Đang tải... (xem toàn văn)
Dịch vụ thành lập Thay đổi Giấy phép kinh doanh cty Việt Nam cty vốn FDI Tuyển Cộng tác viên (CK 15% gói Dịch vụ) 0899315716 MỤC LỤC DANH SÁCH THÀNH VIÊN THỰC HIỆN ĐỀ TÀI iii Danh mục bảng biểu vi Danh mục hình vii THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1 Mở đầu 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 8 1.1. Tổng quan chitosan 8 1.1.1. Chitosan 8 1.1.2. Tính kháng khuẩn của chitosan 8 1.1.3. Ứng dụng của chitosan 10 1.2. Tổng quan về Gelatin 13 1.2.1. Giới thiệu về Gelatin 13 1.2.2 Ứng dụng của gelatin 13 1.3. Tổng quan về curcumin 14 1.3.1 Giới thiệu về Curcumin 14 1.3.2. Tác dụng dược lý 16 1.3.3. Tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm 16 1.3.4. Tác dụng trên da 17 1.3.5. Các tác dụng khác 18 1.4. Các đường dẫn truyền hoạt chất vào da 22 18 1.4.1. Dẫn truyền xuyên qua chất gian bào (intercellular) 19 1.4.2. Dẫn truyền xuyên qua các tế bào (transcellular) 20 1.4.3. Dẫn truyền qua tuyến nhờn của lỗ chân lông hoặc tuyến mồ hôi 21 1.4.4. Dẫn truyền thông qua các lỗ phân cực 21 1.4.5. Dẫn truyền các hoạt chất vào da dạng tan trong dầu 22 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 23 2.2. Chuẩn bị nguyên liệu 23 2.2.1. Pha dung dịch ban đầu 23 2.2.2. Phương pháp chế tạo màng xốp curcuminchitosangelatin 24 2.2.3. Khảo sát độ thấm nước 25 2.2.4. Khảo sát khả năng giải phóng thuốc (giải phóng curcumin) 25 2.2.5. Kiểm tra vi sinh sản phẩm màng 26 2.2.6. Khảo sát khả năng kháng khuẩn 28 2.2.7. Xác định cấu trúc của vật liệu 28 2.2.8. Khảo sát tác dụng làm mau lành vết thương trên thỏ 29 2.2.9. Nhuộm mô bằng Hematoxylin Eosin (HE) 30 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 32 3.1. Tổng hợp và xác định cấu trúc màng xốp composite 32 3.2. Khả năng thấm nước của sản phẩm 35 3.3. Khả năng giải phóng curcumin của sản phẩm 36 3.4. Kết quả kiểm tra khả năng kháng khuẩn 38 3.5. Khảo sát tác dụng mau lành vết thương trên thỏ 40 3.6. Khảo sát khả năng lành của vết thương bằng nhuộm mô 44 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 Danh mục bảng biểu Bảng 2.1. Bảng nguyên liệu nghiên cứu 23 Bảng 2.2. Bảng thiết bị nghiên cứu,kiểm nghiệm 23 Bảng 2.3. Bảng các đơn công nghệ phối trộn 24 Bảng 3.1 Khả năng thấm nước và độ mất khối lượng của màng xốp 36 Bảng 3.2. Khả năng giải phóng curcumin theo thời gian tại pH 7.4 37 Bảng 3.3. Diện tích còn lại của vết thương của 3 lô 40 Danh mục hình Hình 1.1 Cây Nghệ và củ Nghệ 15 Hình 1.2. Công thức của curcumin I (a), curcumin II (b) và curcumin III (c 16 Hình 1.3. Dẫn truyền giữa các tế bào 19 Hìn 1.4. Các đường thấm thuốc qua da 19 Hình 1.5. Các đường dẫn truyền xuyên qua da 20 Hình 1.6. Mô tả các đường dẫn truyền 21 Hình 3.1. Màng xốp curcuminchitosangelatin (a) và chitosangelatin (b) 32 Hình 3.2. Phổ hồng ngoại màng chitosangelatin 33 Hình 3.3. Ảnh SEM màng chitosangelatin không có curcumin (a) Mẫu 3, (b) Mẫu 2 và (c) Mẫu 1. Bề mặt cắt ngang của màng xốp chitosangelatin (d) Mẫu 3, (e) Mẫu 2 và (f) Mẫu 1. 34 Hình 3.4. Ảnh SEM màng chitosangelatin có curcumin. 34 Hình 3.5. Sự mất khối lượng của màng xốp 36 Hình 3.6. Khả năng giải phóng thuốc của màng xốp 38 Hình 3.7.Kết quả kiểm tra vòng kháng khuẩn Pseudomonas aeruginosa mẫu mâu 3 sau 24h (a) và sau 48h (b) 39 Hình 3.8. Kết quả kiểm tra vòng kháng khuẩn Pseudomonas aeruginosa mẫu 3 có curcumin sau 24h (a) và sau 48h (b) 39 Hình 3.9 Diễn biến độ co vết thương khi thử nghiệm 41 Hình 3.10. Diễn tiến vết thương thỏ từ ngày 0 đến ngày 21 43 Hình 3.11. Da thỏ ngày 21 nhuộm HE của lô 1 (a), lô 2 (b) và lô 3 (c) 44 TÓM TĂT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO COMPOSITE XỐP CỦA CURCUMINCHITOSANGELATIN ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG CURCUMINLOADED CHITOSANGELATIN COMPOSITE SPONGE FOR WOUND HEALING APPLICATION Abstract Three composite sponges were made with 10% of curcumin and by using polymers namely chitosan and gelatin with various ratios. The chemical structure and morphology were evaluated by FTIR and SEM. These sponges were evaluated for water absorption capacity, antibacterial activity, in vitro drug release and in vivo wound healing studies by excision wound model using rabbits. The in vivo study presented a greater wound closure in wounds treated with curcumincomposite sponge than those of composite sponge without curcumin and untreated group. These obtained results showed that combination of curcumin, chitosan and gelatin could improve the wound healing activity in comparison to chitosan and gelatin without curcumin. Keywords: chitosan, curcumin, drug delivery system, gelatin, wound healing activity. Tóm tắt Màng composite xốp chitosangelatin được tổng hợp với 10% curcumin bằng phương pháp khô lạnh. Màng chitosan và gelatin được tổng hợp với tỷ lệ khác nhau. Cấu trúc hóa học và hình thái bề mặt được đánh giá bằng các phương pháp hóa lý như: FTIR và SEM. Khả năng hấp phụ nước, hoạt tính kháng khuẩn, khả năng giải phóng thuốc và chữa lành vết thương sử dụng thỏ cũng được nghiên cứu trong đề tài này. Màng tạo thành có độ linh hoạt, có tính thấm tốt (2300%) và có khả năng kháng khuẩn (đặc biệt là đối với Pseudomonas aeruginosa). Màng tạo thành từ chitosan, gelatin và curcumin có khả năng đem lại nhiều lợi ích cho ngành công nghiệp sản xuất các sản phẩm chữa trị vết thương. Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng làm lành vết thương trên thỏ. Kết quả thu được như sau: Sản phẩm có tác dụng làm mau lành vết thương rõ rệt so với lô chứng. Đồng thời rút ngắn được thời gian điều trị so với lô đối chứng. Màng xốp chitosangelatin làm tăng khả năng làm lành thương trên động vật khi có curcmin và không có curcumin. Khi có sự kết hợp của curcumin thì thời gian làm lành vết thương được rút ngắn hơn nữa. Khả năng làm vết thương được kiểm tra thông qua độ co của vết thương và mẫu mô da thỏ dựa trên nhuộm HE. Từ khóa: Curcumin, chitosan, gelatin, khả năng làm lành vết thương Mở đầu Vật liệu màng composite đã được nghiên cứu rất nhiều ở Việt nam và cũng như trên thế giới, chúng có những tính chất vượt trội so với những vật liệu thông thường như: có độ cứng và độ bền cơ học cao. Vật liệu y sinh có nguồn gốc từ composite xốp được ứng dụng rất nhiều trong y học, đặc biệt là điều trị vết thương, những miếng composite xốp có khả năng thấm nước cao, đồng thời có thể dẫn truyền được một số loại thuốc chữa bệnh. Chitosan có trong vỏ tôm và cua. Ở nước ta, sản phẩm tôm đông lạnh chiếm sản lượng lớn nhất trong các sản phẩm đông lạnh. Vỏ tôm là nguồn nguyên liệu tự nhiên rất dồi dào, rẻ tiền, có sẵn quanh năm, nên rất thuận tiện cho việc cung cấp chitin và chitosan. Nước ta mỗi năm có sản lượng chitinchitosan khoảng hơn 1.000 tấn năm. Ở Việt Nam, những nghiên cứu gần đây đã thành công với những ứng dụng Chitosan làm vỏ bảo quản thực phẩm tươi sống, dễ hư hỏng như cá, thịt, rau quả... mà không làm mất màu, mùi vị của sản phẩm. Ngoài ra chitosan còn là chất hỗ trợ quá trình tạo tủa trong quy trình xử lý nước, khả năng hấp phụ kim loại nặng như: Cd2+, Cr3+, Cr6+, Hg2+, Pb2+, Cu2+…, chất giữ ẩm và tạo gel trong mỹ phẩm, dược phẩm. Một số nghiên cứu cho thấy màng chitosan có khả năng ứng dụng trong điều trị vết bỏng, tuy nhiên màng chitosan thường có khả năng thấm nước và thẩm thấu oxy kém. Curcumin (CUR) là hoạt chất chiết từ thân rễ của cây nghệ (Curcuma longa Zingiberaceae), chiếm từ 3040%. Chất màu CUR được phân lập vào thế kỷ 19, là thành phần tạo nên khả năng kháng viêm của nghệ. CUR có dạng tinh thể nâu đỏ, ánh tím, không tan trong nước, tan trong cồn, ete, chloroform, dung dịch có huỳnh quang màu xanh lục, tan trong acid (màu đỏ tươi), trong kiềm (màu đỏ máu rồi ngả tím). Nhiệt độ nóng chảy 176177 oC. Curcumin được biết đến như một tác nhân hữu ích cho việc phòng và điều trị ung thư bàng quang, vòm miệng, dạ dày, cổ tử cung và ung thư da. Ngoài ra, chất curcumin đã được chứng minh là chất chống oxy hóa và chống viêm nhiễm 1. Mặc dù, curcumin có những ứng dụng hiệu quả và an toàn cho điều trị ung thư và phòng chống ung thư, curcumin cũng tồn tại một số nhược điểm như: khả năng hòa tan trong nước thấp ở pH sinh lý, thời gian bán phân hủy sinh học ngắn, sự hấp thụ hạn chế, khả dụng sinh học kém, quá trình trao đổi chất và bài tiết diễn ra nhanh. Các nỗ lực để khắc phục những hạn chế này bao gồm tổng hợp của chất tương tự curcumin, sử dụng tá dược, cũng như phát triển các hệ dẫn truyền curcumin như các liposome và các hạt nano 12. Ở Việt Nam, có nhiều nhóm nghiên cứu, dự án liên quan đến curcumin, tuy nhiên, những dự án chủ yếu tập trung vào việc trích ly chất curcumin từ Curcuma longa. Một vài dự án quan tâm đến hoạt tính sinh học và ứng dụng của chất curcumin trong lĩnh vực y sinh. Những nghiên cứu này cho thấy hiệu quả của một số phương pháp cho sự trích ly chất curcumin từ Curcuma longa. Tuy nhiên, có rất ít các công trình nghiên cứu về hệ dẫn truyền thuốc và ứng dụng của hệ dẫn truyền thuốc bằng cách sử dụng curcumin. Trong nghiên cứu này, chúng ta tổng hợp một hệ dẫn truyền chất curcumin mới để có thể vượt qua những trở ngại của hệ thống dẫn truyền trực tiếp thông thường chất curcumin. Màng xốp y sinh là loại vật liệu gồm những polimer có cấu trúc xốp, diện tích bề mặt riêng lớn để giữ hoạt chất và vận chuyển chúng. Loại này có thể được phối hợp trong gel, kem, chất lỏng và dạng bột. Những polimer này có thể có trong tự nhiên như cellulose, chitosan, geltain hoặc tổng hợp như polyacrylates, polymethylacrylates, polyamide…Những hạt này là những hệ thống mở, hoạt chất đưa vào sẽ được phóng thích ra đơn giản bằng con đường khuếch tán. Tính tan của hợp hoạt chất và polimer là yếu tố quan. Kỹ thuật này thể hiện tính ổn định hóa học cao sức bền cơ học cao và tương hợp với hầu hết hoạt chất được sử dụng. Chúng tạo cảm giác thoải mái và dễ lan rộng trên da mà không gây trầy xướt cho da. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan chitosan 1.1.1. Chitosan Chitosan được tạo thành qua quá trình deacetyl hóa (loại bỏ nhóm COCH2) của chitin. Đun sôi chitin trong dung dịch kiềm đặc ở điều kiện thích hợp sẽ thu được chitosan. Trên thị trường có rất nhiều sản phẩm chitosan với mức độ deacetyl hóa khác nhau, có trọng lượng phân tử và độ nhớt khác nhau, do đó có tính chất, chức năng khác nhau. Chitin và chitosan rất giống nhau về cấu trúc, chỉ khác nhau về độ acetyl hoá hay lượng các nhóm –NHCOCH3 và nhóm –NH2 trong phân tử. Không có enzym tiêu hóa nào thủy phân đặc hiệu chitosan. Tuy nhiên, chitosan có thể được tiêu hóa một chút thông qua tác động không đặc hiệu của một số enzym tiêu hóa như amylase và lipase. Chitosan chứa nhiều nhóm –NH2 nên có thể tan trong dung dịch axit. Khi tan trong dung dịch axit, chitosan tạo gel có thể tráng mỏng thành màng. Ứng dụng tính chất này nên chitosan được dùng để tạo màng không thấm bảo quản trái cây hay dùng hỗ trợ trong điều trị viêm loét dạ dày, tá tràng (trong môi trường acid của dạ dày, chitosan tạo gel che phủ, bảo vệ niêm mạc). 1.1.2. Tính kháng khuẩn của chitosan Gần đây những nghiên cứu về tính kháng khuẩn của chitosan đã chỉ ra rằng chitosan có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Trong một nghiên cứu khá rộng về tính kháng khuẩn của chitosan từ tôm chống lại E.coli, người ta đã tìm ra rằng nhiệt độ cao và pH acid của thức ăn làm tăng ảnh hưởng của chitosan đến vi khuẩn. Nó cũng chỉ ra cơ chế ức chế vi khuẩn của chitosan là do liên kết giữa chuỗi polymer của chitosan với các ion kim loại trên bề mặt vi khuẩn làm thay đổi tính thấm của màng tế bào. Khi bổ sung chitosan vào môi trường, tế bào vi khuẩn sẽ chuyển từ tích điện âm sang tích điện dương. Quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang cho thấy rằng chitosan không trực tiếp hoạt động ức chế vi khuẩn E.coli do mà là do sự kết lại của các tế bào và sự tích điện dương ở màng của vi khuẩn. Chitosan N carboxybutyl, một polycation tự nhiên, có thể tương tác và hình thành polyelectrolyte với polymer acid tính có trên bề mặt vi khuẩn, do đó làm dính kết một lượng vi khuẩn với nhau. Cũng từ thí nghiệm này người ta thấy rằng có rất nhiều ion kim loại có thể ảnh hưởng đến đặc tính kháng khuẩn của chitosan như K+, Na+, Mg2+ và Ca2+. Nồng độ lớn các ion kim loại có thể khiến mất tính chất này, ngoại trừ ảnh hưởng của Na+ đối với hoạt động kháng Staphylococcus aureus. Người ta cũng thấy rằng chitosan có thể làm yếu đi chức năng bảo vệ của thành tế bào nhiều vi khuẩn. Khi sử dụng chitosan, thì một lượng lớn các ion K+ với ATP bị rò rỉ ở vi khuẩn Staphylococcus aureus và nấm candida albicans. Cả chitosan phân tử lượng 50kDa và 5kDa đều kháng tốt hai loại trên nhưng chitosan phân tử lượng 50kDa làm mất nhiều gấp 24 lần ion K+ với ATP chitosan 5kDa. Điều này thể hiện cơ chế kháng khuẩn khác nhau ở chitosan khối lượng phân tử thấp và cao. Hoạt động kháng khuẩn của chitosan phân tử lượng khác nhau đã được nghiên cứu trên 6 loài vi khuẩn. Và cơ chế kháng khuẩn này đã được chứng minh dựa trên việc đo tính thấm của màng tế bào vi khuẩn và quan sát sự nguyên vẹn của tế bào. Kết quả chỉ ra rằng khả năng này giảm khi khối lượng nguyên tử tăng. Và nó tăng cao ở nồng pH thấp, giảm rõ rệt khi có mặt ion Ca2+, Mg2+. Nồng độ ức chế thấp nhất khoảng 0.030.25%, thay đổi tùy từng loài vi khuẩn và khối kượng phân tử của chitosan. Chitosan cũng là nguyên nhân làm thoát các chất trong tế bào và phá hủy thành tế bào. Tính kháng khuẩn này phụ thuộc vào khối lượng phân tử và loại vi khuẩn. Đối với vi khuẩn Gram dương, chitosan 470 KDalton có ảnh hưởng đến hầu hết các loài trừ lactobacillus sp., trong khi với vi khuẩn Gram âm chitosan có khối lượng 1106 KDalton mới có ảnh hưởng. Nhìn chung, chitosan ở nồng độ 0.1% có ảnh hưởng mạnh hơn đến vi khuân Gram dương như Listeria monocytogenes, Bacillus megaterium, B.cereus, Staphylococcus aureus, lactobacillus plantarum, L. brevis và L. bulgaris hơn là vi khuẩn Gram âm như E. coli, Psedomonas fluorescens, Salmonella typmurium và Vibrio parahaemolyticus. Nghiên cứu trên vật thí nghiệm cho thấy chitin và chitosan có hoạt động ức chế vi khuẩn và nấm. Một trong các đồng phân của chitosan là N carboxybutyl chitosan có tác dụng kìm hãm và tiêu diệt 298 loài vi sinh vật gây bệnh. Khi có chitosan và chitin trên bề mặt các tác nhân gây bệnh ở thực vật, chúng ức chế sự phát triển của những loài này ở nồng độ 0.1% và pH 5.6 chúng kháng các loại nấm: Fusarium, Alternaria, Rhizopus… Và hoạt động kháng này sẽ giảm ở những vi sinh vật mà trên thành tế bào có chứa chitin, chitosan hoặc chitinßglucan. Ngược lại, sự ức chế và làm ngưng hoạt động của nấm men, nấm mốc lại phụ thuộc vào nồng độ chitosan, pH, và nhiệt độ. Hoạt động ức chế vi khuẩn của chitosan chịu ảnh hưởng của các nhân tố bên trong cũng như bên ngoài ví dụ loại chitosan, mức độ polymer hóa, đặc điểm dinh dưỡng của vật chủ, các chất hóa học thành phần dinh dưỡng và các điều kiện của môi trường như hoạt độ của nước. Chitosan đã được cho phép làm chất phụ gia thực phẩm ở Nhật và Hàn Quốc lần lượt từ năm 1983 và 1995. Chính hoạt động ức chế vi khuẩn cao của chitosan ở pH thấp nên khi thêm chitosan vào những thực phẩm có tính acid thì nó có chức năng tăng cường hoạt động kháng khuẩn như là một chất bảo quản tự nhiên. Ở pH 5.5, với nồng độ 0.51% chitosan có tác dụng ức chế đến các loài S. aureus, E. coli, Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes. Ở pH 6.5 chỉ có S. aureus bị ức chế ở nồng độ đó trong khi các loài khác vẫn phát triển ở nồng độ 2.5% (nồng độ cao nhất đã được nghiên cứu). Chitosan phân tử nhỏ có tính kháng các tác nhân gây bệnh trên thực vật mạnh hơn rất nhiều các chất phân tử lớn. Ngoài ra các hợp chất chitosan lactate và chitosan hydroglutamate cũng được sử dụng như là tác nhân ức chế E.coli, S. aureus và Saccharomyces cerevisiae. Nồng độ chitosan lactate trong nước cất có ảnh hưởng mạnh nhất đến E. coli. Chưa đến 1h, số lượng vi khuẩn này giảm khoảng 104, còn S. aureus giảm đến 106. Đối với nấm men, chúng hoàn toàn ngừng hoạt động ở nồng độ 1mgml chitosan lactate sau chưa đến 17 phút. 1.1.3. Ứng dụng của chitosan Trên thế giới, việc ứng dụng chitosan trong các lĩnh vực y sinh và xử lý môi trường đã được phát triển mạnh mẽ. Tại Việt nam, Phòng Polyme thiên nhiên, Viện Hóa học, Viện KHCN VN là một trong những cơ sở đầu tiên nghiên cứu ứng dụng thành công chitosan trong các lĩnh vực này. Theo hướng nghiên cứu chung đó, trên cơ sở đặc thù về chuyên môn là nghiên cứu đặc trưng và ứng dụng vật liệu nano, nhóm nghiên cứu tại Phòng Vật liệu Nano Y sinh, Viện Khoa học Vật liệu, Viện KHCN VN đã phối hợp với Phòng Công nghệ các chất có hoạt tính sinh học, Viện Hóa học tiến hành nghiên cứu ứng dụng của chitosan cấu trúc nano trong y sinh học (chế tạo hệ dẫn thuốc, gốm y sinh…) và xử lý môi trường (kháng khuẩn, hấp phụ kim loại nặng). Ứng dụng trong chế tạo gốm y sinh Nhóm nghiên cứu của Viện khoa học và công nghệ Việt nam đã chế tạo gốm y sinh của chitosan và HAp có nhiều tiềm năng ứng dụng do tính tương thích và hoạt tính sinh học cao, bằng phương pháp dung dịch theo phản ứng hóa học giữa muối chứa ion canxi (Ca2+) với muối chứa gốc phốt phát (PO43) có pha trộn chitosan. Để kiểm tra tính tương thích của vật liệu nano HApCS được tổng hợp được, compozit HApCS được ngâm trong môi trường giả dịch người SBF (Simulated Body Fluid) trong khoảng thời gian 14 ngày và sử dụng bình điều nhiệt để giữ nhiệt độ của hỗn hợp ở 37 oC. Từ ảnh FESEM, cho thấy sau 14 ngày các tinh thể HAp đã bao phủ toàn bộ bề mặt compozit HApCS. Kết quả thử nghiệm này chứng tỏ compozit HApCS có hoạt tính sinh học tốt trong môi trường mô phỏng dịch người SBF 3. Ứng dụng trong liệu pháp nhiệt trị ung thư và kháng khuẩn Nhiệt trị là một liệu pháp trị bệnh khá phổ biến, trong đó có điều trị bệnh ung thư. Vật liệu hạt từ được biết đến là chất có thể làm môi trường sinh nhiệt (tự đốt nóng) dưới tác dụng của từ trường xoay chiều với yêu cầu ứng dụng y sinh là phải bền lâu và có thông số tốc độ đốt riêng ban đầu SRA (Specific Adsorption Rate) phải đạt đủ cao. Một số kết quả ban đầu khi sử dụng O – cacboxymethyl chitosan làm chất bọc hạt sắt từ Fe3O4 để nghiên cứu khả năng đốt nhiệt cũng đã thể hiện khả năng ứng dụng hạt nano chitosan biến tính trong việc nhiệt trị điều trị ung thư. Ứng dụng trong chế tạo dung dịchgel kháng khuẩn 4. Chitosannano bạc (CSAgNPs) được nghiên cứu ứng dụng trong việc kháng khuẩn trong dung dịch nhờ đặc tính kháng khuẩn đặc biệt của hạt nano bạc. Các tính chất của CSAgNPs đã được khảo sát bằng phổ UVvis, ảnh hiển vi truyền qua (TEM). Khả năng kháng khuẩn của vật liệu trên đã được khảo sát với một số vi khuẩn như vi khuẩn gram âm (E.Coli và P.aeruginosa), vi khuẩn gram dương (L.fermentum, S.aureus và B.subtilis) và nấm (C.albians). Khảo sát đã chứng minh khả năng ứng dụng của vật liệu CSAgNPs trong kháng khuẩn dung dịch. Ứng dụng trong hệ dẫn thuốc Chitosan có tính chất quan trọng là tương thích sinh học và có khả năng phân hủy sinh học, có thể được sử dụng như một chất dẫn thuốc tiềm năng. Chitosan có thể được sử dụng đưới dạng màng và hạt nano để dẫn truyền thuốc. Để tạo cấu trúc nano phù hợp với mục đích dẫn thuốc cho chitosan, các tác giả sử dụng tripolyphosphate (TPP) làm chất tạo liên kết chéo thông qua tương tác tĩnh điện. Qua phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), quá trình nhả chậm đã được ghi nhận khi thực hiện thử nghiệm trong môi trường giả dịch ruột và giả dịch dạ dày. Từ thời gian nhả thuốc khi không có CSTPP vào khoảng 78 giờ trong môi trường giả dịch ruột và khoảng 0,5 giờ trong môi trường giả dịch dạ dày, artesunate đã được kéo dài thời gian nhả thuốc lên khoảng 2530 giờ.Trên cơ sở đó, CSTPP đã được ứng dụng làm chất dẫn thuốc cho thuốc trị sốt rét artesunate thuộc dẫn xuất artemisinin. Bên cạnh ứng dụng làm chất dẫn thuốc cho thuốc trị sốt rét artesunate, nhóm nghiên cứu này hiện đang tiếp tục thử nghiệm chế tạo các hệ dẫn thuốc khác, trong đó có các hệ dẫn thuốc thông minh, ví dụ hệ dẫn thuốc chữa ung thư có khả năng hướng đích có thành phần “dẫn dắt”, thâm nhập nội bào và gây chết tế bào ung thư theo chương trình hoặc hệ dẫn có lõi từ tính, có khả năng được “dẫn dắt” bằng từ trường ngoài. Các hệ dẫn thuốc này được cho là sẽ tiết kiệm được dược chất và làm tăng đáng kể hiệu quả chữa trị bệnh 4. Các nghiên cứu nước ngoài cho thấy chitosan được ứng dụng rất nhiều trong lĩnh vực dẫn truyền thuốc: Hạt nano chitosan kết hợp aginate, chitosan hydrogel, chitosan nhạy pH và gần đây chitosangraphene oxide composit ứng dụng trong dẫn truyền genipin, curcumin, doxorubicin, lidocaine. Tất cả những hệ dẫn truyền trên đều làm tăng khả năng lưu trữ thuốc và tăng khả năng đưa thuốc tới vị trí tế bào bệnh. Gần đây các nghiên cứu trong nước đã nghiên cứu sử dụng màng chitosan để ứng dụng trong thực phẩm để bảo quản trái cây, gần đây năm 2012 nhóm nghiên cứu chúng tôi kết hợp chitosan, PVA và gelatin thành màng composite ứng dụng dẫn truyền curcumin. Màng composite chitosan cho khẳ năng lưu trữ lượng lớn thuốc, nhưng khả năng giải phóng thuốc rất kém, để cải thiện yếu tố này nhóm nghiên cứu chúng tôi chuyển hướng sang sử dụng màng composite xốp (composite sponge) để dẫn truyền thuốc. Các nghiên cứu ở nước ngoài đã sử dụng composite xốp để dẫn truyền amikacin, genipin và vancomycin… Đồng thời một số tác giả kết hợp chitosan với PVA, aginate và PVP. Trong khi tại việt nam nghiên cứu về màng composite xốp của chitosan còn rất ít và hầu như không có, do vậy các nghiên cứu về lĩnh này thúc dẩy nhóm nghiên cứu chúng tôi kết hợp chitosan và gelatin để tạo ra composite xốp ứng dụng dẫn truyền curcumin. 1.2. Tổng quan về Gelatin 1.2.1. Giới thiệu về Gelatin Gelatin là một protein có nguồn gốc động vật, không có sẵn trong tự nhiên mà nó được tìm thấy từ protein collagen gốc bằng quá trình thủy phân cấu trúc bậc 2 hoặc cao hơn của quá trình thủy phân các polypeptit trong xương và da của động vật. Nó bao gồm 84% đến 90% protein và khoảng 1% của muối khoáng sản, phần còn lại là nước. Trên một quy mô công nghiệp, gelatin được làm từ sản phẩm của ngành công nghiệp da và thịt, chủ yếu là xương cốt của con lợn và gia súc. Những con hải cẩu và cá mập cũng là tuyệt vời nguồn collagen. Số lượng sản xuất trên toàn thế giới của gelatin là khoảng 300.000 tấn mỗi năm (khoảng 600 triệu lb). Trên một quy mô thương mại, gelatin được làm từ sản phẩm của ngành công nghiệp thịt và da. Gelatin chia làm hai loại Gelatin A là gelatin được chế biến bằng phương pháp axit. Gelatin B là gelatin được chế biến bằng phương pháp kiềm. Gelatin (gelatine) dạng tấm, mờ, không màu, dễ vỡ (khi khô), dạng hạt rắn không thơm, có màu vàng nhạt. Nó thường được sử dụng như một chất gel trong thực phẩm, dược phẩm, nhiếp ảnh, và sản xuất mỹ phẩm. Dung dịch gelatin có dạng sệt. Gelatin là sản phẩn của việc thủy phân collagen. Dung dịch gelatin là một dung dịch keo gel bán rắn, dung dịch có độ nhớt cao trong nước, Gelatin cũng hòa tan trong các dung môi cực nhất. Gel gelatin tồn tại trong khoảng giới hạn trên điểm nóng chảy của gel thường là ít hơn 35 oC giới hạn thấp hơn điểm đóng băng mà đá kết tinh. Tính gel của gelatin rất nhạy cảm với thay đổi nhiệt độ, độ nhớt của hỗn hợp với nước của gelatin tăng khi giữ lạnh (≈ 4 oC). 1.2.2. Ứng dụng của gelatin Gelatin khả năng hình thành gel mạnh, dịch trong suốt, dễ dàng hòa tan sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau. Gelatin tinh khiết là nguồn thực phẩm quý báu, tạo bọt, độ nhớt cao. Nó cũng được sử dụng nhiều, dược phẩm, nhiếp ảnh và kỹ thuật ứng dụng Gelatin thường tạo thành lớp vỏ của viên nang dược phẩm để làm cho họ dễ dàng hơn để nuốt. Nó được sử dụng để giữ tinh thể halogen bạc trong một nhũ tương trong hầu như tất cả các phim ảnh và các giấy tờ ảnh. Được sử dụng như lớp phủ, một chất hấp phụ để tách các chất khác, ví dụ, nó làm cho betacarotene tan trong nước do đó truyền đạt một màu vàng cho bất kỳ nước giải khát có chứa betacarotene. Gelatin lần đầu tiên được sử dụng vào năm 1337, và trong các loại giấy tờ châu Âu vào giữa thế kỷ 19. Hiện nay gelatin được tìm thấy trong một số giấy tờ in bóng, giấy nghệ thuật, các loại thẻ và nó giúp duy trì nếp nhăn trong giấy xếp. Gelatin được sử dụng bởi những vận động viên bơi lội để giữ mái tóc của họ không hòa tan trong nước lạnh của hồ bơi. Nó thường được sử dụng như một chất kết dính sinh học trong một số loại thuốc keo, Gelatin cũng được sử dụng như một thành phần trong các thiết bị cấy ghép y tế, chẳng hạn như trong một số chất độn trống xương. Gelatin cũng là một tác chất cầm máu tại chỗ. Một mảnh gelatin miếng bọt biển có kích thước thích hợp được áp dụng trên vết thương chảy máu, ép một thời gian và gắn vào băng. Quy tắc cầm máu là việc gắn kết các tiểu cầu trong máu nhờ gelatin, kích thích hình thành huyết khối trắng và mạng lưới huyết khối đỏ giúp quá trình đông máu nhanh hơn. 1.3. Tổng quan về curcumin 1.3.1. Giới thiệu về Curcumin Curcumin (CUR) là hoạt chất chiết từ thân rễ của cây nghệ (Curcuma longa Zingiberaceae), chiếm từ 3040%. Chất màu CUR được phân lập vào thế kỷ 19, là thành phần tạo nên khả năng kháng viêm của nghệ 56. CUR có dạng tinh thể nâu đỏ, ánh tím, không tan trong nước, tan trong cồn, ete, chloroform, dung dịch có huỳnh quang màu xanh lục, tan trong acid (màu đỏ tươi), trong kiềm (màu đỏ máu rồi ngả tím). Nhiệt độ nóng chảy 176177 OC 7. Chất màu CUR là một hỗn hợp gồm có: CUR chính thức (còn gọi là CUR I) chiếm 60%. Tên IUPAC: (1E, 6E) 1,7bis (4hydroxy3metoxyphenyl) 1,6heptadien 3,5dion. Công thức phân tử: C21H20O6. CUR II hay monodesmetoxyCUR chiếm 24%. nhỏ. CUR III hay didesmetoxyCUR chiếm 14%. Nếu dùng sắc ký trên giấy sẽ thấy các chất CUR khác nữa nhưng với lượng Hình 1.1 Cây Nghệ và củ Nghệ Một số tác giả đã chứng minh khả năng kháng viêm của CUR và các dẫn chất có liên quan chặt chẽ đến sự hiện diện của nhóm hydroxyl và phenol trong phân tử. Cơ chế của hoạt tính kháng viêm là ức chế prostaglandin và leucotrien. Các nghiên cứu khác lại cho rằng khả năng kháng viêm liên quan đến sự tồn tại của hệ thống β dicarbonylic, hệ thống này còn liên quan đến khả năng chống ký sinh trùng của CUR 89. Hình 1.2. Công thức của curcumin I (a), curcumin II (b) và curcumin III (c 1.3.2. Tác dụng dược lý Sự đa dạng về hoạt tính sinh học và độc tính thấp ngay cả khi sử dụng liều cao đã làm cho CUR trở nên hấp dẫn trong việc sử dụng để điều trị nhiều loại bệnh. Củ nghệ bắt đầu ứng dụng trong y học tại Ấn Độ từ khoảng năm 1900 TCN để chữa trị một loạt các loại bệnh về da, hô hấp, tiêu hóa, đau nhức, các bệnh về gan. Các nghiên cứu khoa học vào cuối thể kỷ 20 đã xác minh CUR đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính sinh học của củ nghệ 710. Dựa trên những nghiên cứu in vitro và trên động vật, các nhà khoa học đưa ra giả thuyết khả năng chữa bệnh hoặc ngăn ngừa bệnh của CUR. 1.3.3. Tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm Nghệ có khả năng chống viêm cấp tính và viêm mạn tính trong các mô hình gây phù bàn chân và gây u hạt thực nghiệm trên chuột cống trắng. CUR và dẫn xuất là những thành phần có hoạt tính chống viêm, tác dụng này có thể do khả năng bắt những gốc oxy hóa tự do có liên quan đến quá trình viêm. Sau đó vào năm 2008 có nghiên cứu đã chứng minh hoạt tính kháng khuẩn của CUR trên một số chủng vi khuẩn. Kết quả cho thấy CUR có khả năng ức chế các chủng vi khuẩn ở các nồng độ khác nhau: Escherichia coli (256 μgml), Staphylococcus aureus (256 μgml), Candida albicans (512 μgml), Pseudomonas aeuroginosa (512 μgml), Enterococcus feacalis (512 μgml) 9. CUR có tác dụng ức chế in vitro sự phát triển của trực khuẩn lao ở nồng độ tối thiểu 25 μgml, ngoài ra còn có tác dụng ức chế Samonella paratyphi và tụ cầu vàng ở 50 μgml. Cao dán nhọt bào chế từ nghệ và một số dược liệu khác điều trị cho 30 bệnh nhân bị mụn nhọt với tỷ lệ khỏi và đỡ là 84%, thời gian điều trị 39 ngày. Việc điều trị đơn giản không phải rạch, trích, không cần dùng kháng sinh, bông băng. CUR được xem là một polyphenol kháng nấm tự nhiên. Mô hình chuột bị nhiễm trùng để điều tra tác động kháng nấm của CUR trên các chủng albican và nonalbican. Kết quả cho thấy CUR ức chế tất cả các chủng thử nghiệm. CUR hiệu quả hơn cả fluconazol trong việc ức chế sự bám dính của các loài Candida, đặc biệt là các chủng phân lập từ miệng của các bệnh nhân AIDS. Ngoài ra CUR có tác dụng kháng virus và ức chế protease của HIV1 (IC50=100 μm) và HIV2 (IC50=250 μm) 1017. 1.3.4. Tác dụng trên da CUR đã được sử dụng để điều trị các bệnh ngoài da như: vẩy nến, xơ cứng bì, ung thư da. CUR bảo vệ da qua cơ chế dập tắt gốc tự do và giảm viêm thông qua sự ức chế các yếu tố trung gian gây viêm. CUR làm giảm thời gian chữa lành vết thương, giảm lắng đọng collagen và tăng mật độ mạch máu ở vùng da bị tổn thương 18. Singer AJ. và cộng sự (2007) đã chứng minh khả năng chữa bỏng của CUR với mô hình gây bỏng trên lưng chuột bằng nước nóng, vết bỏng có diện tích 10x20 mm. Chuột được chọn ngẫu nhiên để điều trị với CUR. Sau 7 ngày, kết quả cho thấy CUR làm giảm hoại tử hoặc tử vong mô ở nhóm nhận được điều trị. Các tác giả đã đưa ra giả thuyết rằng CUR làm giảm chuyển đổi vùng da thiếu máu cục bộ do bỏng đến hoại tử hoàn toàn 19. Phan TT. và cộng sự (2001) cũng đã chứng minh tác dụng bảo vệ da, chữa lành vết thương của CUR bằng thí nghiệm in vitro. CUR khi tiếp xúc với tế bào sừng ở nồng độ 10 mgml và nguyên bào sợi ở nồng độ 2,5 mgml cho thấy CUR có khả năng bảo vệ tế bào da chống lại các yếu tố gây hại là hydrogen peroxide (H2O2) và hypoxanthinexanthine oxidase 16. CUR ức chế vi khuẩn Propiobacterium acnes. Kem nghệ được điều trị cho thỏ đã gây bỏng thực nghiệm cho kết quả tốt. Trong điều trị bỏng, kem nghệ có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, loại trừ tổ chức hoại tử từ bỏng, có tác dụng kích thích tái lập tổ chức và liền sẹo 7. 1.3.5. Các tác dụng khác Năm 2001, Prucksunand C. và cộng sự đã khảo sát trên 45 bệnh nhân tuổi từ 16 60, có triệu trứng loét dạ dày ở nhiều mức độ khác nhau được điều trị với viên nang chứa bột nghệ trong 12 tuần. Cơn đau bụng và khó chịu vùng thượng vị giảm đáng kể sau 2 tuần. Sau 4 tuần, 12 bệnh nhân không còn tìm thấy vết loét qua nội soi, 18 bệnh nhân không còn loét sau 8 tuần. CUR có tính tăng co bóp túi mật, do đó nghệ có tính thông mật, lợi tiểu, giải độc gan. Cao lỏng toàn phần của nghệ trong ethanol có tác dụng làm giảm LDL và lipid toàn phần trong huyết tương thỏ đã gây tăng cholesterol máu thực nghiệm 17. Khả năng chống oxy hóa của CUR đã được Motterlini R và cộng sự (2000) chứng minh bằng các thí nghiệm in vitro và in vivo, nhằm kiểm tra tác dụng của CUR trên heme oxygenase (HO) một chất có khả năng bảo vệ tế bào và chống lại sự tạo thành các gốc tự do. Kết quả cho thấy CUR là chất cảm ứng mạnh HO trong tế bào mạch máu nội mô. Đồng thời ức chế protoporphyrin IX, một chất ức chế hoạt động của HO, do đó làm tăng HO hoạt động. CUR làm vô hiệu hóa tế bào ung thư và ngăn chặn hình thành các tế bào ung thư mới mà không làm ảnh hưởng đến các tế bào lành tính bên cạnh. CUR can thiệp vào hoạt động sao chép của NFκB, ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư vú, buồng trứng, tuyến tụy, miệng, bàng quang, tuyến tiền liệt. Bằng phương pháp quang phổ huỳnh quang Kunwar A. và cộng sự (2008) đã cho thấy rằng độc tính của CUR cao hơn đáng kể trong các tế bào khối u so với các tế bào bình thường 11,15. 1.4. Các đường dẫn truyền hoạt chất vào da 22 Lớp stratum corneum nằm ngoài cùng của da là mạng lưới các tế bào rất mỏng đã bị keratin hóa, được bao bọc bởi lớp sừng và nằm trong lớp lipid. Đây chính là rào chắn đầu tiên cho sự thẩm thấu vào da, có khoảng 15 30 tầng tế bào bị keratin hóa. Đây là rào chắn mà hoạt chất và chất vận chuyển phải đi qua. Có bốn con đường chính cho cả phân tử phân cực và không phân cực thẩm thấu qua lớp stratum corneum. Có nhiều con đường dẫn truyền thuốc qua da, sau đây chúng tôi mô tả một số con đường tiêu biểu. 1.4.1. Dẫn truyền xuyên qua chất gian bào (intercellular) Hình 1.3. Dẫn truyền giữa các tế bào Sự dẫn truyền xảy ra giữa các tế bào và xuyên qua lipid gian bào. Vùng này chiếm 5% 30% tổng thể tích của lớp stratum corneum. Nước là một dạng thấm qua da bằng con đường này. Hìn 1.4. Các đường thấm thuốc qua da Lớp sừng được mô tả là một mô hình “gạch vữa”. “Gạch” là lớp tế bào bị keratin hóa và “vữa” là lớp lipid liên tục bao bọc xung quanh. Sự xắp xếp quanh co này chính là chức năng cản của da. Những chất tan được trong dầu sẽ đi vào lớp “vữa” đi vào bên trong da. 1.4.2. Dẫn truyền xuyên qua các tế bào (transcellular) Hình 1.5. Các đường dẫn truyền xuyên qua da Sự dẫn truyền xảy ra bằng cách đi xuyên qua lớp corneocytes bị keratin hóa. Toàn bộ các ceramide và acid béo tự do tìm thấy trong lớp tế bào sừng đều có dạng hình que hay hình trụ. Điều này giúp chúng tạo một cấu trúc có trật tự cao. Ngoài ra còn có sự hiện của cholesterol giúp cho lớp sừng trở nên lưu động, không bị hóa rắn. Cholesterol giúp da trở nên mềm dẻo và những chất tan được trong dầu cũng thích hợp đi vào da theo con đường này. Đi sâu vào bên trong là lớp tế bào chưa bị keratin hóa. Màng tế bào chủ yếu là lớp kép lipid, rải rác nhiều phân tử protein. Lớp lipid ngăn không cho nước hoặc chất tan trong nước qua lại giữa hai khu vực trong tế bào và ngoài tế bào. Tuy nhiên, các phân tử protein lại có thể vận chuyển chất qua màng tế bào. Các phân tử protein choán chỗ ở lớp kép lipid, chỗ đó là con đường thay thế có nghĩa là phân tử hay ion nào không qua được lớp lipid thì có thể qua được bằng con đường này. Phần lớn đó là các protein xuyên có khả năng vận chuyển. Ngoài ra còn có protein kênh và protein mang. Protein kênh có một khoảng sũng nước chạy xuyên suốt qua phân tử, cho phép các ion và các phân tử tự do qua lại. Protein mang gắn với chất cần vận chuyển, nó biến dạng hình thái đưa chất được vận chuyển đi qua các khe bên trong phân tử protein, nhờ đó qua màng sang mặt bên kia của màng. Hai protein kênh và protein mang đều có tính chọn lọc rất cao đối với loại phân tử hoặc ion mà nó đưa xuyên qua màng. Trong đó khuếch tán đơn thuần là con đường mà nước di chuyển rất nhanh mặc dù nước không tan trong lipid. Chỉ một phần nhỏ nước đi qua kênh protein. Con đường khuếch tán đơn thuần này cũng là con đường của lipid và chất tan trong mỡ đi qua màng tế bào khi không có protein vận chuyển. 1.4.3. Dẫn truyền qua tuyến nhờn của lỗ chân lông hoặc tuyến mồ hôi Hình 1.6. Mô tả các đường dẫn truyền 1: Dẫn truyền qua các tế bào và giữa các tế bào. 2: Dẫn truyền qua chân lông. 3: Dẫn truyền qua tuyến mồ hôi . Sự dẫn truyền xảy ra thông qua nan lông. Chủ yếu là các phân tử ưa béo hoặc đã được kết hợp với chất hoạt động bề mặt và glycol. Những chất làm tăng quá trình thấm qua da. Mặc dầu mật độ khuếch tán bằng con đường này chỉ khoảng 0.1 % tổng bề mặt da nhưng là con đường chính của các phân tử tích điện và phân cực lớn.
BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO COMPOSITE XỐP CỦA CURCUMIN/CHITOSAN/GELATIN ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG Mã số: Chủ nhiệm đề tài: TP HỒ CHÍ MINH, 20 i MỤC LỤC DANH SÁCH THÀNH VIÊN THỰC HIỆN ĐỀ TÀI .iii Danh mục bảng biểu vi Danh mục hình vii THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Mở đầu CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chitosan 1.1.1 Chitosan 1.1.2 Tính kháng khuẩn chitosan 1.1.3.Ứng dụng chitosan 10 1.2 Tổng quan Gelatin 13 1.2.1 Giới thiệu Gelatin 13 1.2.2 Ứng dụng gelatin 13 1.3 Tổng quan curcumin 14 1.3.1 Giới thiệu Curcumin 14 1.3.2 Tác dụng dược lý 16 1.3.3 Tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm .16 1.3.4 Tác dụng da 17 1.3.5 Các tác dụng khác 18 1.4 Các đường dẫn truyền hoạt chất vào da [22] 18 1.4.1 Dẫn truyền xuyên qua chất gian bào (intercellular) 19 1.4.2 Dẫn truyền xuyên qua tế bào (transcellular) 20 1.4.3 Dẫn truyền qua tuyến nhờn lỗ chân lông tuyến mồ hôi 21 1.4.4 Dẫn truyền thông qua lỗ phân cực 21 1.4.5 Dẫn truyền hoạt chất vào da dạng tan dầu 22 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 23 2.2 Chuẩn bị nguyên liệu 23 2.2.1 Pha dung dịch ban đầu 23 2.2.2 Phương pháp chế tạo màng xốp curcumin/chitosan/gelatin .24 2.2.3 Khảo sát độ thấm nước .25 2.2.4 Khảo sát khả giải phóng thuốc (giải phóng curcumin) 25 2.2.5 Kiểm tra vi sinh sản phẩm màng 26 2.2.6 Khảo sát khả kháng khuẩn 28 2.2.7 Xác định cấu trúc vật liệu 28 2.2.8 Khảo sát tác dụng làm mau lành vết thương thỏ 29 2.2.9 Nhuộm mô Hematoxylin - Eosin (H&E) 30 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 32 3.1 Tổng hợp xác định cấu trúc màng xốp composite 32 3.2 Khả thấm nước sản phẩm 35 3.3 Khả giải phóng curcumin sản phẩm 36 3.4 Kết kiểm tra khả kháng khuẩn 38 3.5 Khảo sát tác dụng mau lành vết thương thỏ 40 3.6 Khảo sát khả lành vết thương nhuộm mô 44 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 Danh mục bảng biểu Bảng 2.1 Bảng nguyên liệu nghiên cứu 23 Bảng 2.2 Bảng thiết bị nghiên cứu,kiểm nghiệm 23 Bảng 2.3 Bảng đơn công nghệ phối trộn 24 Bảng 3.1 Khả thấm nước độ khối lượng màng xốp .36 Bảng 3.2 Khả giải phóng curcumin theo thời gian pH 7.4 37 Bảng 3.3 Diện tích cịn lại vết thương lô 40 Danh mục hình Hình 1.1 Cây Nghệ củ Nghệ 15 Hình 1.2 Công thức curcumin I (a), curcumin II (b) curcumin III (c 16 Hình 1.3 Dẫn truyền tế bào .19 Hìn 1.4 Các đường thấm thuốc qua da 19 Hình 1.5 Các đường dẫn truyền xuyên qua da .20 Hình 1.6 Mơ tả đường dẫn truyền 21 Hình 3.1 Màng xốp curcumin/chitosan/gelatin (a) chitosan/gelatin (b) 32 Hình 3.2 Phổ hồng ngoại màng chitosan/gelatin 33 Hình 3.3 Ảnh SEM màng chitosan-gelatin khơng có curcumin (a) Mẫu 3, (b) Mẫu (c) Mẫu Bề mặt cắt ngang màng xốp chitosan/gelatin (d) Mẫu 3, (e) Mẫu (f) Mẫu .34 Hình 3.4 Ảnh SEM màng chitosan-gelatin có curcumin .34 Hình 3.5 Sự khối lượng màng xốp 36 Hình 3.6 Khả giải phóng thuốc màng xốp .38 Hình 3.7.Kết kiểm tra vịng kháng khuẩn Pseudomonas aeruginosa mẫu mâu sau 24h (a) sau 48h (b) 39 Hình 3.8 Kết kiểm tra vịng kháng khuẩn Pseudomonas aeruginosa mẫu có curcumin sau 24h (a) sau 48h (b) 39 Hình 3.9 Diễn biến độ co vết thương thử nghiệm 41 Hình 3.10 Diễn tiến vết thương thỏ từ ngày đến ngày 21 43 Hình 3.11 Da thỏ ngày 21 nhuộm H&E lô (a), lô (b) lô (c) 44 TÓM TĂT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU CURCUMIN/CHITOSAN/GELATIN CHẾ TẠO COMPOSITE ỨNG DỤNG TRONG XỐP CỦA ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG CURCUMIN-LOADED CHITOSAN/GELATIN COMPOSITE SPONGE FOR WOUND HEALING APPLICATION Abstract Three composite sponges were made with 10% of curcumin and by using polymers namely chitosan and gelatin with various ratios The chemical structure and morphology were evaluated by FTIR and SEM These sponges were evaluated for water absorption capacity, antibacterial activity, in vitro drug release and in vivo wound healing studies by excision wound model using rabbits The in vivo study presented a greater wound closure in wounds treated with curcumin-composite sponge than those of composite sponge without curcumin and untreated group These obtained results showed that combination of curcumin, chitosan and gelatin could improve the wound healing activity in comparison to chitosan and gelatin without curcumin Keywords: chitosan, curcumin, drug delivery system, gelatin, wound healing activity Tóm tắt Màng composite xốp chitosan/gelatin tổng hợp với 10% curcumin phương pháp khô lạnh Màng chitosan gelatin tổng hợp với tỷ lệ khác Cấu trúc hóa học hình thái bề mặt đánh giá phương pháp hóa lý như: FTIR SEM Khả hấp phụ nước, hoạt tính kháng khuẩn, khả giải phóng thuốc chữa lành vết thương sử dụng thỏ nghiên cứu đề tài Màng tạo thành có độ linh hoạt, có tính thấm tốt (2300%) có khả kháng khuẩn (đặc biệt Pseudomonas aeruginosa) Màng tạo thành từ chitosan, gelatin curcumin có khả đem lại nhiều lợi ích cho ngành cơng nghiệp sản xuất sản phẩm chữa trị vết thương Chúng tiến hành khảo sát khả làm lành vết thương thỏ Kết thu sau: Sản phẩm có tác dụng làm mau lành vết thương rõ rệt so với lô chứng Đồng thời rút ngắn thời gian điều trị so với lô đối chứng Màng xốp chitosan/gelatin làm tăng khả làm lành thương động vật có curcmin khơng có curcumin Khi có kết hợp curcumin thời gian làm lành vết thương rút ngắn Khả làm vết thương kiểm tra thông qua độ co vết thương mẫu mô da thỏ dựa nhuộm H&E Từ khóa: Curcumin, chitosan, gelatin, khả làm lành vết thương Mở đầu Vật liệu màng composite nghiên cứu nhiều Việt nam giới, chúng có tính chất vượt trội so với vật liệu thơng thường như: có độ cứng độ bền học cao Vật liệu y sinh có nguồn gốc từ composite xốp ứng dụng nhiều y học, đặc biệt điều trị vết thương, miếng composite xốp có khả thấm nước cao, đồng thời dẫn truyền số loại thuốc chữa bệnh Chitosan có vỏ tôm cua Ở nước ta, sản phẩm tôm đông lạnh chiếm sản lượng lớn sản phẩm đông lạnh Vỏ tôm nguồn nguyên liệu tự nhiên dồi dào, rẻ tiền, có sẵn quanh năm, nên thuận tiện cho việc cung cấp chitin chitosan Nước ta năm có sản lượng chitin/chitosan khoảng 1.000 tấn/ năm Ở Việt Nam, nghiên cứu gần thành công với ứng dụng Chitosan làm vỏ bảo quản thực phẩm tươi sống, dễ hư hỏng cá, thịt, rau mà không làm màu, mùi vị sản phẩm Ngồi chitosan cịn chất hỗ trợ trình tạo tủa quy trình xử lý nước, khả hấp phụ kim loại nặng như: Cd2+, Cr3+, Cr6+, Hg2+, Pb2+, Cu2+…, chất giữ ẩm tạo gel mỹ phẩm, dược phẩm Một số nghiên cứu cho thấy màng chitosan có khả ứng dụng điều trị vết bỏng, nhiên màng chitosan thường có khả thấm nước thẩm thấu oxy Curcumin (CUR) hoạt chất chiết từ thân rễ nghệ (Curcuma longa Zingiberaceae), chiếm từ 30-40% Chất màu CUR phân lập vào kỷ 19, thành phần tạo nên khả kháng viêm nghệ CUR có dạng tinh thể nâu đỏ, ánh tím, không tan nước, tan cồn, ete, chloroform, dung dịch có huỳnh quang màu xanh lục, tan acid (màu đỏ tươi), kiềm (màu đỏ máu ngả tím) Nhiệt độ nóng chảy 176-177 oC Curcumin biết đến tác nhân hữu ích cho việc phịng điều trị ung thư bàng quang, vòm miệng, dày, cổ tử cung ung thư da Ngoài ra, chất curcumin chứng minh chất chống oxy hóa chống viêm nhiễm [1] Mặc dù, curcumin có ứng dụng hiệu an toàn cho điều trị ung thư phòng chống ung thư, curcumin tồn số nhược điểm như: khả hòa tan nước thấp pH sinh lý, thời gian bán phân hủy sinh học ngắn, hấp thụ hạn chế, khả dụng sinh học kém, trình trao đổi chất tiết diễn nhanh Các nỗ lực để khắc phục hạn chế bao gồm tổng hợp chất tương tự curcumin, sử dụng tá dược, phát triển hệ dẫn truyền curcumin liposome hạt nano [1-2] Ở Việt Nam, có nhiều nhóm nghiên cứu, dự án liên quan đến curcumin, nhiên, dự án chủ yếu tập trung vào việc trích ly chất curcumin từ Curcuma longa Một vài dự án quan tâm đến hoạt tính sinh học ứng dụng chất curcumin lĩnh vực y sinh Những nghiên cứu cho thấy hiệu số phương pháp cho trích ly chất curcumin từ Curcuma longa Tuy nhiên, có cơng trình nghiên cứu hệ dẫn truyền thuốc ứng dụng hệ dẫn truyền thuốc cách sử dụng curcumin Trong nghiên cứu này, tổng hợp hệ dẫn truyền chất curcumin để vượt qua trở ngại hệ thống dẫn truyền trực tiếp thông thường chất curcumin Màng xốp y sinh loại vật liệu gồm polimer có cấu trúc xốp, diện tích bề mặt riêng lớn để giữ hoạt chất vận chuyển chúng Loại phối hợp gel, kem, chất lỏng dạng bột Những polimer có tự nhiên cellulose, chitosan, geltain tổng hợp polyacrylates, polymethylacrylates, polyamide…Những hạt hệ thống mở, hoạt chất đưa vào phóng thích đơn giản đường khuếch tán Tính tan hợp hoạt chất polimer yếu tố quan Kỹ thuật thể tính ổn định hóa học cao sức bền học cao tương hợp với hầu hết hoạt chất sử dụng Chúng tạo cảm giác thoải mái dễ lan rộng da mà không gây trầy xướt cho da CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chitosan 1.1.1 Chitosan Chitosan tạo thành qua q trình deacetyl hóa (loại bỏ nhóm -COCH 2) chitin Đun sơi chitin dung dịch kiềm đặc điều kiện thích hợp thu chitosan Trên thị trường có nhiều sản phẩm chitosan với mức độ deacetyl hóa khác nhau, có trọng lượng phân tử độ nhớt khác nhau, có tính chất, chức khác Chitin chitosan giống cấu trúc, khác độ acetyl hố hay lượng nhóm –NHCOCH nhóm –NH2 phân tử Khơng có enzym tiêu hóa thủy phân đặc hiệu chitosan Tuy nhiên, chitosan tiêu hóa chút thơng qua tác động không đặc hiệu số enzym tiêu hóa amylase lipase Chitosan chứa nhiều nhóm –NH nên tan dung dịch axit Khi tan dung dịch axit, chitosan tạo gel tráng mỏng thành màng Ứng dụng tính chất nên chitosan dùng để tạo màng không thấm bảo quản trái hay dùng hỗ trợ điều trị viêm loét dày, tá tràng (trong môi trường acid dày, chitosan tạo gel che phủ, bảo vệ niêm mạc) 1.1.2 Tính kháng khuẩn chitosan Gần nghiên cứu tính kháng khuẩn chitosan chitosan có khả ức chế phát triển vi khuẩn Trong nghiên cứu rộng tính kháng khuẩn chitosan từ tơm chống lại E.coli, người ta tìm nhiệt độ cao pH acid thức ăn làm tăng ảnh hưởng chitosan đến vi khuẩn Nó chế ức chế vi khuẩn chitosan liên kết chuỗi polymer chitosan với ion kim loại bề mặt vi khuẩn làm thay đổi tính thấm màng tế bào Khi bổ sung chitosan vào mơi trường, tế bào vi khuẩn chuyển từ tích điện âm sang tích điện dương Quan sát kính hiển vi huỳnh quang cho thấy chitosan không trực tiếp hoạt động ức chế vi khuẩn E.coli mà kết lại tế bào tích điện dương màng vi khuẩn Chitosan Ncarboxybutyl, polycation tự nhiên, tương tác hình thành polyelectrolyte với polymer acid tính có bề mặt vi khuẩn, làm dính kết lượng vi khuẩn với cho kết tốt Trong điều trị bỏng, kem nghệ có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, loại trừ tổ chức hoại tử từ bỏng, có tác dụng kích thích tái lập tổ chức liền sẹo [7] 1.3.5 Các tác dụng khác Năm 2001, Prucksunand C cộng khảo sát 45 bệnh nhân tuổi từ 1660, có triệu trứng loét dày nhiều mức độ khác điều trị với viên nang chứa bột nghệ 12 tuần Cơn đau bụng khó chịu vùng thượng vị giảm đáng kể sau tuần Sau tuần, 12 bệnh nhân khơng cịn tìm thấy vết lt qua nội soi, 18 bệnh nhân khơng cịn lt sau tuần CUR có tính tăng co bóp túi mật, nghệ có tính thơng mật, lợi tiểu, giải độc gan Cao lỏng tồn phần nghệ ethanol có tác dụng làm giảm LDL lipid toàn phần huyết tương thỏ gây tăng cholesterol máu thực nghiệm [17] Khả chống oxy hóa CUR Motterlini R cộng (2000) chứng minh thí nghiệm in vitro in vivo, nhằm kiểm tra tác dụng CUR heme oxygenase (HO)- chất có khả bảo vệ tế bào chống lại tạo thành gốc tự Kết cho thấy CUR chất cảm ứng mạnh HO tế bào mạch máu nội mô Đồng thời ức chế protoporphyrin IX, chất ức chế hoạt động HO, làm tăng HO hoạt động CUR làm vơ hiệu hóa tế bào ung thư ngăn chặn hình thành tế bào ung thư mà không làm ảnh hưởng đến tế bào lành tính bên cạnh CUR can thiệp vào hoạt động chép NF-κB, ức chế tăng sinh tế bào ung thư vú, buồng trứng, tuyến tụy, miệng, bàng quang, tuyến tiền liệt Bằng phương pháp quang phổ huỳnh quang Kunwar A cộng (2008) cho thấy độc tính CUR cao đáng kể tế bào khối u so với tế bào bình thường [11,15] 1.4 Các đường dẫn truyền hoạt chất vào da [22] Lớp stratum corneum nằm da mạng lưới tế bào mỏng bị keratin hóa, bao bọc lớp sừng nằm lớp lipid Đây rào chắn cho thẩm thấu vào da, có khoảng 15- 30 tầng tế bào bị keratin hóa Đây rào chắn mà hoạt chất chất vận chuyển phải qua Có bốn đường cho phân tử phân cực không phân cực thẩm thấu qua lớp stratum corneum Có nhiều đường dẫn truyền thuốc qua da, sau mô tả số đường tiêu biểu 1.4.1 Dẫn truyền xuyên qua chất gian bào (intercellular) Hình 1.3 Dẫn truyền tế bào Sự dẫn truyền xảy tế bào xuyên qua lipid gian bào Vùng chiếm 5% - 30% tổng thể tích lớp stratum corneum Nước dạng thấm qua da đường Hìn 1.4 Các đường thấm thuốc qua da Lớp sừng mơ tả mơ hình “gạch - vữa” “Gạch” lớp tế bào bị keratin hóa “vữa” lớp lipid liên tục bao bọc xung quanh Sự xắp xếp quanh co chức cản da Những chất tan dầu vào lớp “vữa” vào bên da 1.4.2 Dẫn truyền xuyên qua tế bào (transcellular) Hình 1.5 Các đường dẫn truyền xuyên qua da Sự dẫn truyền xảy cách xuyên qua lớp corneocytes bị keratin hóa Tồn ceramide acid béo tự tìm thấy lớp tế bào sừng có dạng hình que hay hình trụ Điều giúp chúng tạo cấu trúc có trật tự cao Ngồi cịn có cholesterol giúp cho lớp sừng trở nên lưu động, khơng bị hóa rắn Cholesterol giúp da trở nên mềm dẻo chất tan dầu thích hợp vào da theo đường Đi sâu vào bên lớp tế bào chưa bị keratin hóa Màng tế bào chủ yếu lớp kép lipid, rải rác nhiều phân tử protein Lớp lipid ngăn không cho nước chất tan nước qua lại hai khu vực tế bào tế bào Tuy nhiên, phân tử protein lại vận chuyển chất qua màng tế bào Các phân tử protein choán chỗ lớp kép lipid, chỗ đường thay có nghĩa phân tử hay ion không qua lớp lipid qua đường Phần lớn protein xuyên có khả vận chuyển Ngồi cịn có protein kênh protein mang Protein kênh có khoảng sũng nước chạy xuyên suốt qua phân tử, cho phép ion phân tử tự qua lại Protein mang gắn với chất cần vận chuyển, biến dạng hình thái đưa chất vận chuyển qua khe bên phân tử protein, nhờ qua màng sang mặt bên màng Hai protein kênh protein mang có tính chọn lọc cao loại phân tử ion mà đưa xuyên qua màng Trong khuếch tán đơn đường mà nước di chuyển nhanh nước không tan lipid Chỉ phần nhỏ nước qua kênh protein Con đường khuếch tán đơn đường lipid chất tan mỡ qua màng tế bào khơng có protein vận chuyển 1.4.3 Dẫn truyền qua tuyến nhờn lỗ chân lông tuyến mồ Hình 1.6 Mơ tả đường dẫn truyền 1: Dẫn truyền qua tế bào tế bào 2: Dẫn truyền qua chân lông 3: Dẫn truyền qua tuyến mồ hôi Sự dẫn truyền xảy thông qua nan lông Chủ yếu phân tử ưa béo kết hợp với chất hoạt động bề mặt glycol Những chất làm tăng trình thấm qua da Mặc dầu mật độ khuếch tán đường khoảng 0.1 % tổng bề mặt da đường phân tử tích điện phân cực lớn 1.4.4 Dẫn truyền thông qua lỗ phân cực Sự dẫn truyền “đảo nước” tế bào bao quanh lipid phân cực, lipid có đầu phân cực ceramides 1.4.5 Dẫn truyền hoạt chất vào da dạng tan dầu Nhìn chung có khác biệt sản phẩm chăm sóc cá nhân thuốc độ thấm sâu mong muốn vào da Ví dụ sản phẩm chăm sóc cá nhân kem chống nắng khử mùi thiết kế để lưu lại bề mặt da lớp stratum corneum Do bề mặt da tích điện âm, nhiều lotion làm chứa polymer cation để bám bề mặt da Ngược lại mục tiêu thuốc thấm sâu vào lớp da Một số sản phẩm kích thích mọc tóc hay trị mụn thiết kế để đến lỗ chân lông Trong tất trường hợp, hoạt chất muốn sâu vào da phải khuếch tán qua lớp stratum corneum, qua lỗ chân lông tuyến mồ hôi Hầu hết, phân tử lớn 500 không thấm vào da từ hệ thống đơn giản Để đạt hoạt chất dẫn truyền vào da nồng độ vừa đủ việc sử dụng chất tăng cường dẫn truyền cần thiết CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Hóa chất, dụng cụ thiết bị Bảng 2.1 Bảng nguyên liệu nghiên cứu Stt Nguyên liệu Nơi cung cấp Curcumin thành phẩm 95 % Viện thực phẩm chức Chitosan Việt Nam Gelatin độ Gum 150 Hàn Quốc Acid acetic glacial Trung Quốc Cồn tuyệt đối 99,5 Việt Nam Bảng 2.2 Bảng thiết bị nghiên cứu,kiểm nghiệm Stt Thiết bị Mã số Nguồn gốc Cân phân tích BP211S Sartorius Đức Cân điện tử TE 412 Sartorius Đức Bể siêu âm ELMA, S120 Đức Máy khuấy từ gia nhiệt Stuart, CB 162 Anh Máy đông khô Christ 1-4LD plus Đức Buồng soi UV Vilber Lourmat, CN-6 Pháp Tủ lạnh - 40 0C MDF-U1 Sanyo 4821 Nhật Buồng thổi khí vơ trùng ngang 2.2 Chuẩn bị nguyên liệu 2.2.1 Pha dung dịch ban đầu ESCO, AHC-4A1 Singapore Pha dung dịch chitosan 1%: cân g chitosan hòa tan vào 100 mL dung dịch acid acetic 0,5 M Dùng máy khuấy từ khuấy sau để 24 để chitosan tan hoàn toàn Đem lọc cặn thu dung dịch chitosan Pha dung dịch gelatin 10% (w/v): cân 10 gam gelatin hòa tan 100 ml nước cất lần khuấy 50 oC Pha dung dịch curcumin 0,5% (w/v): cân 0,5 gam curcumin hòa tan 100 ml cồn 99,5o, ta thu dung dịch curcumin 0,5% 2.2.2 Phương pháp chế tạo màng xốp curcumin/chitosan/gelatin a Màng xốp curcumin/chitosan/gelatin Dung dịch chitosan gelatin pha phối trộn theo tỷ lệ 3:1 (v/v), sau khuấy máy khuấy từ Tiến hành thêm vào dung dịch mg/ml dung dịch curcumin 0.5 % Dung dịch khuấy thành hỗn hợp đồng máy khuấy từ, sau đuổi bọt khí bể siêu âm phút Lấy 30 ml dung dịch curcumin/chitosan/gelatin cho vào đĩa petri (90x15 mm), đông lạnh đĩa petri chứa dung dịch tủ lạnh – 40 0C 24 giờ, sau đem đông khô mẫu giờ, ta thu màng xốp curcumin/chitosan/gelatin với ty lệ thể tích 3:1 Các thí nghiệm tạo vật liệu màng xốp với tỷ lệ 1:1 1:3 tiến hành tương tự Mối thí nghiệm tiến hành lặp lại lần Bảng 2.3 Bảng đơn công nghệ phối trộn Chitosan 1% Gelatin 10% Curcumin Mẫu Mẫu Mẫu 1 3 1 10%/0 10%/0 10%/0 b Màng xốp chitosan/gelatin không chứa curcumin Màng xốp tiến hành tổng hợp việc tổng hợp màng xện bước bỏ qua giai đoạn thêm curcumin 0.5% Tiến hành đông khô giờ, ta màng chitosan/gelatin không chứa curcumin 2.2.3 Khảo sát độ thấm nước Độ thấm nước khả trương nở môi trường nước giúp màng dễ hịa tan giải phóng hoạt chất có ích nhờ vào chất chitosan gelatin Cách tiến hành: cắt mẫu có diện tích x cm, chọn vùng có độ dày Cân mẫu ban dầu ta mo Ta đo khả hấp thu nước mẫu khoảng thời gian cách thả mẫu vào đĩa petri có chứa nước Sau 24 h lấy mẫu ra, dùng khăn giấy thấm khô mẫu đem cân lại mẫu mt, tính tốn theo cơng thức: �� = �� − �� � × 100% Ta tìm phần trăm chênh lệch khối lượng lần đo chênh lệch khả nước mẫu Trong đó: wt: phần trăm chênh lệch khối lượng mẫu sau thời gian t (%) m0: khối lượng mẫu ban đầu (g) mt: khối lượng mẫu thời điểm t (g) 2.2.4 Khảo sát khả giải phóng thuốc (giải phóng curcumin) Để khảo sát khả giải phóng curcumin màng, ta chuẩn bị mẫu 1, mẫu 2, mẫu 3, có chứa curcmin với diện tích 3×3 cm, chuẩn bị dung dịch pH = 7.4 dung dịch với pH dịch thể người Dung dịch pH = 7.4 đươc chuẩn bị cách pha dung dịch gồm 11.866 g Na2HPO4.H2O 1/15M lít nước cất, dung dịch gồm 9.073 g KH2PO4 1/15M lít nước cất, sau pha trộn 81.8 ml dung dịch 18.2 ml dung dịch để có dung dịch pH = 7.4 Tiến hành đo mẫu chuẩn (mẫu nước trắng) máy UV để hiệu chỉnh máy Tiếp theo ta ngâm mẫu có diện tích x cm chuẩn bị vào 20 ml dung dịch đệm có pH = 7.4, sau phút lấy phần dung dịch ngâm mẫu cho vào ống cuvet đặt vào máy đo quang ghi nhận kết quả, thí nghiệm kết thúc giá trị hiển thị máy không thay đổi hay không tăng lên Nồng độ curcumin dung dịch xác định lập đường chuẩn quan hệ nồng độ mật độ quang Đường chuẩn curcumin cách pha dung dịch curcumin theo nồng độ 0.4% giảm dần đến 0.001%, nồng độ ta cho ml vào ống cuvet, cho vào máy đo quang, ghi nhận kết thiết lập đồ thị liên hệ nồng độ (%) giá trị mật độ quang ta có đường chuẩn curcumin, từ ta so sánh khả giải phóng curcumin mơi trường sản phẩm màng 2.2.5 Kiểm tra vi sinh sản phẩm màng Mục đích kiểm tra vi sinh để kiểm tra trình bảo quản sản phẩm, bề mặt màng bảo quản khơng tốt có nguy bám bụi bẩn môi trường cho vi sinh vật, nấm men nấm mốc phát triển Quy trình kiểm tra vi sinh gồm quy trình kiểm tra tổng vi sinh vật hiếu khí, tổng nấm men nấm mốc phát bốn vi sinh vật khơng có ngành dược Quy trình kiểm tra tổng vi sinh vật hiếu khí phương pháp tiếp xúc tiến hành từ bước chuẩn bị mẫu thử 10 x 10 cm, chuẩn bị môi trường PCA (Cetrimid Agar), dụng cụ hấp tiệt trùng nồi hấp nhiệt độ 121 oC 15 phút Ghi ký hiệu nhận dạng lên đĩa (ngày, tháng, môi trường, tên mẫu…) Môi trường PCA sau hấp tiệt trùng để nguội khoảng 55 oC bể ổn nhiệt Đổ khoảng 25 ml môi trường PCA vào đĩa RODAC hấp tiệt trùng tủ cấy (LAF) Chờ mơi trường đơng, cho tiếp xúc hồn tồn lên bề mặt màng (với diện tích 100 cm2) Đậy nắp lại đem ủ 37 oC 24 - 72 Đọc ghi kết sau 24 Lấy kết tổng số vi sinh vật đĩa RODAC vị trí lấy mẫu để xác định số vi sinh vật (CFU) diện tích đĩa 33 cm từ quy tổng số CFU 100 cm2 Ghi nhận kết dựa theo Hội thảo 11 y tế cho màng dược phẩm (≤ 190 CFU/100cm2) Quy trình kiểm tra tổng số nấm men nấm mốc sản phẩm phương pháp tiếp xúc, tiến hành chuẩn bị mẩu thử, dụng cụ, mơi trường tương tự quy trình kiểm tra vi sinh vật hiếu khí thay môi trường PCA (Cetrimid Agar) SA (Sabouraud Dextrose Agar), đem ủ tủ mát 25 oC 72 Ghi nhận kết tổng nấm men, nấm mốc ≤19 CFU/100cm2 đạt Phát bốn vi sinh vật gây bệnh: Cắt khoảng 100 cm mẫu cho vào 100 ml môi trường casein soybean digest broth, sau đem ủ nhiệt độ 37 oC 24 48 Xem kết quả: mẫu dương tính (có váng, đục) tiến hành thử nghiệm tìm vi sinh vật gây bệnh Tìm E.coli: Cấy ria từ môi trường glucose sang môi trường EMB que cấy Đem ủ 37 oC 24 - 48 Nếu khơng phát khuẩn lạc màu đen có ánh kim dừng thí nghiệm Nếu phát khuẩn lạc màu đen có ánh kim thực bước bên dưới: tiến hành nhuộm gram, quan sát kính hiển vi, phát trực khuẩn gram âm, hình que, có màu hồng nghi ngờ có E.coli Tiếp tục thực phản ứng Indol để khẳng định E Coli: dùng que cấy lấy khuẩn lạc nghi ngờ môi trường EMB Cho vào ống nghiệm chứa sẵn môi trường pepton Đem ủ 37 oC 24 - 48 Thêm 0.2 ml - 0.3 ml thuốc thử Kovac vào ống nghiệm chứa sẵn môi trường pepton, để khoảng 30 phút Phản ứng Indol dương tính lớp chất lỏng bên màu đỏ, kết luận có E.coli Tìm Pseudomonas Aeruginosa: Cấy ria từ môi trường glucose sang môi trường Cetrimide, que cấy Đem ủ 37 oC 24 - 48 Nếu phát khuẩn lạc màu vàng, có ánh xanh tiến hành nhuộm gram Quan sát kính hiển vi, phát trực khuẩn gram âm, hình que, có màu hồng nghi ngờ có Pseudomonas Aeruginosa Tiếp tục thực phản ứng Oxydase để khẳng định Pseudomonas Aeruginosa Dùng que cấy, lấy khuẩn lạc nghi ngờ môi trường Cetrimide Bôi lên khoanh giấy lọc tẩm N,N-dimethyl p-phenylendiamine dihydrochloride 1% pha Phản ứng Oxydase dương tính xuất màu đỏ tía sau - 10 giây chuyển sang màu đen sau 10 - 30 phút Phản ứng Oxydase dương tính kết luận có Pseudomonas Aeruginosa Tìm Samonella: Cấy ria từ môi trường glucose sang môi trường BSA, que cấy Đem ủ 37 oC 24 - 48 Nếu phát khuẩn lạc màu nâu màu xanh tiếp tục tiến hành nhuộm gram Quan sát kính hiển vi, phát trực khuẩn gram âm, hình que, có màu hồng nghi ngờ có Samonella Tiếp tục thực phản ứng kháng huyết học Trước tiến hành, phải kiểm tra hoạt tính kháng huyết loài Salmonella biết Nhỏ lên lame giọt nước muối sinh lý giọt kháng huyết đa giá Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường BSA, trộn với nước muối sinh lý để hỗn hợp đồng Đây mẫu kiểm tra âm tính Làm lại bước thay nước muối sinh lý giọt kháng huyết Đối với mẫu thử, đảo hỗn hợp cách nghiêng lame phút Quan sát kết quả: phản ứng dương tính có dấu hiệu ngưng kết mức độ Phản ứng kháng huyết học dương tính kết luận có Samonella Tìm Staphylococcus Aureus: Cấy ria từ môi trường glucose sang môi trường MSA, que cấy Đem ủ 37 oC 24 - 48 Nếu phát khuẩn lạc màu vàng tiếp tục tiến hành nhuộm gram, quan sát kính hiển vi, phát cầu khuẩn gram dương, xếp thành hình chùm nho, có màu tím, nghi ngờ có Staphylococcus Aureus Tiếp tục thực phản ứng Coagulase: Dùng que cấy, lấy khuẩn lạc nghi ngờ từ môi trường MSA Cho vào ống nghiệm chứa sẵn 0.5 ml huyết tương thỏ đông khô, đem ủ 37 oC, quan sát ống nghiệm sau Phản ứng Coagulase dương tính có tượng đơng tụ Phản ứng Coagulase dương tính kết luận có Staphylococcus Aureus 2.2.6 Khảo sát khả kháng khuẩn Màng chitosan/gelatin/curcumin có tính chất kháng khuẩn, ngăn ngừa phát sinh vi khuẩn giúp lành vết thương, để khảo sát khả kháng khuẩn sản phẩm trước tiên ta phải chuẩn bị mẫu trịn nhỏ có đường kính mm cơng thức có curcumin cơng thức có chitosan trắng để đối chứng Khả kháng khuẩn liên quan đến mức độ hấp phụ Chitosan lên bề mặt tế bào Chitosan tác động lên bề mặt tế bào, ảnh hưởng đến tính thấm màng tế bào, ngăn cản không cho tế bào vi khuẩn thu nhận chất dinh dưỡng Chitosan hấp phụ lên bề mặt vi khuẩn gram âm tốt vi khuẩn gram dương 2.2.7 Xác định cấu trúc vật liệu Khảo sát phổ FT-IR Tiến hành đo phổ FT-IR viện Công nghệ Hóa Học số Mạc Đĩnh Chi Quận 1, TP.HCM Phổ FT-IR đo máy đo quang phổ hồng ngoại YL – IR Jassco 410, hãng sản xuất YoungLin Hàn Quốc bước sóng 4000 – 500 cm-1 Khảo sát hình điện tử quét bề mặt (SEM) Mẫu tiến hành đo cấu trúc bề mặt máy điện tử JEOL JSM - 5500 (Nhật Bản) Mẫu đươc cắt thành miếng có diện tích mm2 đo 10 kV 2.2.8 Khảo sát tác dụng làm mau lành vết thương thỏ Thú thử nghiệm: Thỏ xám, mắt đen, trọng lượng 1.7 – kg, khỏe mạnh, giống cái, không mang thai Tạo vết thương Thỏ đem thử nghiệm cố định bốn chân cắt sát lông vùng lưng Sau cắt lông, thỏ sát trùng vùng da lưng chuẩn bị gây vết thương cồn 70 Thỏ gây tê vùng da lưng cách tiêm da 0.2 ml x dung dịch lidocain 25 % Sau hoàn tất gây tê, mảnh da thỏ có đường kính 2,5 x 2,5 cm cắt bỏ hoàn toàn cho khơng làm tổn thương lớp phía vùng da bị cắt bỏ vùng da xung quanh vết thương Điều trị vết thương Thỏ đem thử nghiệm chia làm lô, lô Trước điều trị, thỏ rửa vết thương dung dịch nước muối 0.9% Sau đó, màng xốp curcumin/chitosan/gelatin thử nghiệm dán lên vết thương rửa dung dịch nước muối 0.9% Kích thước màng xốp curcumin/chitosan/gelatin để điều trị cho lô thỏ thử nghiệm Theo dõi thỏ điều trị vòng 21 ngày cách sử dụng máy ảnh kỹ thuật số Lô (L1): Lô chứng, rửa sát trùng vết thương, không điều trị Lô (L2): Điều trị màng xốp chitosan/gelatin Lô (L3): Điều trị màng xốp curcumin/chitosan/gelatin Theo dõi đánh giá kết Theo dõi lên mơ hạt, tình trạng vết thương (viêm đỏ, có mủ nhiễm trùng,…) Sau khoảng thời gian cụ thể, đo kích thước cịn lại vết thương đánh giá kết So sánh tác dụng mau lành vết thương lô thử nghiệm với Sau 21 ngày thử nghiệm, vùng da thỏ thử nghiệm điều trị cắt ngâm dung dịch formalin 10% đem nhuộm mô Hematoxylin – Eosin (H & E) 2.2.9 Nhuộm mô Hematoxylin - Eosin (H&E) a Chuẩn bị tiêu Mô sau cố định dung dịch formalin 10 % vùi bệnh phẩm máy chuyển, khử nước tồn mô cồn với nồng độ cồn tăng dần Sau đó, cồn loại khỏi mô xylen Sau vùi, mẫu bệnh phẩm đúc bloc parafin có nhiệt độ nóng chảy từ 56 – 58 0C qua bước sau: 1) Cồn 80 - 2) Cồn 95 x lần x giờ/ lần 3) Cồn 100 x lần x giờ/ lần 4) Xylen x lần x giờ/ lần 5) Parafin x lần x giờ/ lần 6) Parafin hút chân không Sau đúc bloc parafin, mẫu bệnh phẩm cắt dán mảnh cắt lên lam kính dung dịch albumin – % b Nhuộm H&E Pha thuốc nhuộm nhân hematoxylin Bộ sản phẩm hematoxylin gồm lọ gril A gril B Hematoxylin pha nhanh cách cho gril A gril B vào bình thủy tinh tích lít Sau cho gril A gril B vào bình thủy tinh, thêm lít nước cất hai lần vào bình Để dung dịch bình tan hồn tồn, khuấy dung dịch vài phút để yên dung dịch Lọc dung dịch để loại bỏ cặn trước đem dung dịch nhuộm bệnh phẩm Pha thuốc nhuộm bào tương eosin Một lọ eosin pha lít nước cất lần khấy để eosin tan hoàn toàn nước cất Sau eosin tan hoàn toàn, dung dịch lọc bỏ cặn trước nhuộm Phương pháp nhuộm hematoxylin - eosin (Hematoxylin Instant) Tiêu chuẩn bị mục a tẩy xylen lần, lần tẩy khoảng thời gian phút; lặp lại tương tự bước Sau tẩy xylen, tiêu tiếp tục chuyển vào bể cồn có nồng độ giảm dần 100 o, 90o 80o thời gian phút tương ứng với bể Sau lấy từ bể cồn 80 o, tiêu rửa vòi nước chảy phút đem nhuộm nhân dung dịch hematoxylin từ -7 phút Tiếp tục rửa với nước mẫu tiêu nhuộm nhân phút biệt hóa mẫu vừa nhuộm dung dịch cồn acid (acid hydroclorid 0.5% cồn 70 o) vài giây, rửa lại với nước phút Để đánh giá mức độ đậm nhạt mẫu, soi mẫu vừa nhuộm kính hiển vi Nếu mẫu chưa đạt yêu cầu, tiếp tục nhuộm thêm tẩy mẫu nhuộm đạt yêu cầu Sau mẫu đạt yêu cầu, làm xanh mẫu nhuộm dung dịch lithi carbonat natri carbonat bão hòa, rửa mẫu với nước tiến hành nhuộm bào tương eosin Nhuộm bào tương eosin tiến hành đơn giản nhuộm nhân hematoxylin Mẫu tiêu sau nhuộm nhân hematoxylin đem nhuộm bào tương eosin khoảng thời gian từ - phút Để loại eosin thừa tiêu bản, tiêu rửa nước rửa cồn 95 vài giây Nước thừa loại lần cuối cồn tuyệt đối Sau loại cồn tuyệt đối, tiêu làm xylen để thuận tiện cho việc quan sát, dùng baume canada để gắn tiêu nhuộm H&E hoàn chỉnh vào lamelle Sau nhuộm H&E hồn tất, nhân có màu từ xanh đến xanh đen, bào tương có màu từ hồng đến đỏ hồng cầu có màu đỏ CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Tổng hợp xác định cấu trúc màng xốp composite Sản phẩm màng xốp tổng hợp thành cơng có màu vàng tự nhiên curcumin, độ dày điểm tương đối Đây yếu tố định cho màng có tính chất hấp thu tốt nước giải phóng cucurmin tốt Tính chất màng sản phẩm vừa phải có tính mềm dai vừa phải, khơng giòn hay mềm để sử dụng Composite xốp tổng hợp với tỷ lệ chitosan, gelatin curcumin khác Từ việc khảo sát thực nghiệm thấy tăng hàm lượng curcumin 10% dẫn đến kết tủa dung dịch chitosan/gelatin chọn tỷ lệ curcumin mẫu 10% tỷ lệ tối ưu Tỷ lệ công bố tác giả trước Đồng thời màng xốp tổng hợp với tỷ lệ gelatin chitosan 3:1, 1:1 1:3 Kết tăng hàm lượng gelatin mẫu dẫn đến làm cho màng composite trở lên giòn (cảm quan) Trong mẫu mẫu có hàm lượng gelatin cao giịn nhất, tiếp sau đến tỷ lệ 1:1 1:3 (hình 3.1) Đồng thời thí nghiệm tìm lạc khuẩn cho thấy khơng phát vi sinh vật gây bệnh mẫu (a (b Hình 3.1 Màng xốp curcumin/chitosan/gelatin (a) chitosan/gelatin (b) Cấu trúc màng composite xác định phương pháp phổ FT-IR bề mặt xác định phương pháp SEM Hình 3.2 cho thấy quang phổ FTIR màng chitosan-gelatin với tỷ lệ pha trộn chitosan/gelatin khác Mũi đặc ... ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU CURCUMIN/ CHITOSAN/GELATIN CHẾ TẠO COMPOSITE ỨNG DỤNG TRONG XỐP CỦA ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG CURCUMIN- LOADED CHITOSAN/GELATIN COMPOSITE. .. PVP Trong việt nam nghiên cứu màng composite xốp chitosan cịn khơng có, nghiên cứu lĩnh thúc dẩy nhóm nghiên cứu chúng tơi kết hợp chitosan gelatin để tạo composite xốp ứng dụng dẫn truyền curcumin. .. nghiên cứu khả đốt nhiệt thể khả ứng dụng hạt nano chitosan biến tính việc nhiệt trị điều trị ung thư Ứng dụng chế tạo dung dịch/gel kháng khuẩn [4] Chitosan/nano bạc (CS/Ag-NPs) nghiên cứu ứng