Chế tạo hạt nano vàng gắn kháng thể ứng dụng cho phát hiện nhanh viruts cúm a luận văn ths vật liệu và linh kiện nanô

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ PHẠM VĂN ĐỒNG CHẾ TẠO HẠT NANO VÀNG GẮN KHÁNG THỂ ỨNG DỤNG CHO PHÁT HIỆN NHANH VIRUS CÚM A LUẬN VĂN THẠC SĨ Hà Nội – 2010 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ PHẠM VĂN ĐỒNG CHẾ TẠO HẠT NANO VÀNG GẮN KHÁNG THỂ ỨNG DỤNG CHO PHÁT HIỆN NHANH VIRUS CÚM A Chuyên ngành: Vật liệu Linh kiện Nanô (Chuyên ngành đào tạo thí điểm) LUẬN VĂN THẠC SĨ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS CHU HOÀNG HÀ Hà Nội – 2010 MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan hạt nano kim loại .3 1.2 Hiệu ứng cộng hưởng Plasmon bề mặt hạt nano kim loại 1.3 Các loại hạt nano ứng dụng y sinh học 1.3.1 Các hạt nano kim loại 1.3.2 Các hạt nano cấu trúc lõi/vỏ 1.3.3 Hạt nano từ tính 1.3.4 Chấm lượng tử 1.4 Hạt nano vàng 1.5 Các phương pháp chế tạo hạt nano vàng 1.5.1 Phương pháp Turkevich 10 1.5.2 Phương pháp Brust 11 1.5.3 Phương pháp Perrault 11 1.5.4 Phương pháp Martin 11 1.5.5 Phương pháp rung siêu âm (sonolysis) 12 1.6 Các ứng dụng y sinh học AuNPs 12 1.6.1 Đánh dấu sinh học 13 1.6.2 Phân phát thuốc chuyển gen 13 1.6.3 Sensor sinh học 14 1.7 Kit chẩn đoán bệnh que thử nhanh 14 1.7.1 Giới thiệu 14 1.7.2 Sơ đồ nguyên lý que thử nhanh 15 1.8 Kháng thể 17 1.8.1 Giới thiệu chung 17 1.8.2 Giới thiệu vùng biến đổi kháng thể (Single Chain Variable Fragmet-scFv) 18 1.9 Bệnh cúm gia cầm A/H5N1 19 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .22 2.1 Vật liệu 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Phương pháp chế tạo dung dịch nano vàng (AuNPs) 22 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu nhân tố ảnh hướng đến chất lượng mẫu 25 2.2.2.1 Thời gian phản ứng 25 2.2.2.2 Thay đổi lượng chất khử Na3C6H5Na3 25 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu kích thước, hình thái cấu trúc hóa học AuNPs 26 2.2.3.1 Phân tích phổ hấp thụ UV 26 2.2.3.2 Phân tích hiển vi điện tử quét (SEM) 27 2.2.3.3 Phân tích phổ hấp thụ hồng ngoại FTIR 28 2.2.4 Phương pháp gắn kháng thể kháng virus cúm A/H5N1 lên bề mặt hạt nano vàng 30 2.2.4.1 Tìm pH tối ưu cho phản ứng gắn kháng thể nano vàng 30 2.2.4.2 Tạo phức hợp kháng thể gắn bề mặt hạt nano vàng (kháng thể/nano vàng) 31 2.2.5 Phương pháp phát virus cúm A/H5N1 sử dụng phức hợp kháng thể/nano vàng 32 2.2.5.1 Thiết kế que thử nhanh đơn giản 32 2.2.5.2 Kiểm tra hoạt động phức hợp kháng thể/nano vàng 33 2.2.5.2.1 Kiểm tra Dot blot 33 2.2.5.2.2 Phương pháp que thử nhanh 34 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Kết chế tạo hạt nano vàng 36 3.1.1 Kích thước, hình thái 36 3.1.2 Phân tích thành phần EDX 38 3.1.3 Đặc trưng quang học AuNPs 38 3.1.4 Cấu trúc hóa học AuNPs 39 3.1.5 Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng AuNPs 40 3.1.5.1 Thời gian phản ứng 40 3.1.5.2 Thay đổi lượng chất khử natri citrate 41 3.1.5.3 Thời gian điều kiện bảo quản hạt AuNPs 42 Tạo phức hợp AuNPs gắn kháng thể cúm A 43 2.1 pH tối ưu cho phản ứng gắn kháng thể/nano vàng 43 2.2 Tìm lượng kháng thể thích hợp cho phản ứng gắn 44 3.3 Kiểm tra phát virus cúm A/H5N1 phức hợp kháng thể/nano vàng .48 3.3.1 Kết phát kháng nguyên virus cúm A Dot blot 48 3.3.2 Kết kiểm tra thử nghiệm que thử đơn giản 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .51 TÀI LIỆU THAM KHẢO .52 PHỤ LỤC 57 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT SEM quét Scanning Electron Microscopy Kính hiển vi điện tử FTIR Fourier Tranform Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại UV Ultraviolet photospectroscopy Phổ UV AuNPs Gold nanoparticles Hạt nano vàng SPR Surface Plasmon Resonance BSA Bovine serum albumin Cộng hưởng Plasmon bề mặt Huyết bò DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1 Những cốc Lycurgus (Roman ~ 400 AD, Myth of King Lycurgus) làm thủy tinh có pha thêm hạt nano vàng bạc Cốc xuất màu xanh phản xạ, màu đỏ ánh sáng truyền qua Hình 1.2 Hiện tượng Plasmon bề mặt mặt phân cách kim loại điện mơi Hình 1.3 Hình 1.4 Hình 1.5 Hình 1.6 Đỉnh hấp thụh Plasmon bị dịch chuyển thay đổi tác nhân bọc xung quanh hạt A) Các dung dịch nano vàng (AuNPs) nano bạc (AgNPs) chế tạo theo phương pháp Turkevich B) Phổ hấp thụ UV tương ứng dung dịch Các hạt nano chấm lượng tử với kích thước khác tía cực tím (trên) điều kiện ánh sáng thường (dưới) (A) Vàng khối nguyên chất dạng khối từ quặng (B) Hạt nano vàng kích thước 15nm (C) dung dịch nano vàng Faraday chế tạo năm 1850 8 Hình 1.7 Dung dịch chứa hạt nano vàng kích thước tăng dần (từ trái qua) [62] Hình 1.8 Phản ứng tạo hạt nano vàng theo Turkevich Hình 1.9 AuNPs có nhiều ứng dụng sinh học, bao gồm phép nhuộm đặc hiệu, phân phát thuốc DNA vào tế bào 12 Hình 1.10 Mơ hình que thử nhanh [63] 15 Hình 1.11 Một mẫu que thử nhanh thương mại sử dụng hạt nano vàng 16 Hình 1.12 17 Cấu Trúc kháng thể Hình 1.13 Sơ đồ tạo scFv 19 Hình 2.1 Sơ đồ phản ứng hóa học tạo hạt nano vàng theo phương pháp khử Turkevich 23 Hình 2.2 Kích thước hình dạng hạt nano vàng theo thời gian phản ứng khoảng thời gian t=10giây đến t=120giây 23 Hình 2.3 Sơ đồ máy đo phổ hấp thụ UV/vis hai chùm tia 27 Hình 2.4 Sơ đồ minh họa cấu tạo kính hiển vi điện tử qt 27 Hình 2.5 Mơ hình máy quang phổ FTIR 29 Hình 2.6 Quy trình gắn kháng thể với hạt nano vàng 31 Hình 2.7 Mơ hình que thử nhanh với hai vạch kháng thể (test line control line) 33 Hình 2.8 Mơ hình tiến hành thí nghiệm Dot Blot để kiểm tra hoạt động phức hợp kháng thể/nano vàng 34 Hình 2.9 Mơ hình thí nghiệm que thử nhanh: Que thử gắn vạch kháng thể nhúng vào dung dịch chứa phức hợp kháng thể/nano vàng 35 Hình 3.1 Ảnh SEM AuNPs (A, B) phân bố kích thước hạt (C) 37 Hình 3.2 Phổ phân tích thành phần vật liệu EDX mẫu nano vàng 38 Hình 3.3 Phổ hấp thụ dung dịch AuNPs 39 Hình 3.4 Phổ hồng ngoại (FTIR) AuNPs 39 Hình 3.5 Phổ hấp thụ UV mẫu vàng khoảng thời gian phản ứng khác 40 Hình 3.6 Phổ hấp thụ mẫu dung dịch AuNPs theo bảng với hàm lượng citrate khác 42 Hình 3.7 Phổ hấp thụ mẫu AuNPs ban đầu sau thời gian 60 ngày 43 Hình 3.8 Sự thay đổi màu dung dịch với lượng kháng thể gắn pH khác từ trái sang từ pH - pH 11 43 Hình 3.9 Phổ hấp thụ dung dịch nano vàng trước (đường a ) sau gắn kháng thể (đường b) 44 Hình 3.10 Phổ hấp thụ FTIR mẫu nano vàng không gắn kháng thể (A) mẫu sau gắn kháng thể lên bề mặt (B) 46 Hình 3.11 Các hạt AuNPs trước (A) sau gắn kháng thể (B) 46 Hình 3.12 (A) Từ trái sang với mẫu gắn lượng protein thay đổi từ (1 -100 µl kháng thể nồng độ 100µg/ml 1ml dung dịch AuNPs) (B) Phổ hấp thụ mẫu sau bổ sung dung dịch NaCl để kích thích kết tủa dung dịch 48 Hình 3.13 Kết kiểm tra Dot Blot với nồng độ kháng nguyên khác cố định màng 48 Hình 3.14 Vạch kháng thể kháng virus cúm A cố định màng nitrocellulose bắt hạt kháng thể/nano vàng tập hợp thành vạch Vạch quan sát dễ dàng mắt thường sau thời gian kiểm tra từ 5-10 phút 49 MỞ ĐẦU Cúm gia cầm (Avian influenza) bệnh truyền nhiễm cấp tính lồi chim, có gia cầm thủy cầm, phân týp (subtype) nhóm virus cúm A (Influenza virus A) thuộc họ Orthomyxoviridae gây nên Chủng virus cúm A/H5N1 phát lần gây bệnh dịch gà Scotland vào năm 1959 Cúm A/H5N1 virus có độc lực cao, gây bệnh người vụ dịch cúm gà năm 1996 - 2008, đặc biệt ác liệt virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao (HPAI, highly pathogenic avian influenza) gây kể từ năm 2003 phát sinh nhiều dịng (sublineage) nhóm/phân nhóm (clade) có độc lực cao Theo thống kê tổ chức Y tế giới (WHO), tính đến tháng 10 năm 2010, tổng số ca mắc cúm A/H5N1trên giới lên tới 507, đó, 302 trường hợp tử vong Trong đó, Việt Nam Indonesia quốc gia có số người nhiễm tử vong cao virus cúm A/H5N1 gây nên Để ngăn chặn lây lan bệnh có biện pháp điều trị kịp thời việc chẩn đốn nhanh xác cúm A/H5N1 cần thiết Chẩn đoán phát nhanh virus cúm trường đồng thời tiến hành công tác dập dịch công việc quan trọng Hiện có thiết bị chẩn đốn nhanh loại bệnh dịch với thời gian kiểm tra nhanh cho kết đáng tin cậy que thử nhanh Đây thiết bị chẩn đoán thiết kế dựa nguyên tắc sắc ký miễn dịch đặc hiệu (immunochromatographic assays), sử dụng phổ biến cho xét nghiệm nhanh từ cuối năm 1980 Que thử nhanh phát triển việc sử dụng hạt nano vàng loại hạt khác kích thước nano dạng huyền phù gắn kháng thể đơn dịng Trong thiết bị này, hạt kích thước nano sử dụng cho việc đánh dấu quang học, đóng vai trị sensor màu dùng để phát tồn chất có mẫu thử Que thử nhanh cho phép phát nhiều đối tượng bao gồm kháng nguyên, kháng thể, chí kiểm tra tồn loại hợp chất khác Que thử nhanh tiện dụng, thân thiện với người dùng, giá thành sản xuất thấp tính linh hoạt cao sử dụng, sử dụng phạm vi rộng, không bệnh viện trung tâm y tế đại Công nghệ nano trở thành lĩnh vực hứa hẹn cho nhiều ứng dụng khoa học đời sống Công nghệ nano sinh học tạo sản phẩm khả ứng dụng to lớn lĩnh vực dược phẩm, y sinh Trong loại vật liệu nano nay, hạt nano vàng (AuNPs) loại vật liệu nano nghiên cứu rộng rãi Với kích thước khoảng 10- 100 nm, hạt nano vàng tạo hiệu ứng cộng hưởng plasmon đặc trưng tác động photon Các hạt nano vàng gắn với phân tử sinh học, trở thành sản phẩm với nhiều ứng dụng lĩnh vực y sinh học, chẩn đoán điều trị tế bào ung thư [7, 48] đặc biệt công nghệ chế tạo loại kit chẩn đoán nhanh loại bệnh truyền nhiễm [14] Ở Việt Nam nay, việc ứng dụng loại vật liệu nano lĩnh vực nghiên cứu quan tâm, đặc biệt công tác chẩn đoán chữa trị loại bệnh nguy hiểm Bệnh cúm A bệnh truyền nhiễm nguy hiểm gây nên nhiều đợt dịch người gia cầm thời gian vừa qua Chính thế, việc nâng cao hiệu quả, rút ngắn thời gian chẩn đốn, qua góp phần cho cơng tác phịng chống bệnh kịp thời đóng góp quan trọng việc dập tắt đợi đại dịch Để có sở lý thuyết thực nghiệm cho việc chủ động chế tạo kit chẩn đoán dựa ưu điểm vật liệu nano, góp phần đóng góp cho cơng tác phịng chống ngăn ngừa lây lan virus cúm A/H5N1 Việt Nam, thực đề tài: “Chế tạo hạt nano vàng (AuNPs) gắn kháng thể ứng dụng cho phát nhanh virus cúm A” Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu ứng dụng thử nghiệm việc chế tạo vật liệu nano vàng có gắn kháng thể kháng virus cúm A bước đầu tiến hành việc phát nhanh virus cúm A/H5N1 Nội dung nghiên cứu + Chế tạo hạt nano vàng (AuNPs) + Nghiên cứu đặc tính vật lý hóa học hạt nano vàng chế tạo + Nghiên cứu chế tạo phức hợp hạt nano vàng gắn kháng thể + Ứng dụng hạt nano vàng gắn kháng thể để phát có mặt virus cúm A/H5N1 thời gian dài mà không cần đến tủ lạnh, điều mang lại hiệu khu vực thiếu thốn thiết bị 1.7.2 Sơ đồ nguyên lý que thử nhanh Que thử nhanh bao gồm có phận (Hình 1.10): Hình 1.10 Mơ hình que thử nhanh [63] Nguyên lý chung que thử nhanh dựa chuyển động mẫu chất lỏng qua khu vực dùng để phát hiện, phân tử phản ứng đặc hiệu với chất phân tích cho tín hiệu màu Một que thử nhanh điển hình bao gồm có: màng, sample pad, conjugate pad adsorbent pad mơ tả hình 1.9 Màng chế tạo từ nitrocellulose [35, 46], nylon [6], polyethersulfone [21], polyethylene [22] Dạng màng phổ biến sử dụng nitrocellulose với kích thước ống nhỏ màng 0.05 đến 12 µm Sample pad gắn phần cuối màng thường làm từ cellulose cross-linked silica Conjugate pad đặt vị trí tiếp xúc với sample pad màng Chất dùng để đánh dấu thành phần dùng cho việc nhận biết mẫu phân tích làm khơ khu vực này, tương tác đặc hiệu với vật liệu có mẫu phân tích lỏng Các chất đánh dấu cho việc phát hạt nano vàng (Au), hạt latex khô [15], selenium, carbon, liposome [59] Việc sử dụng hạt nano công bố lần Leuvering cộng [30] vào năm 1980 ngày chúng sử dụng phổ biến cho việc đánh dấu Đối với việc phân tích đối tượng cụ thể, hai vạch cố định lên màng: vạch kiểm tra (test line) cho kết kiểm tra vạch kiểm soát (control line) dùng để xác nhận chất phân tích chảy qua màng phân tích Đối với phép kiểm tra cho nhiều đối tượng khác nhau, sử dụng nhiều vạch kiểm tra khác Chất 15 lỏng di chuyển ngược lên màng lực mao dẫn màng dừng lại absorbent pad đầu cuối màng Hình 1.11 Một mẫu que thử nhanh thương mại sử dụng hạt nano vàng Khi kháng thể sử dụng cho việc phát bệnh mẫu, phép thử gọi “lateral flow immunoassays” Chúng dùng để kiểm tra xem có hay khơng bệnh mẫu Những năm gần đây, que thử nhanh trở nên thiết bị phân tích hữu hiệu có sẵn thị trường cho việc phát loại hormone, virus, hợp chất độc hại, chất làm rối loạn trao đổi chất Hai dạng thiết kế phổ biến sử dụng Kiểu sandwich (possitive assay) thiết kế cho mẫu phân tích có nhiều epitope phát hệ thống miễn dịch, đặc biệt kháng thể Đối với kiểu định dạng này, vạch kiểm tra sử dụng kháng thể đơn dòng cường độ chúng tương ứng trực tiếp với lượng chất cần phân tích có mẫu Thứ hai, kiểu cạnh tranh (negative assay) thiết kế với chất cần phân tích có khối lượng phân tử nhỏ 1000 Da có epitope Vạch kiểm tra phép phân tích kháng thể kháng lại chất cần phân tích (anti-analyte antibody) chất gắn kết chất phân tích-protein (analyte-protein conjugates) Kết vạch kiểm tra đậm màu khơng có mặt có chất cần phân tích mối quan hệ nghịch đảo nồng độ chất cần phân tích hình thành chất mầu Chẩn đoán dùng que thử nhanh giúp giảm thiểu thời gian kiểm tra, mang lại sử thuận tiện hướng tới thị trường Hơn kiểu mơ hình kiểm tra cho tín hiệu mạnh hơn, thời gian kiểm tra ngắn so với phép kiểm tra khác dựa nguyên lý miễn dịch miễn dịch phóng xạ (radioimmunoassay), miễn dịch liên kết enzyme (enzyme linked immunoassay) 16 1.8 Kháng thể 1.8.1 Giới thiệu chung Kháng thể phân tử immunoglobulin (Ig) có huyết động vật có vú, có khả liên kết đặc hiệu với kháng ngun kích thích sinh Kháng thể có chất protein bị biến tính tác nhân hóa học, hóa lý sinh học Hình 1.12 Cấu Trúc kháng thể Tất dạng kháng thể có cấu tạo giống hay nhiều đơn vị monomer tạo thành, có dạng hình chữ Y Đơn vị phân tử kháng thể gồm chuỗi polyleptit hai chuỗi nặng có trọng lượng phân tử lớn (2H) hai chuỗi nhẹ có trọng lượng phân tử lượng thấp (2L) nối với liên kết cộng hóa trị (-S-S-) liên kết khơng cộng hóa trị Chuỗi nặng gồm vùng biến đổi VH, vùng đa dạng D, vùng liên kết JH vùng cố định CH chuỗi nhẹ có VL, JL CL Một cặp chuỗi nặng có vùng V-DJ chuỗi nhẹ V-J tạo nên vị trí bám kháng thể nơi nhận diện vị trí gắn kết kháng ngun Kháng thể có hai đặc tính hữu dụng: tính đặc hiệu tính ghi nhớ Tính đặc hiệu thể việc loại kháng thể liên kết công loại kháng nguyên định Loại kháng thể gọi kháng đơn dòng Kháng thể đơn dòng chủ yếu ứng dụng việc chẩn đốn bệnh Hai cơng trình tiêu biểu số nhiều cơng trình mà sử dụng kháng thể đơn dịng chẩn đốn là: Gần đây, Jianfeng Chen (năm 2007) [20] đồng thành công việc phát nhanh cúm gia cầm H5N1 từ dịch niệu gà, miếng gạc khí quản mô Ở họ sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu với glycoprotein HA H5N1 để gắn lên nhóm cacboxyl hạt latex nhóm cacbondiimide tan 17 nước để tạo nên “hạt latex nhạy” Phương pháp có khả phát đặc hiệu có mặt H5N1 dịch niệu mà khơng có mặt khác H1N1, H3N2, H4N6, H9N2 1.8.2 Giới thiệu vùng biến đổi kháng thể (Single Chain Variable Fragmet-scFv) Kỹ thuật phage display đời vào năm 1985 Smith cộng [53] trở thành kỹ thuật nghiên cứu ứng dụng triển khai mạnh mẽ Đoạn ADN mã hóa cho mảnh scFv tạo kỹ thuật chứa thư viện phage display Kháng thể tái tổ hợp tạo theo phương pháp dễ dàng nhanh chóng phát triển tiêu chuẩn cao tạo mà khơng cần phải có tham gia hệ thống miễn dịch ScFv kết hợp vùng khác chuỗi nặng chuỗi nhẹ IgG thông qua cầu nối ngắn, thường serine glycine Để tạo scFv thư viện phage display nguyên tắc giống với phương pháp tạo kháng thể tái tổ hợp khác thư viện Các gen mã hóa cho chuỗi nặng chuỗi nhẹ lấy từ tế bào lympho B thông qua trình chép ngược Khuếch đại đoạn gen mã hóa chuỗi nặng chuỗi nhẹ phiên mã ngược PCR Cắt sản phẩm PCR enzim giới hạn tách dịng gen Sau gắn vào gen đơn sử dụng mảnh ADN nối Mảnh ADN scFv lắp ráp cài vào vector phagemid phagemid tái tổ hợp biến nạp vào tế bào khả biến E coli thông qua phương pháp biến nạp sốc nhiệt hay xung điện Hiện có nhiều nhà khoa học nghiên cứu scFv phạm vi ứng dụng ngày rộng rãi nhiều lĩnh vực: sinh học, y học Do đời nên nghiên cứu ứng dụng scFv chưa nghiên cứu nhiều ứng dụng scFv quan trọng nghiên cứu scFv giúp tạo kháng thể đơn dòng cho phép sử dụng trực tiếp việc điều trị bệnh chẩn đoán bệnh 18 Tế bào lympho B Chuỗi L mARN Chuỗi H mARN Sao chép ngược 420C, 15 phút Chuỗi H cADN Chuỗi L cADN PCR, 30 chu kỳ 940C, phút 550C, phút 720C, phút ADN nối PCR, chu kì 940C, phút 680C, phút Mảnh ADN mã hóa scFv Hình 1.13 Sơ đồ tạo scFv 1.9 Bệnh cúm gia cầm A/H5N1 Cúm (Influenza) bệnh truyền nhiễm cấp tính thường xảy vào mùa đơng, vùng khí hậu ơn đới; nhiên, bệnh xuất hai lần năm vùng nhiệt đới Bệnh cúm virus thuộc họ Orthomyxoviridae gây nên Họ Orthomyxoviridae chia thành nhóm: virus cúm A (Influenza A virus), virus cúm B (Influenza B virus), virus cúm C (Influenza C virus) Thogotovirus Các nhóm phân biệt nucleoprotein NP M Ba nhóm đầu gây nên kiểu bệnh cúm tương ứng là: cúm A, cúm B cúm C Cúm B gây nhiễm người, tạo dịch nhẹ rải rác Virus cúm C gây bệnh người tìm thấy số lợn Trung Quốc; không thấy biểu nguy hiểm cho người Trái lại, virus cúm A, với nhiều phân tuýp khác nhau, gây nhiễm người, gia cầm nhiều lồi động vật có vú, tạo nên đại dịch kinh hoàng lịch sử Cúm A/H5N1 virus có độc lực cao, gây bệnh người vụ dịch cúm gà năm 1996 - 2008, đặc biệt ác liệt virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao (HPAI, highly pathogenic avian influenza) gây kể từ năm 2003 phát sinh nhiều dịng (sublineage) nhóm/phân nhóm (clade) có độc lực cao Chủng virus cúm A/H5N1 phát lần gây bệnh dịch gà Scotland vào năm 1959 Có thể gọi cúm A/H5N1 phân lập năm 1959 Scotland virus cúm A/H5N1 cổ điển (danh pháp: A-CkScotland-(59)(H5N1) (số đăng ký: X07869) Cúm A/H5N1 giai đoạn 2003 đến nay, cấu trúc trước đó, xét độc lực (tính gây bệnh), 19 lồi vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyên - miễn dịch mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trưng khác với nhiều biến chủng H5N1 trước Nhằm ngăn chặn dịch bệnh lây lan, mười năm qua, giới có hàng trăm triệu gia cầm bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi kinh tế Đặc biệt, số người nhiễm tử vong virus cúm A/H5N1, năm cao hơn, theo thống kê số người bị nhiễm cúm gia cầm H5N1 báo cáo với Tổ chức Y tế giới (WHO), từ năm 2003 đến tháng 6/2008, có tới 385 trường hợp mắc cúm A/H5N1, đó, 243 trường hợp tử vong chiếm tới 63,11% Việt Nam Indonesia quốc gia có số người nhiễm tử vong cao virus cúm A/H5N1 giới Tính gây bệnh A/H5N1 thể độc lực cao không giới hạn chức điểm cắt protease HA hoạt tính NA, mà hiệu ứng sản phẩm đa gen khả tái tổ hợp tạo virus với đặc tính gây bệnh độc lực khác vấn đề cần tính đến Hàng ngàn cơng trình nghiên cứu cúm A nói chung cúm A/H5N1 nói riêng, đặc biệt năm gần đây, có phát triển công nghệ (các loại) vaccine gây miễn dịch cho gia cầm chuẩn bị cho đại dịch xảy người Trước tình hình lây lan dịch cúm A/H5N1 Trên giới Việt Nam có nhiều cơng trình nghiên cứu như: Nghiên cứu định type, biến đổi di truyền gen học tiến hóa virus cúm A/H5N1 quan nghiên cứu Việt Nam tiến hành từ tháng xảy dịch cúm gia cầm cuối năm 2003 Những chuỗi gen giúp xác định phân type H5, phân type N1 gen cấu trúc Viện Công nghệ Sinh học, Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Viện Thú y giải mã công bố Ngân hàng gen Các biến chủng H5N1 Hồng Kông, Trung Quốc phân lập năm 1997 - 2001 Hàn Quốc, Đài Loan (phân lập năm 2003) có nguồn gốc từ chim cút ngỗng (A/Goose/Guandong/1/96) vùng Quảng Đông (Trung Quốc), biến chủng thuộc dịng Quảng Đơng [28] Như vậy, virus cúm gia cầm gây bệnh gia cầm người Việt Nam cúm H5N1 type A thuộc hệ có biến đổi gen H5 gen N1, có nguồn gốc với H5N1 từ vùng địa lý Nam Trung Quốc Hồng Kông [53] Các chủng phân lập năm 2004-2006 nghiên cứu chi tiết góc độ gen học quan hệ phân tử với chủng vùng giới, kết khẳng định virus H5N1 vùng Nam Đông Nam Á thuộc nhóm di truyền VTM (viết tắt: Vietnam-ThailandMalaysia), có đặc tính sinh học định khác với nhóm vùng Trung Quốc Hồng Kơng Năm 2007, xuất thêm biến chủng H5N1 dòng Phúc Kiến Việt Nam, làm phức tạp thêm vấn đề dịch tễ học quan hệ kháng nguyên miễn dịch, tỷ lệ tương đồng kháng nguyên HA(H5) NA(N1) thấp so với chủng phân dòng Quảng Đơng, nhiên cịn có khả bảo hộ miễn dịch 20 Với khả lây nhiễm nhanh tính chất nguy hiểm virus cúm A/H5N1, việc phịng chống dập tắt dịch đóng vai trị quan trọng Để phát dập dịch trường, vai trị phương pháp chẩn đốn, phát bệnh trở nên vơ quan trọng, loại kit chẩn đốn nhanh với ưu điểm dễ sử dụng, thời gian kiểm tra nhanh, tính di động cao cần thiết Trên sở khoa học thực tiễn đề tài Việt Nam nay, xu hướng nghiên cứu phát triển thành tựu từ công nghệ nano trở nên hấp dẫn có ứng dụng khả quan lĩnh vực y sinh học Quy trình chế tạo hạt nano vàng thuận tiện với đặc tính quang học đặc trưng phù hợp đánh dấu sinh học, làm tiền đề cho việc chế tạo kit chẩn đốn nhanh bệnh cấp tính lây lan nhanh coi hướng nghiên cứu nhà khoa học Việc chủ động tạo nguồn kháng thể phân lập phịng thí nghiệm trọng điểm, từ làm sở cho việc chế tạo nên kit chẩn đốn nhanh với chi phí rẻ, dễ sử dụng sử dụng rộng rãi tất vùng miền nước Do đó, việc thực đề tài bước đầu đặt sở cho việc nghiên cứu, chế tạo hoàn thiện kit chẩn đoán nhanh sử dụng hạt nano vàng gắn kháng thể cúm, đặc biệt công nghệ chế tạo que thử nhanh sử dụng phức hợp kháng thể/nano vàng nhằm phát nhanh virus cúm A/H5N1 có ý nghĩa khoa học thực tiễn cao 21 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Kháng thể scFv sàng lọc thư viện kỹ thuật phage display, có khả liên kết đặc hiệu với kháng nguyên HA virus cúm gia cầm A/H5N1 phịng Cơng nghệ tế bào thực vật cung cấp Mẫu kháng nguyên virus cúm A/H5N1 cung cấp phịng Vi sinh phân tử, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Khoa học cơng nghệ Việt Nam Hóa chất: muối vàng chloroauric (HAuCl4, 99,9%, Roth), natri citrate (C6H5O7Na3, 99,9%, Roth), nước khử ion, hóa chất thơng dụng sinh học phân tử cung cấp hãng Các thiết bị: Bếp khuấy từ, máy li tâm, khuấy từ, bình tam giác, ống nghiệm thủy tinh, màng nitrocellulose, máy ảnh, pipette, găng tay, máy đo độ pH 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp chế tạo dung dịch nano vàng (AuNPs) Phương pháp tổng hợp Turkevich [58] dựa nguyên tắc khử ion Au3+ natri citrate ông cộng tiến hành năm 1951, phương pháp khử hóa học thuận tiện tổng hợp dung dịch hạt nano vàng thể huyền phù với hạt đơn phân tán, có kích thước dao động ~ 20nm Ưu điểm phương pháp tạo hạt nano vàng hình cầu với độ phân tán cao, trình khử citrate tạo lượng ion (–) citrate bám xung quanh hạt nano lực hút tĩnh điện làm cho bề mặt chúng tách rời ngăn cản chúng liên kết với để tạo thành hạt lớn hơn, hạt AuNPs sau tổng hợp có sẵn nhóm chức carboxyl (–COOH ) sẵn bề mặt Về mặt sinh học, ưu điểm thuận lợi để gắn hạt nano với phân tử sinh học DNA, RNA, phân tử kháng thể mà không cần qua q trình biến tính hóa học phức tạp khác dùng ứng dụng chế tạo kit chẩn đoán nhanh số loại bệnh, ứng dụng khác có liên quan Phương trình phản ứng chế phản ứng cho việc khử ion Au3+ thành Au0 minh họa bên dưới: HAuCl4 + Na3C6H5O7  H2 + Au0 + CO2 + 4NaC5H5O5 + 8NaCl Tiến trình phản ứng: HAuCl4 + Na3C6H5O7 HAuCl4 + Na2C6H6O7 – NaCl – NaCl NaC6H6O7 – AuCl2 + Na3C6H5O7 Na2C6H6O7 + AuCl3 NaC6H6O7 – AuCl2 – NaCl 22 CO2 + Na2C6H6O7 + NaC5H5O5 + AuCl Na2C6H6O7 + AuCl NaC6H6O7 – Au – NaCl NaC6H6O7 – Au H2 + 2Au0 + 2CO2 + NaC5H5O5 Sau hạt nano vàng hình thành thơng qua giai đoạn: hình thành nhân, mọc thành hạt ổn định hạt Quá trình chế tạo dung dịch AuNPs minh họa theo sơ đồ sau: Hình 2.1 Sơ đồ phản ứng hóa học tạo hạt nano vàng theo phương pháp khử Turkevich [64] Cơ chế phản ứng: Khi bắt đầu hình thành nhân (nucleation) phản ứng, tất hạt nano vàng kích thước nhỏ đồng nên dung dịch có màu tím sẫm Tuy nhiên cực tiểu hóa lượng bề mặt khiến hạt trở nên co cụm tập trung vào Tại thời điểm ion citrate tích điện âm giải phóng suốt q trình khử gắn vào bề mặt hạt nano vàng ngăn cản hạt tiếp tục co cụm lại với Các ion citrate đóng vai trị chất hoạt động bề mặt kìm hãm co cụm hạt nano vàng, dung dịch khuấy liên tục giả thiết dung dịch đồng hạt nano tiếp tục co cụm với phát triển tất diện tích bề mặt hạt nano vàng bọc hoàn toàn ion citrate, thời điểm kích thước hạt khơng tăng thêm Do đó, có nhiều ion citrate chúng che phủ bề mặt lớn hạt nano vàng, điều đồng nghĩa với việc tạo hạt nhỏ Do đó, việc thay đổi lượng citrate phản ứng có khả dùng để kiểm sốt kích thước hạt nano vàng Hình 2.2 Kích thước hình dạng hạt nano vàng theo thời gian phản ứng khoảng thời gian t=10giây đến t=120giây [19] 23 Sự thay đổi màu dung dịch quan sát suốt thời gian phản ứng việc hấp thụ photon cộng hưởng Plasmon bề mặt hạt nano vàng vùng ánh sáng nhìn thấy Hiện tượng xảy ranh giới chất dẫn điện (nano vàng) chất dẫn điện Tùy thuộc vào kích thước, thành phần hóa học, hình thái bề mặt, tương dao động Plasmon với photon khác Các photon với bước sóng xác định truyền qua, hay hấp thụ bị phản xạ Đặc tính xảy kích thước nano mét, hạt nano vàng nhỏ 100 nm, bước sóng ánh sáng bị phản xạ rơi vào khoảng ánh sáng nhìn thấy Khi giảm kích thước hạt, bước sóng lớn bị phản xạ, màu hạt dịch tới khu vực cuối violet dải ánh sáng nhìn thấy Mục đích chế tạo dung dịch AuNPs thể huyền phù với hạt có kích thước ~ 20 nm có gắn sẵn nhóm chức –COOH bề mặt hạt nano để sẵn sàng gắn với phân tử kháng thể đồng thời màu đỏ đặc trưng dung dịch nano hiệu ứng cộng hưởng plasmon phải đủ độ “mạnh” cho mục đích đánh dấu sinh học với mật độ hạt định, màu đỏ đặc trưng dung dịch đóng vai trị sensor màu Quy trình tổng hợp hạt AuNPs sau: - Dùng pipette nhỏ 100 µl dung dịch muối vàng chloauric (HAuCl4) 5% vào bình tam giác chứa 80 ml nước khử ion Bình đặt bếp khuấy từ gia nhiệt đun đến dung dịch bắt đầu sôi - Thanh khuấy từ đặt bình tam giác bắt đầu phản ứng khuấy 1200 vòng/phút Nhỏ lượng dung dịch natri citrate (C6H5O7Na3) 1% thích hợp vào bình tiếp tục gia nhiệt Phản ứng bắt đầu xảy - Trong khoảng 20 giây, dung dịch bắt đầu chuyển sang màu tím sẫm Tại thời điểm phản ứng kết tủa hạt Au0 bắt đầu hình thành - Tiếp tục gia nhiệt khuấy 20 phút Trong suốt thời gian phản ứng này, màu dung dịch chuyển sang sẫm màu tím da cam tùy thuộc vào tỉ số C6H5O7Na3và HAuCl4 sử dụng phản ứng - Khi phản ứng đạt tới thời gian sau 20 phút, chuyển bình phản ứng khỏi bếp khuấy từ nhúng vào nước đá Khi bị làm lạnh đột ngột, phản ứng hóa học dừng lại kích thước hạt khơng bị thay đổi nhiều Sự tồn hạt keo vàng nhận việc chiếu chùm tia laser phân cực dung dịch Khi chùm tia phân cực chiếu vào dung dịch, nhìn thấy chùm sáng theo hướng định, biến quan sát theo hướng trực giao với phương vừa quan sát 24 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu nhân tố ảnh hướng đến chất lượng mẫu Để đánh giá chất lượng mẫu dung dịch nano vàng với thống số kỹ thuật phù hợp cho công việc luận văn như: kích thước hạt đồng đều, hiệu ứng màu đặc trưng dung dịch tượng cộng hưởng plasmon, độ bền dung dịch theo thời gian…chúng nghiên cứu phụ thuộc chúng vào điều kiện phản ứng khác như: thời gian phản ứng, thay đổi lượng chất khử natri citrate, thời gian bảo quản, điều kiện bảo quản 2.2.2.1 Thời gian phản ứng Chúng tiến hành tổng hợp dung dịch AuNPs khác với lượng muối vàng HAuCl4, chất khử Na3C6H5O7Na3 khoảng thời gian phản ứng khác nhau, thay đổi khoảng từ đến 40 phút phản ứng Bảng 2.1 phản ứng tạo hạt vàng với thời gian khác Bảng 2.1 Tổng hợp hạt nano vàng với khoảng thời gian phản ứng khác Thời gian phản ứng (phút) Mẫu H2O (ml) HAuCl4 5% (µl) Na3C6H5O7Na3 1% (ml) No1 80 100 3,5 No2 80 100 3,5 No3 80 100 3,5 No4 80 100 3,5 No5 80 100 3,5 12 No6 80 100 3,5 15 No7 80 100 3,5 20 No8 80 100 3,5 30 No9 80 100 3,5 40 2.2.2.2 Thay đổi lượng chất khử Na3C6H5Na3 Để kiểm tra ảnh hưởng lượng chất khử natri citrate, tiến hành phản ứng tạo nano vàng với lượng chất khử khác (bảng 2.2) 25 Bảng 2.2 Thay đổi lượng chất khử lượng Na3C6H5Na3 khác Thời gian phản ứng (phút) Mẫu H2O (ml) HAuCl4 (5%) (µl) Na3C6H5O7Na3 1% (µl) N1 80 100 700 20 N2 80 100 1.5 20 N3 80 100 3.5 20 N4 80 100 20 N5 80 100 20 N6 80 100 12 20 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu kích thước, hình thái cấu trúc hóa học AuNPs Các mẫu nano vàng sau chế tạo phân tích hiển vi điện tử quét (SEM), phân tích thành phần EDX, phổ hấp thụ UV-vis, phổ hồng ngoại FTIR nhằm tìm hiểu hình dạng, kích thước, cấu trúc hóa học hạt nano vàng phân tích thành phần vật liệu sau chế tạo 2.2.3.1 Phân tích phổ hấp thụ UV Nguyên lý phương pháp mô tả sau: chiếu chùm tia đơn sắc có cường độ I0 vào mơi trường vật chất độ dày cm nồng độ C (mol/l), chùm tia bị môi trường vật chất hấp thụ truyền qua Cường độ I chùm tia truyền qua môi trường bị giảm theo quy luật Beer-Lamber (Khi hấp thụ tia đơn sắc , độ hấp thụ phụ thuộc bậc vào nồng độ chất hấp thụ Tùy chất, định luật Beer-Lamber thường đứng khoảng nồng độ) Log(I0/I ) = K.n log(I0/I) = ε 1C Trong K hệ số hấp thụ mol hay độ hấp thụ môi trường, n số mol chất cần đo đặt đường tia xạ Đại lượng log(I0/I ) gọi mật độ quang học D độ hấp thụ A ε hệ số hấp thụ mol có giá trị mật độ quang dung dịch nồng độ chất hấp thụ đơn vị độ dày chất hấp thụ đơn vị Hệ số hấp thụ phụ thuộc vào chất chất hấp thụ bước sóng xạ bị hấp thụ Độ truyền qua môi trường T= I/I0 26 Tải FULL (65 trang): https://bit.ly/317XH3R Dự phịng: fb.com/TaiHo123doc.net Hình 2.3 Sơ đồ máy đo phổ hấp thụ UV/vis hai chùm tia Sự hấp thụ thường tập trung vào vùng phổ hẹp nên người ta hay dùng vùng phổ hẹp vùng nhìn thấy, vùng tử ngoại, vùng hồng ngoại… Đường cong biểu diễn phụ thuộc hệ số hấp thụ Kv vào tần số ν bước sóng tới λ gọi đường cong hấp thụ (phổ hấp thụ) Mỗi chất hấp thụ hấp thụ lọc lựa tần số sóng khác 2.2.3.2 Phân tích hiển vi điện tử quét (SEM) Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscopy) thiết bị phân tích hữu hiệu cho vật liệu nano SEM cho phép biết thông tin địa hình, hình thái học, thành phần, thơng tin tinh thể học Chữ “quét” (scanning) để thể đặc tính quét tia điện tử mẫu để quan sát vùng điện tử quét qua Sơ đồ cấu tạo kính hiển vi điện tử mơ tả hình 2.4 Hình 2.4 Sơ đồ minh họa cấu tạo kính hiển vi điện tử quét Nguyên lý hoạt động SEM: Một dòng tia điện tử tạo nguồn phát điện tử (Electron source) gia tốc đến mẫu nhờ việc sử dụng hiệu điện dương, dòng điện tử giam giữ hội tụ nhờ sử dụng độ mở kim loại Sau đó, chùm tia điện tử đơn sắc hội tụ quét lên bề mặt mẫu thành đường riêng lẻ (giống nguyên lý quét ti vi) Khi điện tử 27 đến va chạm với mẫu dẫn đến phản ứng khác xảy mẫu Các tương tác ghi nhận chuyển thành hình ảnh nhiều công cụ hỗ trợ khác Trước chuyển sang điểm quét bề mặt mẫu, thiết bị hỗ trợ tính tốn số tương tác hiển thị chúng thành pixel hình Quá trình lặp đi, lặp lại kết thúc Trên thiết bị TEM SEM thường tích hợp thiết bị phân tích thành phần vật liệu phương pháp phân tích phổ tán xạ tia X –EDX (Energy Dispersive X-ray) Nguyên lý phương pháp dựa tác động chùm tia electron lên bề mặt mẫu, tương tác làm phát tia X, lượng photon tia X đặc trưng cho nguyên tố mà riêng có Chính mà biết xác thành phần hóa học chất có bên mẫu Thậm chí, phân bố thành phần theo diện tích xác định, tia điện tử từ nguồn phát điện tử sê quét theo khu vực cụ thể Hệ thống vi phân tích thu thập tia X, xếp thứ tự, phân bố chúng thành giản đồ lượng, tự động gán tên thành phần hóa học có bên mẫu tương ứng với đỉnh phân Tải FULL (65 trang): https://bit.ly/317XH3R bố lượng Dự phịng: fb.com/TaiHo123doc.net Mẫu phân tích máy S- 4800 FESEM- Viện Khoa học Vật liệu Trung tâm đánh giá sai hỏng vật liệu, Viện Khoa học Vật liệu 2.2.3.3 Phân tích phổ hấp thụ hồng ngoại FTIR Phổ hấp thụ hồng ngoại phổ dao động quay hấp thụ xạ hồng ngoại chuyển động dao động chuyển động quay bị kích thích Tất phân tử cấu tạo từ nguyên từ nguyên tử nối với liên kết hóa học Dao động nguyên tử liên kết hóa học giống dao động hệ thống cầu nối với lò xo Chuyển động cầu lị xo coi kết chồng chập hai dao động: kéo căng uốn cong Tần số dao động không phụ thuộc chất liên kết riêng biệt như: C-H hay C-O, mà phụ thuộc phân tử mơi trường xunh quanh Tương tự hệ cầu tự do, hệ thống tác động lên dao động điện tích tăng lên va đập Tương tự vậy, biên độ dao động liên kết hóa học với chúng dao động điện tích tăng lên trường điện tử tác động lên chúng Sự khác hệ cầu lò xo phân tử nằm mức lượng dao động phân tử lượng tử hóa Do phân tử hấp thụ bước sóng phổ hồng ngoại có lượng tương ứng với khoảng cách hai mữc lượng dao động nguyên tử Do đó, biên độ dao động tăng theo kiểu nhảy bậc Đối với phân tử có nhiều nguyên tử, dao động quay thường phức tạp, nhiên, quy chuyển động phức tạp thành số dao động đơn giản gọi dao động riêng Mỗi dao động riêng lại có mức lượng định Trường hợp 2-3 dao động có mức lượng gọi dao động suy biến 28 Hình 2.5 Mơ hình máy quang phổ FTIR Người ta phân biệt dao động riêng thành hai loại: Dao động hóa trị (ký hiệu υ) dao động làm thay đổi góc liên kết Dao động biến dạng (ký hiệu δ) dao động làm thay đổi góc liên kết không làm thay đổi chiều dài liên kết nguyên tử phân tử Mỗi loại dao động phân chia thành dao động đối xứng (ký hiệu υs δs ) bất đối xứng (ký hiệu υas δas) Cường độ hình dạng phổ: Phổ hồng ngoại ghi dạng đường cong phụ thuộc phần trăm truyền qua (100I/I0) vào số sóng Sự hấp thụ nhóm nguyên tử thể đám phổ với đỉnh phổ số sóng xác định Việc định lượng xác cường độ thường gặp khó khăn, sai số lớn nên phổ thường đánh giá định tính với độ mạnh, trung bình yếu Khi phân tích phổ hồng ngoại, ngồi việc xem xét vị trí trình bày, phân tử khơng thể hấp thụ xạ cách hỗn loạn, mà hấp thụ xạ tương ứng 29 6812470 ... lý h? ?a học hạt nano vàng chế tạo + Nghiên cứu chế tạo phức hợp hạt nano vàng gắn kháng thể + Ứng dụng hạt nano vàng gắn kháng thể để phát có mặt virus cúm A/ H5N1 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN... lan virus cúm A/ H5N1 Việt Nam, thực đề tài: ? ?Chế tạo hạt nano vàng (AuNPs) gắn kháng thể ứng dụng cho phát nhanh virus cúm A? ?? Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu ứng dụng thử nghiệm việc chế tạo vật. .. QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ PHẠM VĂN ĐỒNG CHẾ TẠO HẠT NANO VÀNG GẮN KHÁNG THỂ ỨNG DỤNG CHO PHÁT HIỆN NHANH VIRUS CÚM A Chuyên ngành: Vật liệu Linh kiện Nanô (Chuyên ngành đào tạo thí