay Ưu điểm: cho phép nâng cao hoạt lực enzim sản phẩmlên men Canh trường sau sấy khô vận chuyển dễ dàng Tránh nhiễm trùng toàn khối canh trường tốn điện Nhược điểm: suất thấp, không nâng cao suất thiết bị Tốn nhiều cơng lao động thủ cơng Khó điều chỉnh thành phần mơi trường Khó giới hố tự ng hoỏ Ph-ơng pháp lên men bề sâu Nguyờn tc: sử dụng môi trường lỏng thiết bị phản ứng để nuôi cấy VSV Tất thông số trình lên men kiểm tra điều chỉnh suốt trình Ưu điểm: Chủ động điều khiển q trình lên men Dễ giới hố, tự động hố Năng suất cao Có tính liên tục tiết kiệm diện tích sản xuất Sử dụng hợp lý chất dinh dưỡng môi trường độ đồng mơi trường lên men tốt, thuận lợi cho q trình tách chiết Nhược điểm: Nồng độ enzim canh trường thấp Phải cô đặc nên giá thành cao Tốn điện sục khí liên tục Khi khơng đảm báo vơ trùng tuyệt đối dễ bị nhiễm tồn mơi trường Q trình lên men 2.1 Khía cạnh sinh học Khi ni VSV tạo enzim có hai q trình liên quan mật thiết với nhau: sinh khối VSV tích tụ enzim Hai q trình khơng phải lúc trùng khớp mặt thời gian Theo lý thuyết đại vận tốc ST vận tốc STH enzim có mối tượng quan phụ thuộc Hai kiểu phụ thuộc trình này: Kiểu 1: vận tốc ST VSV hoàn toàn phù hợp xác với vận tốc STH enzim Kiểu 2: Sự không trùng khớp 02 giai đoạn xác định « tuổi thọ » axit ribonucleic thơng tin hay axit axit ribonucleic khuôn Theo lý thuyết q trình đồng hố dị hố Ba dạng biểu tương quan trình này: Dạng Dạng Dạng Dạng 1: Tăng trưởng VSV STH enzim đơi với (hình 1a) Enzim tạo nên đường dị hố, chất lên men chất cảm ứng enzim Dạng 2: sản xuất enzim liên tục, chí sau pha tăng trưởng (hình 1b) Enzim tạo nên đường dị hố, chất lên men chất cảm ứng enzim khác Dạng 3: Một giai đoạn lệch pha pha tăng trưởng VSV STH enzim (hình 1c) Enzim tạo nên đường đồng hố Sự kìm hãm ngừng lại nồng độ chất kìm hãm bị giảm xuống tăng trưởng VSV 2.2 Khía cạnh hố sinh Các tế bào VSV sử dụng oxy (3 – 10 oxy tinh khiết/ ngày/ thiết bị LM 100m3); sử dụng chất dinh dưỡng môi trường lên men Sản sinh sinh khối (tăng trưởng từ tới 108 – 10 ngày); CO2, nhiệt (2106kj/h); tiết sản phẩm trao đổi chất enzim 2.3.3 Phương pháp lên men liên tục Cung cấp NL rút dịch môi trường LM thực liên tục Điều chỉnh lưu lượng dòng chảy vào đảm bảo nhận nồng độ enzim mong muốn tối ưu ổn định 2.4 Các thông số vật lý sinh lý ảnh hưởng tới QTLM 2.4.1 Các thông số vật lý Nhiệt độ: Lượng nhiệt giải phóng đạt 2106kcal/h Cần phải làm nguội pH: pH phải điều chỉnh liên tục nhờ điện cực chất kiềm (NaOH, KOH, …) chất đệm photphat axit vô (photphoric, sulfuric…) Bọt: Khi khuấy trộn môi trường giàu protein sinh bọt Bổ sung chất chống tạo bọt dầu thực vật, động vật silicon Các chất ảnh hưởng không tốt tới vận chuyển oxy VSV Oxy hố mơi trường: thơng số đặc trưng đặc biệt khó điều khiển qui mơ cơng nghiệp Khó khăn chỗ cấu phần chung “lên men - thiết bị lên men” tuân theo luật tự nhiên khác nhau: QT vật lý (chuyển khối), QT sinh lý (các VSV), QT hỗn hợp có tương tác hai QT trên: Phương thức chuyển dịch: hệ thống cân tỷ lệ chuyển dịch oxy (TCO) tỷ lệ tuyến tính với nồng độ khác oxy bề mặt khí - lỏng Trong QTLM tồn tổng thể khuấy trộn - sục khí – mơi trường tương tác với giá trị hệ số chuyển dịch thể tích TCO = KLa (C* – CL) C* màng khí; CL pha lỏng; KLa hệ số chuyển dịch thể tích Tương tác với hình thái VSV: QTLM sợi nấm biểu thị biến đổi hình thái phức tạp Độ nhớt biểu kiến cao gây trở ngại cho chuyển khối Sự cọ xát có xu hướng phá vỡ sợi tốc độ ngoại vi đạt 5.10 m/s thiết bị LM có dung tích lớn Độ hồ tan oxy nước 25oC, áp suất 1at (oxy tinh khiết) 1,29mM (hoặc 0,041g/l) giảm xuống nhiệt độ tăng lên 2.4.2 Các thông số sinh lý Cân lượng: Một lượng lớn lượng phát tán dạng nhiệt cần phải loại bỏ hệ thống làm nguội thiết bị Cần phải hướng việc sử dụng lượng cho tổng hợp enzim Áp suất CO2: Khí CO2 có mặt tất QTLM với tỷ lệ dao động Nó đóng vai trị quan trọng phản ứng cacboxyl hoá tổng hợp vài loại enzim Trong trường hợp sục khí q mạnh khơng có lợi Áp suất O2: Oxy có tác dụng khác giai đoạn sinh trưởng hay tổng hợp enzim: Tổng hợp penicilinaxylase E coli: Tỷ lệ oxy hoà tan cao tạo điều kiện thuận lợi cho sinh trưởng, không thuận lợi cho STH enzim Tổng hợp glucooxydase Asp Niger: tăng áp suất oxy liên quan tới tăng độ tăng trưởng phân tiết đạt giá trị cực đại; lại giảm xuống tiếp tục tăng áp suất oxy Cảm ứng - ức chế: Trong số QTLM người ta cần chất cảm ứng Một số trường hợp khác phải tránh có mặt chất ức chế vào thời điểm ban đầu hay xuất chúng QTLM 4 QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT ENZIM 1Làm lạnh môi trường nuôi cấy QTLM kết thúc tới – 5oC Tránh vô hoạt enzim Tránh nguy nhiễm tạp VSV 2Phân tách pha chứa enzim Đối với enzim ngoại bào Điều chỉnh pH môi trường tới giá trị pH tối ưu enzim trì suốt QTTC Bổ sung chất trợ lắng bột diatomit, silic, xenluloza Phân tách vật liệu tế bào vật liệu khơng hồ tan: vi lọc, ly tâm, lọc màng Siêu lọc dung dịch protein vô trùng để thu nhận tối đa enzim mong muốn với ngưỡng cắt màng lưu lượng dòng chảy lựa chọn Nồng độ enzim nhận tăng 20 – 40 lần Đối với enzim nội bào Sự phân bố enzim tế bào VSV Cấu trúc thành tế bào VSV: bền vững cấu trúc thay đổi tuỳ theo loại VSV; cấu tạo peptido glucan Khu trú enzim cấu trúc vi thể tế bào VSV: Enzim ngoại bào: Enzim STH tế bào tiết bên ngồi mơi trường QTLM Enzim nội boà: Enzim STH sử dụng hoàn toàn bên tế bào Chúng tồn dạng liên hợp, dạng liên kết hay dạng “bị nhốt bào quan tế bào Enzim périplasmique: Enzim nzừm màng sinh chất bên tế bào Phân tách pha chứa enzim Phân giải tế bào sau dừng lên men chính: Các phương pháp phân giải tế bào: Tự phân Phân giải chế phẩm enzim (chitinase, mananase, protease…) Lysozim lòng trắng trứng Sốc áp suất thẩm thấu enzim periferique Sóng siêu tần (20 MHz) … Khi enzim giải phóng khỏi tế bào xử lý giống enzim ngoại bào 5 QUÁ TRÌNH TINH CHẾ ENZIM Thành phần dịch chứa enzim: nhiều loại enzim; protein; tạp chất khác Quá trình phân tách phân 03 giai đoạn: Giai đoạn 1: Trích ly cho phép nhận hỗn hợp phân tử dạng hồ tan có tính chất lý hố học gần Giai đoạn 2: Phân đoạn hỗn hợp dựa vào độ hoà tan khác để nhận họ phân tử Giai đoạn 3: Tinh phương pháp lý hoá học đặc hiệu sinh học tinh tế để nhận phân tử enzim tinh khiết 6 Q TRÌNH CƠ ĐẶC VÀ HỒN THIỆN SẢN PHẨM Cô đặc Siêu lọc: màng bán thấm dạng sợi xốp hay sợi màng; lọc áp suất cao (vài atm); phần tử nhỏ qua màng bán thấm (nước muối vô cơ) Làm bay nước áp suất thấp (cô đặc chân không) Làm bay nước nhiệt độ cao thời gian ngắn (sấy phun) Hoàn thiện sản phẩm Dạng bột: bổ sung chất để điều chỉnh nồng độ hoạt độ enzim chế phẩm Dạng lỏng: Bổ sung chất bảo quản NaCl, socbitol, glyxerol, benzoat 7 KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM CHƯƠNG MỘT SỐ CÔNG NGHỆ TÁCH CHIẾT ENZIM Các nguyên tắc chung Tách chiết enzim Làm cho tế bào trở nên thẩm thấu giải phóng enzim khỏi tâm gắn Phá huỷ thành tế bào, màng tế bào cấu trúc phân tử Khống chế mức độ phá vỡ để thuận lợi cho giai đoạn tinh chế sau Không làm biến tính enzim Q trình tách chiết thực nhiệt độ thấp Loại bỏ mảnh tế bào Loại bỏ toàn phần tử rắn, kết tủa axit nucleic, protein… Chọn phương pháp lọc ly tâm phụ thuộc vào qui mô SX chất chất rắn Loại bỏ axit nucleic Axit nucleic làm tăng độ nhớt môi trường Cần thiết phá huỷ hoàn toàn thành tế bào VSV CƠ SỞ CHUNG ĐỂ TRÍCH LY CÁC ENZIM Năng lượng cần thiết để phá vỡ tế bào phụ thuộc loại tế bào, trạng thái sinh lý tế bào Phương trình thể trình phá vỡ tế bào Ln.Pm/Pm-P=k.t Trong Pm: Lượng protein tối đa giải phóng P: Lượng protein giải phóng thời điểm xác định k: Hằng số tỷ lệ : Thời gian phá tế bào Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính enzim phá vỡ tế bào Nhiệt độ: cần loại bỏ lượng nhiệt sinh phá vỡ TB Bổ sung chất chất tương tự chất polyol làm bền enzim Lực cắt: lực cắt phá huỷ enzim; đặc biệt có mặt ion kim loại bề mặt phân tách với không khí pH: dung dịch đệm quan trọng việc ổn định hoạt lực enzim Hoá chất: chất tẩy rửa dung mơi gây biến tính enzim Chất chống oxy hoá: tác nhân khử axit ascorbic, mercapto etanol, ditiotreitol… cần thiết Chất tạo bọt: mặt phân cách lỏng – khí bọt phá huỷ hình thể enzim Kim loại nặng: ion đồng, sắt, niken… nhiễm vào từ thiết bị gây vô hoạt bất thuận nghịch enzim 2 CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ENZIM Các phương pháp học Phá vỡ tế bào sóng siêu âm Điều kiện: huyền phù VSV; sóng siêu tần 18KHz – 1MHz chuyển động hình sin với bước chuyển dịch nhỏ < 50m, vận tốc vài m.s-1, gia tốc lớn 80 000g Nguyên lý: Vô số vi bọt tạo thành, lớn dần lên xẹp xuống Bọt xẹp chuyển lượng âm thành lượng học gây sốc với áp suất hàng ngàn atm (300MPa) Giải pháp: Một lượng lớn lượng chuyển thành nhiệt, nên phải làm lạnh Sóng siêu âm dễ làm biến đổi cấu trúc enzim phá huỷ enzim oxy hoá gốc tự do, dùng N2O giảm tác dụng xấu Ưu điểm: phương pháp phổ biến, hữu ích, đơn giản, phù hợp với qui mô nhỏ Nhược điểm: pH, Nhiệt độ, lực ion MT huyền phù thời gian tác dụng có ảnh hưởng lớn Lạnh đơng nhả lạnh đơng Điều kiện: huyền phù VSV; làm lạnh đông -20oC, nén áp suất cao (10 – 15 tấn/inch vuông) qua lỗ hẹp máy nén Nguyên lý: Kết việc làm lạnh đông đột ngột tế bào đặc chất hồ tan nằm bên tế bào Sự hình thành tinh thể bên tế bào kéo theo việc phá vỡ tế bào Khi nén, tế bào bị phá vỡ thay đổi pha thay đổi thể tích, tác dụng lực cắt tinh thể đá Ưu điểm: phương pháp phổ biến, đơn giản, phù hợp với qui mô nhỏ Nhược điểm: suất thấp (10kg/h), thiết bị làm việc gián đoạn mẻ một, dễ làm biến tính enzim Nghiền hay đảo trộn với bột mài Điều kiện: huyền phù VSV; hạt thuỷ tinh (hoặc inox) đường kính 0,2 – 1,0mm Cùng thể tích viên bi, sử dụng hạt nhỏ cho hiệu tốt Số lượng viên bi tối ưu khoảng cách hai viên 0,22mm Nguyên lý: huyền phù tế bào đảo trộn với viên bi bị phá huỷ lực cắt chất lỏng cao, va chạm với viên bi Mức độ phá huỷ phụ thuộc vào tốc độ thời gian đảo trộn, nồng độ VSV, số lượng kích thước hạt Ưu điểm: phương pháp phổ biến, phá huỷ tế bào tất sinh khối tế bào dạng sợi đơn bào, đơn giản, suất tương đối cao đạt 340kg/h huyền phù sinh khối Nhược điểm: thiết bị làm việc gián đoạn mẻ một, hiệu suất phá vỡ tế bào không cao, dễ làm biến tính enzim Phá huỷ áp suất cao Điều kiện: huyền phù VSV; làm lạnh đông -25oC nén áp suất – 2,5 tấn/cm2 qua đĩa có kích thước lỗ 1,5 – 2,5mm Nhiệt độ máy trì khơng đổi nhờ dòng tác nhân lạnh glycol -25oC Nguyên lý: dư ới áp su ất l ớn huy ền phù t ế bào qua c ửa thoát s ẽ đư ợc phá v ỡ t ế bào Nhược điểm: su ất th ấp, thi ết b ị làm vi ệc gián đo ạn t ừng m ẻ m ột, d ễ làm bi ến tính enzim Đồng hố áp suất cao Điều kiện: huyền phù VSV bơm vào máy với áp suất 8000 – 20000PSI (150MPa; 10tấn/inch vuông) với lưu lượng 10 000l/h qua van xả có miệng hẹp, sau áp suất nhanh chóng đưa đến áp suất khí Nguyên lý: tế bào bị nén lại va chạm với nhau, sau nổ vỡ áp suất giảm đột ngột qua van nhân tó chủ yếu phá vỡ tế bào Protein giải phóng tương ứng với phản ứng bậc (đối với nấm men): Các phương pháp học Xử lý kiềm: pH môi trường pH = 11,5 – 12,5 cho phép thuỷ phân màng TB Kỹ thuật áp dụng cho enzim bền MT 20 – 30 phút (L asparaginase, pH = 12,0, = 20 phút) Sử dụng chất tẩy rửa: chất tẩy rửa dạng ion không liên kết với lipoprotein màng tạo mixen số điều kiện pH, lực ion, nhiệt độ làm cho màng TB trở nen thẩm thấu Chất tẩy ion laurylsulfat natri (CH3(CH2)10CH2-SO4-Na, Tween 20; chất tẩy không ion Triton X100 Sốc thẩm thấu: huyền phù TB môi trường ưa trương (dung dịch 20% sacaroza nước) 4oC tạo sốc thẩm thấu màng TB Kỹ thuật sử dụng cho vi khuẩn Gram âm để trích ly enzim periplasmic Khơng làm biến tính enzim, tinh chế enzim đơn giản Năng suất thấp 400 dm3 cho 10kg huyền phù TB Dung giải enzim: lysozim xúc tác thuỷ phân liên kết -1,4 glucozit peptidoglucan giữ vai trị trì độ cứng TB VK Sử dụng kết hợp lysozim với etilendiamin tetraaxetic axit (EDTA) để tạo phức với Ca làm giải phóng lipopolisacarit phá huỷ màng TB Lysozim lòng trắng trứng enzim dung giải sử dụng qui mô thương mại Kỹ thuật áp dụng qui mơ nhỏ KT thao tac giá thành cao Các phương pháp tách chiết dung môi Nguyên tắc tách chiết: Sau phá vỡ tế bào tiến hành tách chất protein enzim sở tính hồ tan Một dung mơi tách chiết tốt phải đảm bảo enzim hồ tan suốt q trình tinh chế có thay đổi tính đệm MT, T, pH Định luật Raoult: Các phân tử hồ tan dung mơi độc lập với Hai hướng luật là: Dương: tương tác CHT – CHT; DM – DM mạnh, CHT – DM yếu Âm: tương tác CHT – DM mạnh Hướng dương tương ứng tính tan yếu, hướng âm với tính tan mạnh Dung mơi tách chiết: Các dung mơi có cực dung dich muối vơ tương tác mạnh với enzim làm cho chúng trở nên hoà tan, nồng độ muối đậm đặc xảy tượng giảm tính hồ tan Các dung dịch có cực dung mơi hữu làm giảm ĐHT enzim Trong trường hợp tách chất hồ tan khơng phải protein khỏi enzim Dung môi hữu thường dùng butanol, axeton Các yếu tố ảnh hưởng: pH, nhiệt độ, số ion đặc hiệu CHƯƠNG CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH CHẾ ENZIM 1 LỊCH SỬ PHAT TRIỂN CỦA TINH CHẾ ENZIM Giai đoạn 1: dựa tính chất lý – hố học tác động lên chất phân tử lượng lớn Giai đoạn 2: Khai thác tính chất đặc trưng khác protein cầu Phân tách dựa thông số riêng trọng lượng phân tử, điện tích protein Giai đoạn 3: dựa tương tác đặc hiệu có tính rhuận nghịch enzim và: Cơ chất Coenzim Chất gắn Chất hoạt hoá 2 NGUYÊN TẮC CHỌN PHƯƠNG PHÁP TINH CHẾ ENZIM Xác định enzim mong muốn chọn nguyên liệu giàu enzim Xác định đặc trưng nguyên liệu: Bản chất NL: lỏng, rắn Dạng chung NL: động vật, thực vật, VSV Cấu trúc sinh học NL: tế bào VSV, tế bào thực vật Xác định vùng chứa enzim: ty thể, tế bào chất, màng tế bào Xác định tính chất cấu trúc lý hố enzim: trọng lượng PT, cấu trúc PT, số động học, tính ổn định PT, pH tối ưu, điểm đẳng điện, chất hoạt hố, chất kìm hãm… Phải có phương pháp giải phóng protein dạng hồ tan mà khơng làm hoạt tính Xử lý phải thực T thấp (+4OC); mơi trường có chất đệm; tác nhân bảo (nếu cần EDTA, 2-mecaptoetanol…); thời gian xử lý ngắn 3 CÁC PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA ĐỂ PHÂN ĐOẠN ENZIM Kết tủa phân đoạn muối trung tính Ngun tắc: Protein hồ tan dung dịch muối có pH xa với điểm đẳng điện Độ hoà tan P tăng với lực ion MT khoảng định [muối], Nồng độ muối cao protein enzim kết tủa Mối enzim có khoảng [muối] mà enzim kết tủa hồn tồn, gọi nồng độ muối tích Dựa vào tính tan khác mà phân đoạn enzim Cách tiến hành Bổ sung vào dịch chứa enzim thể tích muối bão hồ lượng muối trung tính dạng rắn để đạt độ phần trăm bão hoà muối Nếu kết tủa phần tử khơng phải enzim mong muốn tách hai pha lỏng rắn loại bỏ kết tủa thu hồi dịch Nếu enzim cần tinh chế kết tủa sau phân tách hai pha lỏng - rắn hoà tan kết tủa lượng nhỏ dung dịch đệm Loại muối cách tính lượng muối sử dụng Muối sulfat amôn muối sulfat natri: giá rẻ, khả kết tủa cao, độ hồ tan lớn, protein bị biến tính, thao tác đơn giản Các cơng thức tính lượng muối cần thiết đưa vào dung dịch sau: Y=100(S2-S1)/1-S2; A=0.1(S2-S1)G/1-S2(Vg/1000) Trong đó:G số gam (NH4)2SO4 1000ml dung dịch bão hoà (G = 515g 0oC; 530,7g 15oC; 536g 20oC Vg thể tích riêng biểu kiến dung dịch (NH4)2SO4 bão (Vg/1000 = 0,271 0oC; Vg/1000 = 0,288 15oC; Vg/1000 = 0,29 20oC Cơng nghiệp dược: tăng độ hồ tan, độ bền, độ hấp thụ, giảm tác dụng phụ thuốc Sử dụng CD SX thuốc giảm đau, chống nhiễm trùng, chống di ứng, lợi tiểu… Nông nghiệp: tăng độ bền, độ hồ tan hố chất bảo vệ thực vật thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu, thuốc trừ nấm… Sử lý mầm ngũ cốc với b-CD tăng suất trồng Công ngiệp mỹ phẩm: tăng độ ổn định, độ hồ tan kiểm sốt hương thơm sản xuất kem đánh (tricloran - chất kháng khuẩn), kem dưỡng da (giảm khả kích ứng da), giấy vệ sinh Sử dụng CD sản phẩm khử mùi thể sản phẩm chăm sóc tóc làm giảm khả bay mercaptan có mùi khó chịu Trong phân tích: CD sử dụng để làm phối tử cho pha tĩnh sắc ký điện di, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lực… Trong xử lý môi trường: CD sử dụng để loại bỏ chất ô nhiễm hữu nước thải, loại bỏ dư lượng chất bảo vệ thực vật ô nhiễm nước CHƯƠNG Ứng dụng chế phẩm enzim CNTP • Enzim điều chỉnh khiếm khuyết tự nhiên nguyên liệu: Chất lượng nguyên liệu nông sản phụ thuộc vào yếu tố thời tiết, điều kiện kỹ thuật canh tác, loại trồng… Sử dụng nguyên liệu khác thay nguyên liệu Enzim thể nguyên liệu bị vô hoạt xử lý công nghệ: trùng • Enzim công cụ công nghệ trình chuyển hố: Sản xuất đường glucoza từ tinh bột Sản xuất rượu bia Sản xuất phomat Enzim công cụ nâng cao giá trị nguyên liệu: – Sản xuất đường rượu từ tinh bột – Sản xuất cyclodextrin từ tinh bột – Sản xuất bia sử dụng nguyên liệu thay malt đại mạch • Enzim cơng cụ cải thiện chất lượng sản phẩm: – Izomerase cải thiện độ giảm khả hấp thu glucoza – Papain (protease) tăng độ mềm thịt – Protease trung tính tăng chất lượng gluten bột mì • Enzim cơng cụ tăng giá trị phụ phẩm chế biến thực phẩm – Sản phẩm thuỷ phân làm chất độn giống thịt – Sản phẩm thuỷ phân nước hầm xương thịt – Sản phẩm thức ăn gia súc từ phụ phẩm nhà máy chế biến thuỷ hải sản 2 TIÊU CHÍ CHỌN ENZIM TRONG CƠNG NGHIỆP THỰC PHẨM • Độ hoạt động enzim Mối quan hệ điều kiện sử dụng đặc tính chế phẩm: pH môi trường pH tối ưu enzim Nhiệt độ môi trường với hoạt lực enzim Thời gian tác dụng enzim Sự có mặt chất hoạt hố kìm hãm enzim Ảnh hưởng chất bổ sung q trình cơng nghệ • Tính đặc hiệu enzim Xác định tính đặc hiệu enzim điều kiện công nghệ ứng dụng Xác định hoạt tính phụ chế phẩm • Điều kiện ứng dụng chế phẩm enzim Lựa chọn chế phẩm enzim dựa chất lượng liều lượng chế phẩm enzim sử dụng Mức độ thay đổi dây chuyền công nghệ sử dụng chế phẩm Khả cung ứng chế phẩm enzim 3 ỨNG DỤNG CÁC CHẾ PHẨM ENZIM TRONG CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỊT CÁ Hệ enzim protease Định nghĩa Enzim thuộc hệ xúc tác thuỷ phân liên kết peptit peptit protein theo phản ứng sau: -CH-C-N-CH- + H2O -CH-C-OH + HN-CHR O H R’ R O H R’ Phân loại Theo nhóm chức hoạt động chủ yếu TTHĐ Nhóm Đặc điểm TTHĐ pHopt Protease xerin Xerin Kiềm Protease tiol -SH 7,0 – 7,5 Protease kim loại Kim loại hố trị Trung tính Protease axit -COOH axit Theo tính đặc hiệu Aminopeptidase xúc tác thuỷ phân LK đầu nitơ Cacboxypeptidase xúc tác thuỷ phân LK đầu cacboxyl Dipeptit hydrolase xúc tác thuỷ phân dipeptit Peptidil hydrolase xúc tác thủ phân LK peptit nội mạch Công nghệ làm mềm thịt Chế phẩm papain: chứa enzim protease đơn cấu tử, TTHĐ chứa nhóm –SH tồn 02 dạng + 2H Pa – S – S – Pa PaSH + PaSH - 2H Dạng oxy hố (khơng hoạt động) Dạng khử (Hoạt động) Ổn định pH = 5,0 o o - Nhiệt độ hoạt động tối ưu: 40 – 50 C, vô hoạt vượt 80 C - Hoạt hoá tác nhân khử: hỗn hợp cystein 0,05M EDTA 0,001M cho kết tốt - Không hoạt động có mặt chất oxy hố Muối làm mềm thịt: 30g papain/ kg muối ăn Tiêm chế phẩm enzim trước giết mổ Tiêm chế phẩm enzim sau giết mổ Tăng giá trị sản phẩm phụ thịt - Sản phẩm thuỷ phân làm chất độn giống thịt nước hầm xương Mục đích cơng nghệ Bổ sung chất thuỷ phân cho phép nhận sản phẩm đồng Nhờ tính keo dính chất thuỷ phân, khối thịt nhận sau phối trộn không tiết nước, dễ cắt miếng Tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân bố hương vào khối thịt Phối trộn với loại rau thơm để tăng hương vị loại súp sấy khơ, đóng hộp, loại nước sốt… Sản xuất protein thực vật thuỷ phân Sản phẩm thuỷ phân dùng thay sữa mẹ Chế phẩm enzim sử dụng Flavourzym Nguyên liệu thuỷ phân cazein protein lúa mì Mức độ thuỷ phân 50% Sản xuất nước chấm mazi Sử dụng chế phẩm enzim công nghệ chế biến cá Sản xuất nước mắm o Sử dụng Bromelin (0,8%, cofactơ cystein 0,025M): lên men 33 C 21 ngày Sản phẩm nhận có vị đắng Sử dụng hỗn hợp trypsin chymotrypsin (50:50; 0,3%): lên men 37oC 02 tháng Sản phẩm nhận giữ hương vị theo yêu cầu nước mắm sản xuất theo phương pháp truyền thống Sản xuất bột cá nhạt Sử dụng chế phẩm enzim công nghệ chế biến sữa Đông tụ sữa sản xuất phomat Sử dụng chế phẩm Renin chứa protease tách chiết từ dịch vị dày bò non Thuỷ phân casein K vị trí Phe 105 – met 106 tạo phần khơng hồ tan paracassein K +2 Khi > 85% casein K thuỷ phân với có mặt ion Ca chúng tụ tập lại tạo gel đơng tụ Thúc đẩy q trình lên men phomat Bổ sung enzim trực tiếp vào sữa tươi Phân bố đồng enzim trình tạo vẩy Protease hoà tan nước phần lớn enzim bổ sung nằm lại sữa Tạo thuỷ phân protein sớm nên tạo nhiều peptit đắng q trình ủ chín Bổ sung enzim trực tiếp vào phomat vẩy sữa Khó phân bố đồng enzim toàn khối vấy sữa Bổ sung enzim bao bọc vào sữa Protease gói liposom, đường kính bao 0,2 – 4,5 m Protease giải phóng dần nhờ thuỷ phân liposom vẩy sữa Tránh thuỷ phân sớm protein Ứng dụng số chế phẩm enzim khác Lactase (-D-galactozit galactohydrolase) xúc tác thuỷ phân lactose thành glucose galactose: giảm mức độ kết tinh làm tăng độ sữa có nồng độ cao Glucooxydase xúc tác oxy hoá glucoza thành axit gluconic, giảm pH tạo nên kết tủa đẳng điện casein cho ta sản phẩm sữa chua đặc Glucoizomerase xúc tác đồng phân hoá glucoza thành fructoza tạo sản phẩm sữa Lactoperoxydase (LP) nằm hệ thống sát khuẩn (LTP): Lactoperoxydase - thioxyanat - hydroxyperoxyt LP SCN + H2O2 OSCN- + H2O Thiocyanat Hydroperoxyt Hypothiocyanit • Một lít sữa bị chứa 10 – 30 mg LP Khơng phải yếu tố kìm hãm hệ thống • H2O2 tích tụ thơng qua chuyển hố oxygen số loại vi khuẩn Lactococcus Cần bổ sung vào sữa tươi • Thiocyanat (SCN ) dao động – 10 ppm sữa bò Cần bổ sung vào sữa tươi dạng muối thiocyanat Hợp chất pectin Khối lượng phân tử pectin thường dao động từ 20.000 tới 200.000 phụ thuộc vào nguồn pectin Vai trò hợp chất pectin Tính chất lý hố học tế bào Khả giữ nước Khả tách chiết dịch Trong dung dịch có ảnh hưởng tới khả lọc đặc Phân loại Protopectin: có cấu tạo hoá học phức tạp Protopectin chứa phân tử pectin; xenluloza; ion Ca, Mg; gốc axit photphoric, axetic đường khử Protopectin tạo độ cứng cho xanh Pectin hay pectin hoà tan: este metilic hợp chất axit polygalacturonic cao phân tử Pectin tự nhiên có khoảng 2/3 nhóm cacboxyl metoxy hố Mức độ metoxy hoá cao tạo khả tạo gel dung dịch có nồng độ đường 65% mơi trường axit Axit pectinic: phân tử axit polygalacturonic cao phân tử phần nhỏ nhóm cacboxyl este hoá metanol Axit pectic: phân tử axit polygalacturonic cao phân tử giải phóng hồn tồn khỏi nhóm metoxy Nghĩa có nhóm cacboxyl tự đơn vị axit galacturonic Hệ enzim pectinase Enzim xúc tác phân giải hợp chất pectin, làm giảm khối lượng phân tử giảm độ nhớt dung dịch chứa pectin Phân loại hệ enzim pectinase Enzim phân giải vùng “trơn bóng” Enzim thuộc nhóm phân giải đoạn mạch chứa chuỗi polygalacturonic Người ta phân chúng thành 03 nhóm nhỏ: pectinesterase; polygalacturonase transeliminase Pectinesterase (Pectimetylhydrolase; PE): enzim thuộc nhóm xúc tác thuỷ phân đề metoxy hoá hợp chất pectin Sản phẩm thuỷ phân hợp chất metanol gốc cacboxyl tự xuất chuỗi mạch polygalacturonic Cơ chế xúc tác: Đặc tính sinh hố Enzim thu nhận từ nấm mốc, vi khuẩn thực vật Enzim từ nấm mốc có pHopt= 4,5 – 5,5; Topt = 30 – 45oC Tth= 55 – 60oC Enzim tác dụng tới nhóm metoxy cách ngẫu nhiên Enzim từ thực vật có pHopt = 5,0 – 8,0 Enzim tác dụng lên nhóm metoxy đứng cạnh gốc có nhóm cacboxyl tự Hoạt độ enzim tăng lên có mặt ion Ca+2 Mg+2 Cơ chế tác dụng Transeliminase (TE) Enzim thuộc nhóm phân cắt phi thuỷ phân hợp chất pectin với việc tạo nối kép gốc galacturonic nguyên tử cacbon số số đầu không khử vừa giải phóng Cơ chế tác dụng SƠ ĐỒ PHÂN LOẠI ENZIM PECTINASE Enzim phân giải vùng “gai góc” Enzim phân giải vùng nhánh pectin tạo nên từ khung xương Rhamnogalacturonic mang nhóm axetyl mạch bên trung tính (arabinoza hay galactoza) Rhamnogalacturonase: enzim thuộc nhóm thuỷ phân liên kết glucozit Rhamnoza axit galacturonic giải phóng oligome Enzim sinh tổng hợp từ nấm mốc, đặc biệt từ Aspergillus Esterase: Enzim thuộc nhóm xúc tác thuỷ phân liên kết nhóm axetyl với vùng Rhamnnogalacturonic giải phóng axetyl Arabinase: Enzim phân giải cách ngẫu nhiên liên kết a-1,5 hai gốc arabinoza nằm đoạn arabinan giải phóng monome-; dime- trime arabinoza Galactanase: Enzim thuỷ phân liên kết nối gốc galactoza bên mạch galactan arabinogalactan loại I loại II Enzim sinh tổng hợp từ nấm mốc thực vật Ứng dụng chế phẩm enzim pectinase Công nghệ chế biến rau Một số chế phẩm enzim pectolytic Pectinex Ultra- SPL Sản xuất từ chủng chọn lọc Asp Niger Màu thẫm, mùi thơm đặc trưng sản phẩm lên men Chứa chủ yếu enzim pectinase có hoạt tính định hemixenlulase Enzim xúc tác phân huỷ màng tế bào thực vật giải phóng dịch khỏi khoang tế bào Sử dụng trình xử lý nguyên liệu để ép tách dịch Pectinex 3XL Pectinex AR Sản xuất từ chủng chọn lọc Asp Niger Màu thẫm, mùi thơm đặc trưng sản phẩm lên men Chứa chủ yếu enzim pectinase, Có khả thuỷ phân hồn tồn araban thành arabinoza; thuỷ phân hoàn toàn hợp chất polysacarit Sử dụng trình xử lý làm dịch Ép chiết dịch Phá vỡ thành tế bào quả, tạo điều kiện cho dịch ngồi, tăng hiệu suất thu hồi dịch Phá huỷ sâu tế bào tạo điều kiện trích ly chất màu chất thơm quả, tăng giá trị cảm quan sản phẩm ép Phân cắt hợp chất pectin làm giảm độ nhớt dịch ép tạo thuận lợi cho trình lọc ép thu hồi dịch làm dịch ép Ngâm dầm ổn định nectar Nectar loại nước uống đậm đặc có độ nhớt cao, chứa lượng lớn hợp chất dạng huyền phù, đặc biệt hợp chất pectin Pectin có độ metoxy hố thấp kết hợp với canxi tạo kết tủa pectat canxi, làm giảm chất lượng sản phẩm Cần sử dụng chế phẩm enzim PMG, tránh có mặt enzim PE để tăng độ hoà tan hợp chất pectin hiệu suất xúc tác enzim PG Dịch hoá - nước đục Nước đục chứa hợp chất hoà tan thịt Đòi hỏi phá vỡ triệt để thành tế bào Cần có tác dụng đồng thời pectinase xenlulase Để đảm bảo độ đồng thể dịch cần có độ nhớt cao Khơng phân cắt nhỏ hợp chất pectin Không sử dụng chế phẩm enzim endo-PG Cần có tác dụng đồng thời enzim TE, xenlulase hemixenlulase Làm dịch Nguyên tắc làm trong: phẩn tử gây đục dịch cấu thành protein (ở pH dịch quả) tích điện dương bao quanh lớp pectin tích điện âm Khi phân huỷ pectin giải phóng phần protein tích điện dương Phần tương tác tĩnh điện với pectin tích điện âm tạo kết tủa Kết tủa phần tử gây đục chia làm 03 giai đoạn: Giai đoạn bất ổn: giảm độ nhớt sâu sắc, gọi trạng thái phá vỡ Giai đoạn kết lắng: trạng thái phá vỡ đên kết tủa hoàn toàn Giai đoạn cuối cùng: kết thúc giai đoạn pectin phân, đặc trưng vắng mặt kết tủa pectin với canxi Xử lý enzim hợp chất gluxit chế biến nước A: Pectinase hỗ trợ ép B: pectinase hỗ trợ chiết rút C: Pectinase + xenlulase D: Pectinase làm Một số chế phẩm enzim thương mại Termamyl 120L Chế phẩm dạng lỏng, màu nâu, chứa enzim -amilase sản xuất từ vi khuẩn Bacillus licheniformis Sản phẩm thuỷ phân chứa chủ yếu dextrin phân tử lượng thấp Chế phẩm chứa enzim chịu nhiệt: Topt = 95oC, Tth = 105oC pHopt = 6,0 – 6,5 Độ bền hoạt lực enzim tăng lên có mặt ion Ca+2: [Ca+2]opt = 50 – 70 ppm Bảo quản chế phẩm T = 25oC hoạt tính enzim trì thời gian tháng; 5oC hoạt tính trì năm Fungamyl 800L Chế phẩm dạng lỏng, màu nâu, chứa enzim -amilase sản xuất từ nấm mốc Aspergillus oryzae Sản phẩm thủy phân chứa nhiều maltoza Nhiệt độ thích hợp cho enzim hoạt độ Topt = 55 - 60oC pHopt = 4,5 – 6,0 Độ bền hoạt lực enzim thay đổi có mặt ion Ca+2: Bảo quản chế phẩm T = 25oC hoạt tính enzim trì thời gian tháng; 5oC hoạt tính trì năm Sansuper Chế phẩm dạng lỏng, màu nâu, chứa enzim -amilase sản xuất từ nấm mốc Aspergillus oryzae; ngoai chuas cac enzim phu -milase va protease Sản phẩm thủy phân chu yeu la glucose Nhiệt độ thích hợp cho enzim hoạt độ Topt = 50 - 55oC pHopt = 5,5 – 6,0 Bảo quản chế phẩm T = 25oC hoạt tính enzim trì thời gian tháng; 5oC hoạt tính trì năm Maturex 200L Chế phẩm dạng lỏng, màu xám, chứa enzim -axetolactat decacboxylase sản xuất từ vi khuẩn Bacillus subtillis Enzim xúc tác decacboxyl hóa axetolactat thành axetoin Nhiệt độ thích hợp cho enzim hoạt độ Topt = 30 - 35oC Khoảng pH hoạt động pH = 4,5 – 6,0 pHopt = 6,0 Bảo quản chế phẩm 5oC hoạt tính trì tháng Ứng dụng sản xuất bia Ý nghĩa cơng nghệ Có thể nâng cao tỷ lệ gạo thay malt đại mạch, giảm chi phí đơn vị sản phẩm Linh động việc lựa chọn nguyên liệu thay Kiểm sốt tốt cải tiến qui trình nấu Ổn định nâng cao chất lượng bia Giảm thời gian sản xuất, nâng cao suất thiết bị Những cơng đoạn cơng nghệ có sử dụng enzim Dịch hóa nguyên liệu phụ: Sử dụng chế phẩm Termamyl 120L Bổ sung chế phẩm từ hòa bột gạo: thủy phân tinh bột sống, enzim phụ protease Không cần giai đoạn hạ nhiệt độ sau nâng tới nhiệt độ hồ hóa gạo: enzim chịu nhiệt Kiểm sốt nồng độ ion Ca nước hòa bột: độ bền hoạt lực enzim Liều lượng sử dụng: 0,5 kg/tấn nguyên liệu phụ Đường hóa: pH khối dịch điều chỉnh pH = 5,5 Dừng T = 52oC cho protease malt thủy phân protein giải phóng peptit axit amin Với chất lượng malt sử dụng tỷ lệ nguyên liệu thay cao bổ sung chế phẩm Neutrase 0,5L Liều lượng 0,3 – 0,5 kg/tấn malt Trong công đoạn để giảm thời gian lọc dịch đường sử dụng chế phẩm Cereflo 200L nhờ độ nhớt khối dịch giảm Liều lượng 0,5 – kg/ malt Dừng T = 65oC cho b-amilase malt thủy phân tinh bột để tạo đường lên men maltose Các dextrin phân tử lượng cao đượctạo giai đoạn Dừng T = 72oC cho a-amilase thủy phân nốt tinh bột dextrin vừa tạo thành trở thành dextrin phân tử lượng thấp Lên men Bổ sung chế phẩm Malturex 200L giảm thời gian lên men – ngày Liều lượng – kg/ 1000 lít dịch đường Có 03 phương pháp bổ sung Malturex: Trộn chung vào thùng men giống bơm vao thiết bị lên men Trộn trực tiếp tren đường ống dẫn dịch đường lạnh vao thiết bị lên men Trộn chung với dịch đường trước vào máy lạnh nhanh Nếu chất lượng dịch đường sử dụng chế phẩm Fungamyl 800L vào giai đoạn để tăng hiệu suất lên men Liều lượng – g/ hl Cải thiện trình lọc bia tránh đục bia sử dung chế phẩm Finizym Liều lượng 0,5 – 1,0 kg/ 1000 lít bia NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT TINH BỘT BIẾN HÌNH CĨ DE=25-35 BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYM RESEARCH ON THE PRODUCTION OF STARCH MODIFIED CONTAINING DE= 25-35 BY ENZIM METHOD TRƯƠNG THỊ MINH HẠNH Trường Đại học Bách khoa, Đại học Đà Nẵng TĨM TẮT Bài báo trình bày kết nghiên cứu biến hình tinh bột phương pháp enzim Với việc sử dụng enzim Termamyl 120L Veron M4 dạng nguyên liệu tinh bột (TB) sống TB hồ hóa, chọn qui trình thủy phân thích hợp kinh tế loại enzim Bằng phương pháp qui hoạch thực nghiệm (QHTN) tối ưu hóa, tìm thông số công nghệ tốt để sản xuất TB biến hình có DE= 25- 35 TB biến hình thu bước đầu ứng dụng làm chất tạo gel sản xuất loại mứt đơng có kết tương đối khả quan ABSTRACT This paper presents research results of the modification of starch by enzym method By using two enzyms Termamyl 120L and Veron M4 on two different forms materials, live and gelatinised starchs, the most approprivate and economical hydrolic process is specified The experiment design and optimisation methods are also applied to find out the best technology parameters to procedure modified starch having DE= 25-35 This starch is being applied quite well in first step as the gel-creating subtance in the production a lot of jams GIỚI THIỆU Biến hình tinh bột tức biến đổi cấu trúc, tính chất tinh bột (TB) để mang lại cho TB nhiều tính chất mới, nâng cao hiệu sử dụng hiệu kinh tế Nhờ thành tựu công nghệ sinh học, ngày chế phẩm enzim từ vi sinh vật thay thành công chất xúc tác axit cơng nghệ thủy phân TB Biến hình tinh bột enzim α- amilaza phương pháp biến hình sinh học có nhiều ưu điểm phản ứng nhanh, cơng nghệ đơn giản gị bó, khơng độc hại sử dụng thực phẩm cách an toàn Ngoài ra, phân cắt tinh bột đặc hiệu, tạo sản phẩm đặc thù sử dụng nhiều ngành CN đặc biệt CN thực phẩm, làm chất phụ gia để sản xuất bánh kẹo, thực phẩm cho trẻ em, thực phẩm ăn kiêng thực phẩm dùng để truyền trực tiếp cho bệnh nhân nặng, làm chất ổn định cho dạng nước quả, kem, sữa chua v.v [3] NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu Nguyên liệu củ huỳnh tinh củ khoai lang mua thành phố Huế sản xuất phịng thí nghiệm để thu nhận TB huỳnh tinh TB khoai lang Enzym Termamyl 120L hãng Novo- Đan Mạch enzym Veron M4 Đức 2.2 Phương pháp nghiên cứu - Xác định số “DE” phương pháp Fericyanua [4] - Xác định hàm lượng TB thật phương pháp Ewers [4] - Xác định hàm lượng amyloza phương pháp Balagobalan [5] - Xác định độ nhớt hồTB nhớt kế mao quản [2] KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát số tính chất nguyên liệu TB huỳnh tinh TB khoai lang - Quan sát kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 1000 lần thấy TB huỳnh tinh gồm hầu hết hạt lớn có dạng hình elip, trơn nhẵn TB khoai lang gồm hạt hình bầu dục số hạt hình trịn có kích thước nhỏ TB huỳnh tinh - Độ nhớt TB huỳnh tinh nhỏ nhiều lần so với TB khoai lang chứng tỏ TB khoai lang có trọng lượng chiều dài mạch phân tử lớn TB huỳnh tinh - Hàm lượng amyloza TB khoai lang (28,3%) nhỏ TB huỳnh tinh (41,2%) 3.2 Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình biến hình TB 3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ TB, nồng độ enzym thời gian đến trình biến hình TB enzym Veron M4 Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ TB, nồng độ enzym thời gian đến trình biến hình TB phương pháp QHTN TĐY23 Để có sở số liệu, chúng tơi thực số thí nghiệm thăm dị Kết thí nghiệm thăm dị ảnh hưởng nồng độ enzim thời gian biến hình enzym Veron M4 tinh bột hồ hóa thể hình hình Chỉ số DE 35 30 25 20 15 10 Tinh bột khoai lang Tinh bột huỳnh tinh 50 100 150 200 Thời gian biến hình (phút) Hình Ảnh hưởng thời gian biến hình đến số DE Chỉ số DE 30 25 Tinh bột khoai lang huỳnhbột tinh Tinh huỳnh tinh 20 15 10 0.2 0.4 0.6 0.8 Nồng độ enzym (%) Hình Ảnh hưởng nồng độ enzym đến số DE Nhận xét: - Trong trình biến hình, nồng độ enzym thời gian biến hình tăng số DE TB tăng tức khả phân cắt mạch TB lớn Nhưng DE tăng đến giới hạn định sau tăng khơng đáng kể lúc nồng độ enzym bão hồ với nồng độ chất Thời gian tăng làm hoạt lực enzim giảm nên mức độ biến hình tăng lên khơng đáng kể - TB huỳnh tinh có mức độ cắt mạch lớn TB huỳnh tinh có kích thước hạt lớn hơn, cấu trúc hạt xốp, độ nhớt thấp nên enzim xâm nhập tiến hành thủy phân dễ dàng TB khoai lang Với kết trên, mơ hình thực nghiệm trình bày bảng Chọn mức yếu tố thủy phân cho TB sống lẫn TB hồ hoá để tiện so sánh kết tiến hành thực nghiệm theo mô hình TĐY23 cho bảng Bảng Các mức yếu tố Các mức Không thứ nguyên X1 (%) 30 Mức sở ( X 0j ) Khoảng biến thiên ( j ) Mức (+) Mức (-) 33 27 Các yếu tố Không thứ X2 (%) nguyên 0.30 0.15 0.45 0.15 + - + - X3 (phút) 70 Không thứ nguyên 30 100 40 + - Trong X1, X2, X3 nồng độ TB, nồng độ enzym thời gian biến hình TB Bảng Kết xác định số DE TB huỳnh tinh khoai lang enzym Veron M4 STT T1 T2 T3 x0 + + + + + + + + + + + Trong đó: x1 + + + + 0 x2 + + + + 0 x3 + + + + 0 y1 0,57 1,02 0,76 1,45 1,58 2,98 2,45 3,36 2,66 2,74 2,76 y2 20,25 25,07 23,89 26,16 28,85 33,20 31,19 33,72 30,56 30,46 30,45 y3 0,63 1,25 0,96 1,69 1,52 3,48 2,23 4,36 2,65 2,55 2,35 y4 20,78 24,50 23,35 25,00 23,64 33,14 32,48 33,80 30,65 30,46 30,32 T1,T2,T3 thí nghiệm tâm y1, y2: số DE thuỷ phân TB sống TB hồ hoá huỳnh tinh y3, y4: số DE thuỷ phân TB sống TB hồ hoá khoai lang Kết bảng mơ tả phương trình hồi quy sau: Giả sử phương trình hồi quy mơ tả thực nghiệm có dạng [1]: Y = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3 + b12x1x2 + b13x1x3 + b23x2x3 + b123x1x2x3 Qua tính tốn phương trình hồi quy mơ tả gần với thực nghiệm nói lên ảnh hưởng yếu tố đến trình phân cắt mạch TB là: Y1 = 1,771 + 0,234x1 + 0,431x2 + 0,821x3 + 0,146x2x3 - 0,091x1x2x3.(I) Y2 = 27,791 + 0,949x1 + 1,746x2 + 3,949x3 – 0,546x1x2 – 0,234x1x3.(II) Y3 = 2,015 + 0,295x1 + 0,68x2 + 0,883x3 +0,342x1x3 (III) Y4 = 28,14 + 0,62x1 + 0,97x2 + 4,73x3 – 0,33x1x2 – 0,37x2x3 (IV) Từ phương trình hồi quy, nhận thấy loại TB huỳnh tinh khoai lang kết DE thu thuỷ phân TB sống nhỏ nhiều so với TB hồ hố Do chúng tơi chọn phương trình Y2 Y4 (sử dụng phương pháp thuỷ phân TB hồ hoá) để tối ưu 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ TB, nồng độ enzym thời gian biến hình đến trình biến hình TB enzym Termamyl 120L Qua tham khảo số tài liệu [5], dựa vào hoạt lực enzym Termamyl sở số thí nghiêm thăm dị chúng tơi chọn thơng số kỹ thuật giống với thơng số biến hình enzym Veron M4 để tiến hành thực nghiệm theo mô hình TĐY 23 Kết cho bảng Bảng Kết xác định số DE TB huỳnh tinh khoai lang enzym Termamyl 120L STT T1 T2 T3 Với x0 + + + + + + + + + + + x1 + + + + 0 x2 + + + + 0 x3 + + + + 0 y5 15,82 19,90 17,91 21,40 23,81 28,20 27,14 30,83 26,66 26,63 26,57 y6 17,05 21,33 18,51 23,67 25,89 30,36 28,63 32,95 27,24 27,13 27,25 y7 15,80 22,80 19,77 21,79 20,32 26,80 25,44 30,09 27,94 28,50 28,32 y8 16,22 22,83 20,40 27,35 21,00 27,09 25,98 30,25 28,65 28,86 29,05 y5, y6: số DE thuỷ phân TB sống, hồ hoá TB huỳnh tinh y7, y8: số DE thuỷ phân TB sống, hồ hoá TB khoai lang Các phương trình hồi quy tính được: Y5 = 23,126 + 1,194x1 + 1,956x2 + 4,369x3 – 0,161x1x2 + 0,296x1x3 (V) Y6 = 24,799 + 1,141x1 + 2,279x2 + 4,659x3 + 0,191x1x3 – 0,129x1x2x3 (VI) Y7 = 22,85 + 1,42x1 + 2,52x2 + 2,80x3 – 0,85x1x2 + 0,67x1x3 (VII) Y8 = 23,89 + 2,12x1 + 2,9x2 + 2,19x3 – 0,4x2x3 (VII) Từ phương trình hồi quy trên, thấy DE thu thuỷ phân TB sống TB hồ hoá hai loại nguyên liệu khơng có khác biệt lớn Do chúng tơi chọn qui trình thủy phân tinh bột sống tiến hành tối ưu hóa (Y5, Y7) 3.2.3 Tối ưu hố q trình biến hình TB enzym để thu DE lớn Do phương trình hồi quy tìm khơng tuyến tính nên chúng tơi tiến hành tối ưu theo phương pháp tìm cực trị cách giải phương trình chương trình Excel solver Kết thu là: y2max = 33,45; y4max = 33,65; y5max = 30,80; y7max = 29,43 tương ứng với giá trị X1 = 33(%); X2 = 0,45(%); X3 = 100 (phút) Dựa vào kết trên, nhận thấy với thông số kỹ thuật, hai loại tinh bột, thuỷ phân enzym Veron M4 DE thu lớn thuỷ phân enzym Termamyl Trong thuỷ phân TB khoai lang sống enzym Veron M cho DE lớn thuỷ phân TB huỳnh tinh Đối với enzym Termamyl ngược lại, TB huỳnh tinh cho giá trị DE lớn khoai lang 3.4 Ứng dụng TB biến hình ứng dụng để thay cho pectin (là chất tạo gel sản phẩm mứt đông) với mục đích giảm giá thành, chủ động nguồn nguyên liệu giảm lượng đường thực đơn Kết bước đầu thu khả quan, khả tạo gel sản phẩm tinh bột huỳnh tinh tốt tinh bột khoai lang Quy trình sản xuất mứt dứa: Nghiền Dứa Phân loại Rửa Bảo quản Gọt vỏ, cắt mắt Cắt nhỏ Thanh trùng Đường Định lượng Rót hộp Phối chế Nấu mứt TB biến hình Thực đơn sản xuất: - Purê quả: 0,7kg - Đường: 0,3kg - TB biến hình: 0,0075kg (7,5g) KẾT LUẬN - Đã xây dựng phương trình hồi qui mơ tả ảnh hưởng yếu tố nồng độ enzim, nồng độ tinh bột thời gian đến trị số DE trình biến hình tinh bột enzim Veron M4 Termamyl hai phương pháp thuỷ phân tinh bột sống tinh bột hồ hóa - Bằng phương pháp tối ưu hóa chọn điều kiện công nghệ tốt để sản xuất tinh bột biến hình TB có số DE max Giá trị tốt là: nồng độ TB 33%, nồng độ enzym 0,45% so với chất thời gian biến hình 100 phút - Đã chọn quy trình biến hình phù hợp với loại enzym: enzym Veron M4 tốt dùng phương pháp thủy phân TB sống enzym Termamyl phương pháp thuỷ phân TB hồ hố - Kết ứng dụng tinh bột biến hình cho sản phẩm mứt dứa đơng có hàm lượng đường thấp triển vọng TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] [2] [3] [4] [5] [6] Nguyễn Cảnh, Quy hoạch thực nghiệm, Đại học Bách khoa TP Hồ Chí Minh, 1993 Trương Thị Minh Hạnh, Nghiên cứu dạng biến hình tinh bột hoa màu ứng dụng công nghiệp thực phẩm, Luận án Tiến sĩ Khoa học Kỹ thuật, Đà Nẵng, 2003 Lê Ngọc Tú (chủ biên), Lưu Duẩn, Đặng Thị Thu, Lê Thị Cúc, Lâm Xuân Thanh, Phạm Thu Thuỷ, Biến hình sinh học sản phẩm từ hạt, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 2000 Hà Duyên Tư (chủ biên), Quản lý kiểm tra chất lượng thực phẩm, Đại học Bách khoa Hà Nội, 1996 Các cơng trình nghiên cứu ứng dụng cơng nghệ sinh học công nghiệp thực phẩm (giai đoạn 1986-1995), Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, 1996 Balagopalan C and Padmaja G., Cassava in Food, Feed and Industry, CRC Press Inc.Boca Raton, Florida, 1988 ... công cụ công nghệ q trình chuyển hố: Sản xuất đường glucoza từ tinh bột Sản xuất rượu bia Sản xuất phomat Enzim công cụ nâng cao giá trị nguyên liệu: Sản xuất đường rượu từ tinh bột Sản xuất cyclodextrin... cơng nghệ q trình chuyển hố: Sản xuất đường glucoza từ tinh bột Sản xuất rượu bia Sản xuất phomat Enzim công cụ nâng cao giá trị nguyên liệu: – Sản xuất đường rượu từ tinh bột – Sản xuất. .. toàn đường Sản xuất loại bánh ngọt: Tăng khả giữ nước, tránh khô bánh nhanh Sản xuất kem: Ngăn cản trình tạo tinh thể, cải thiện chất lượng sản phẩm cấu trúc kem Ứng dụng công nghệ sản xuất bánh
