Khai thác giá trị probiotic của hạt kefir và ứng dụng

IH QU GI TH NH PH H H MINH TRƯỜNG IH BÁ H KHO QUÁ H Ứ T NH KH I THÁ GIÁ TRỊ PROBIOTI ỨNG DỤNG Ủ H T KEFIR V CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ NGÀNH : 60.42.80 LUẬN VĂN TH SĨ TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 07 NĂM 2013 c : dẫ k õ ọ ê ậ xé ọc õ ọ ê ậ xé c sĩ cb õ ọ ê ọc m ọc vị v c ữ ký) ọc m ọc vị v c ữ ký) v ọc ác a ăm ộ ( m ọc vị v c ữ ký) : (Gh õ ọ ê Luậ vă - H G-TP.HCM : ( c ấm K a ọc : ( c ấm B ọc á Luậ vă m ọc vị c a ộ c sĩ ồm: c ấm b v uậ vă c sĩ) k ý ác c u ê H ậ c a ịc sau k HH I ộ uậ vă G áL v c s a c ữa ( u c ) Ư G KHO a u Ạ Ọ UỐ ƯỜ G A IH G HÒ X H I H BÁ H KHO HI ọ ê ọc v ê : : Ề Ậ VĂ H s I KH I ập- ự -H H Ĩ s ọc HÁ ú MSHV: 11310630 / / 986 : I VỤ Á H Ứ ăm s u ê ộ GHĨ VI : â số: GIÁ OBIO I H KEFI V Ứ G Ụ G HI VỤ V I G Phân lập ch ng vi khuẩn lactic có hai mẫu h t Kefir Sàng lọc ch ng phân lậ c qua ho t tính probiotic ịnh ch ng có ho t tính probiotic cao từ giống Khai thác ứng dụng: Tố u số ều ki n nuôi cấ v d d ỡng thu nhận lactase Tố u số ều ki n nuôi cấ v d d ỡng thu nhận bacteriocin Th nghi m t o s n phẩm Bio Kefir chanh dây II G GI O HI III G IV Á B Á B HO HƯ HƯ H H HI G G VỤ 21/06/2013 G Ễ HÚ HƯ G ( ọ v ê c ữ kí) Ư VỤ 20/08/2012 H G HI B Ô ( ọ v ê c ữ kí) G KHO ( ọ v ê c ữ kí):……………………… ăm O O LỜI C M N c th ho n th nh lu n v n th c s xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: - Cô Nguyễn Th y H ơng, ng ời g i h ng đ t i đ t n tình h ng dẫn em thời gian thực lu n v n n y, c lu n bên c nh động viên lúc khó kh n v đ ng g p nhi u ý kiến quí báu Cô l ng ời thầy, ng ời thân gia đình cịn l ng ời b n suốt trình em học t p tr ờng c thầy c m n c ng nghệ sinh học đ truy n đ t kiến th c chuyên ng nh, - tiếp thêm h nh trang đ t i tiến h nh nghiên c u khoa học - Cô Li Tao, chị Thanh, em Tuấn đ t o u kiện thu n l i đ t i sử d ng sở v t chất, m y m c thiết bị c c phòng th nghiệm c a m n - Các b n học viên cao học K2011 anh, chị, b n cao học khóa đ đồng hành tơi suốt thời gian qua - Chị Hi n ( H N ng Lâm), b n Phúc em: Trung, Duy, Yến Ph ơng, Do n, Nh , Ng Ph ơng, Tr c Ph ơng, Tiên, Anh Khoa, ng Khoa đ gi p đở nhi u trình thực đ tài m v em trai lu n l ch dựa tinh thần vững ch c, gi p t i c thêm nghị lực v - t qua c c kh kh n Các thầy cô hội đồng phản biện, đ d nh thời gian đọc nh n xét lu n v n T iđ đ c thực lu n v n yêu th ơng qu mến v h tr nhiệt tình c a tất ng ời T i xin cảm ơn v gửi lời ch c s c kh e đến tất Tp H M, ng y 14 th ng n m 2013 Qu ch c Tính i TĨM TẮT Tên đề tài: “KHAI THÁ GIÁ TRỊ PROBIOTIC CỦA HẠT KEFIR VÀ ỨNG DỤNG” Nội dung đề tài: Phân l p ch ng vi khuẩn lactic có hai mẫu h t Kefir Sàng lọc ch ng phân l p đ c qua ho t tính probiotic ịnh ch ng có ho t tính probiotic cao từ giống Khai thác ng d ng:  Tối u số u kiện nuôi cấy v dinh d ỡng thu nh n lactase  Tối u số u kiện nuôi cấy v dinh d ỡng thu nh n bacteriocin  Thử nghiệm t o sản phẩm Bio Kefir chanh dây Kết đề tài:  Phân lập: Phân l p đ c 78 ch ng từ hai mẫu h t kefir  Sàng lọc: Sàng lọc đ c ch ng có ho t tính probiotic tổng cao Ngồi ho t t nh probiotic đ ki m tra, ch ng T23 ch ng sinh lactase cao nhất, ch ng T17 sinh bacteriocin cao bám dính tốt ch ng T9  Định danh: ịnh danh kit API 50 CHL: Ch ng T23: Lactobacillus delbrueckii ssp delbrueckii v i độ t ơng đồng 99.9% Ch ng T17: Lactobacillus acidophilus v i độ t ơng đồng 99.9% Ch ng T9: Lactobacillus fermentum v i độ t ơng đồng 99.8% ii  Khai thác ứng dụng:  Tối ưu số điều kiện nuôi cấy dinh dưỡng thu nhận lactase từ Lactobacillus delbrueckii ssp delbrueckii:  Một số khảo s t th m dò enzyme lactase từ ch ng Lactobacillus delbrueckii ssp delbrueckii cho kết nh sau: Vị tr enzyme lactase tế b o: periplasmic, cytoplasmic v m ng tế b o Ph ơng ph p thu enzyme tối u: ph vỡ tế b o s ng siêu âm Nhiệt độ phản ng tối u: 60oC  Quy trình nu i cấy đ thu nh n enzyme từ ch ng L delbrueckii ssp delbrueckii: T ng sinh cấp v cấp m i tr ờng MRS v i c c u kiện sau: pH 5.5, nhiệt độ 320 , tỷ lệ cấy giống 20% đ thu sinh khối tối đa Lên men m i tr ờng MRS v i c c u kiện sau: pH 6.23, nhiệt độ 34.60 , tỉ lệ cấy giống 16%, nồng độ glucose 29.2 g/L, peptone g/L, cao nấm men 2.2 g/L đ thu enzyme tối đa  Khảo s t độ b n nhiệt b n pH c a enzyme lactase thu nh n từ ch ng L delbrueckii ssp delbrueckii cho thấy enzyme lactase từ ch ng có khả n ng p d ng vào trình th y phân lactose có sữa whey  Tối ưu số điều kiện nuôi cấy dinh dưỡng thu nhận bacteriocin từ Lactobacillus acidophillus :  i u kiện ni cấy tế bào thích h p thu bacteriocin: 300C, pH 6, tỷ lệ cấy giống 10% Thời gian nuôi cấy tế bào thu bacteriocin: 30  i u kiện dinh d ỡng thu nh n bacteriocin: M i tr ờng MRS bổ sung cao nấm men 4% cho kết sinh tổng h p bacteriocin tối u, c c nhân tố vi l ng nh Vitamin B1, B6, C, MgSO4.7H2O, MnSO4.H2.O NaCl (0.5-3%) có mặt m i tr ờng gi p l m t ng sinh tổng h p bacteriocin Triamonium citrate (2-20 g/L), glycerol (0.5-20%) có ảnh h ởng giảm sinh tổng h p bacteriocin iii Bacteriocin b n nhiệt từ 25-600C, b n pH Ho t tính bacteriocin chịu ảnh h ởng c a NaCl Tween  Thử nghiệm tạo sản phẩm Bio Kefir chanh dây:  Tỷ lệ cấy giống ch ng Lactobacillus casei VTCC 186 3% (v/v), độ chua kết th c qu trình lên men ch nh l 95ºTh, nhiệt độ lên men ch nh l 30º , tỷ lệ phối chế syrup nồng độ 40% (w/v) tối u l 30% (v/v)  Thời gian bảo quản c a sản phẩm: sau 15 ng y, sản phẩm đ t chất l v cảm quan v chất l ng ng probiotic, m t độ ch ng Lactobacillus casei đ t 108 cfu/mL  Ho t t nh probiotic c a sản phẩm: M t độ vi khuẩn lactic v nấm men đ u t ng t ơng ng 1.99 2.01 lg(cfu/mL) so v i sản phẩm kefir chanh dây truy n thống, hệ vi khuẩn lactic hai sản phẩm đ u c khả n ng sống u kiện dịch d d y nhân t o pH2 sau 120 ph t v i tỷ lệ sống s t lần l t l 39 36% v 52 01%, c khả n ng chịu muối m t, c ho t t nh kh ng Salmonella sp nh Bacillus sp v l m giảm cholesterol Một phần kết đưa vào báo: Trần Thị T ởng An, T ng Thị Yến Ph ơng, Qu ch c Tính, Nguyễn Thúy H ơng, 2011, Khảo sát q trình lên men sữa đ u nành sử d ng hệ vi sinh v t h t kefir, Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc- khu vực phía nam lần II2011 Quach Duc Tinh, Tong Thanh Trung, Nguyen Ngoc Duy, Nguyen Thuy Huong, 2012, Fermentation passionfruit kefir with Lactobacillus casei: enrichment probiotic activity of traditional kefir, The AFOB-Regional symposium 2012, Ferbruary, 2012, Ho Chi Minh city-Viet Nam Qu ch c Tính, Tống Thành Trung, Nguyễn Ngọc Duy, Nguyễn Th y H ơng, 2012, Khảo sát số yếu tố ảnh h ởng đến trình lên men kefir chanh dây bổ sung Lactobacillus casei VTCC186, Hội nghị khoa học trẻ ĐHQG-HCM lần iv Qu ch c Tính, Tống Thành Trung, Nguyễn Ngọc Duy, Nguyễn Th y H ơng, 2012, Khảo sát số ho t tính probiotic c a kefir chanh dây truy n thống kefir chanh dây bổ sung Lactobacillus casei VTCC186, Hội nghị khoa học trẻ ĐHQG-HCM lần Qu ch c T nh, Vũ Thị Trúc Ph ơng, Lê Hoa Nh , Nguyễn Th y H ơng, 2013, Tối u số u kiện nuôi cấy ch ng Lactobacillus delbrueckii ssp delbrueckii thu nh n lactase theo ph ơng ph p qui ho ch thực nghiệm, Hội nghị khoa học cơng nghệ sinh học tồn quốc –Hà Nội 2013 Vũ Thị Trúc Ph ơng, Lê Hoa Nh , Qu ch c Tính, Nguyễn Th y H ơng, 2013, Tuy n chọn ch ng vi khuẩn có ho t tính lactase cao giống phân l p từ h t kefir khảo sát số yếu tố thu nh n lactase từ ch ng giống, Hội nghị khoa học cơng nghệ sinh học tồn quốc –Hà Nội 2013 Nguyễn Thị Th y Tiên, Qu ch c Tính, Nguyễn Th y H ơng, 2013, Tuy n chọn v đ nh gi khả nẳng bám dính c a ch ng vi khuẩn lactic đ c phân l p từ h t kefir, Hội nghị khoa học cơng nghệ sinh học tồn quốc –Hà Nội 2013 Nguyễn ng Khoa, Nguyễn Võ Anh Khoa, Qu ch c Tính, Nguyễn Thúy H ơng, 2013, Khảo sát số nguồn carbon v nitơ hữu m i tr ờng MRS đ nâng cao khả n ng sinh tổng h p bacteriocin c a L acidophilus, Hội nghị khoa học cơng nghệ sinh học tồn quốc –Hà Nội 2013 Quách c Tính, Nguyễn ng Khoa, Nguyễn Võ Anh Khoa, Nguyễn Thúy H ơng, 2013, Khảo sát số đặc tính c a bacteriocin đ c sinh tổng h p L acidophilus, Hội nghị khoa học công nghệ sinh học toàn quốc –Hà Nội 2013 v MỤC LỤC TÓM TẮT ii MỞ ĐẦU CHƯ NG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Probiotic 1.1.1 Khái niệm probiotic 1.1.2 Các sản phẩm sữa probiotic 16 1.2 Lactase 32 1.2.1 Bệnh không dung n p lactose 32 1.2.2 Enzyme lactase 34 1.2.3 1.3 c ph ơng ph p thu nh n enzyme lactase 42 Bacteriocin 47 1.3.1 Lịch sử nghiên c u bacteriocin 47 1.3.2 Bản chất protein c a bacteriocin 48 1.3.3 Phân lo i bacteriocin 49 1.3.4 Sinh tổng h p bacteriocin 51 1.3.5 chế u hịa q trình tổng h p 55 1.3.6 chế ho t động c a bacteriocin 56 1.3.7 Sự miễn nhiễm bacteriocin c a hệ vi sinh v t sinh bacteriocin 57 1.3.8 Các yếu tố ảnh h ởng đến sinh tổng h p bacteriocin 59 1.4 Tình hình nghiên cứu nước 64 1.4.1 Các sản phẩm kefir- probiotic 64 1.4.2 Enzyme lactase 70 1.4.3 Bacteriocin 72 CHƯ NG VẬT LIỆU VÀ PHƯ NG PHÁP 78 2.1 Giống vi sinh vật – Hóa chất – Mơi trường 78 2.2.1 Giống vi sinh v t 78 vi 2.2.2 Hóa chất 78 2 M i tr ờng 78 2.2.4 Thiết bị d ng c sử d ng 79 2.2.5 Nguyên liệu lên men 79 2.2 Phân lập hệ LAB hạt kefir 80 2.2.1 Phân l p 80 2.2.2 Quan s t đặc m đ i th vi th 81 2.3 Định danh sơ 82 2.3.1 Khảo s t đặc m sinh lý c a ch ng phân l p 82 2.3.2 Các thử nghiệm sinh hóa nhằm định danh vi sinh v t phân l p đ 2.4 c 82 Sàng lọc số tiêu chí probiotic hệ LAB 84 2.4.1 Khả n ng chịu dịch d dày muối m t nhân t o 84 2.4.2 Khảo sát ho t tính kháng khuẩn 85 2.4.4 Khả n ng sinh tr ởng phát tri n m nh 86 2.4.5 Khả n ng chịu cholesterol 86 2.4.6 Ho t tính lactase 87 2.4.7 Khả n ng b m d nh 87 2.5 Định danh chủng đạt tiêu chí probiotic cao 91 2.6 Khai thác ứng dụng thu nhận lactase từ chủng giống tuyển chọn 92 2.6.1 Tối u u kiện thu sinh khối 92 2.6.2 Một số khảo s t th m dò enzyme lactase từ ch ng chọn lọc 93 2.6.3 Tối u u kiện nuôi cấy đến khả n ng sinh tổng h p lactase ph ơng pháp qui ho ch cổ n 94 2.6.4 Tối u u kiện nuôi cấy đến khả n ng sinh tổng h p lactase ph ơng pháp qui ho ch thực nghiệm 95 2.6.5 Tối u u kiện dinh d ỡng đến khả n ng sinh tổng h p lactase ph ơng pháp qui ho ch cổ n 97 2.6.6 Tối u u kiện dinh d ỡng đến khả n ng sinh tổng h p lactase ph ơng pháp qui ho ch thực nghiệm 98 vii 36 nh hưởng Triamoniumcitrate đến sinh tổng hợp bacteriocin (Salmonella sp.) Nồng độ Lần 2% 5% 10% 15% 20% M c pha loãng thấp AU/ml 2 Trung bình 2 1 2 100,00 50,00 50,00 25,00 25,00 400,00 100,00 50,00 50,00 50,00 250 75 50 37,5 37,5 37 nh hưởng Mn2+ Mg2+ đến sinh tổng hợp bacteriocin (Bacillus sp.) H ml (g/l) MnSO4.H2O MgSO4.7H2O Nhân tố 38 ng M c pha loãng thấp AU/ml 200,00 400,00 400,00 12,50 Trung bình 300 206,25 nh hưởng Mn2+ Mg2+ đến sinh tổng hợp bacteriocin (Salmonella sp.) H ml (g/l) MnSO4.H2O MgSO4.7H2O Nhân tố ng M c pha loãng thấp AU/ml 200,00 400,00 25,00 25,00 300 25 Trung bình 39 nh hưởng số vitamin đến sinh tổng hợp bacteriocin (Bacillus sp.) Nhân tố B1 B6 B1+B6+B12 C H ml (g/l) 0,002 0,002 0,002 0,002 ng M c pha loãng thấp AU/ml 6 1066,67 533,33 133,33 7 2133,33 1066,67 266,67 66,67 2133,33 Trung bình 1066,67 400 100 2133,33 40 Ảnh h ởng số vitamin đến sinh tổng h p bacteriocin (Salmonella sp.) Nhân tố B1 B6 H ml (g/l) 0,002 0,002 ng M c pha loãng thấp AU/ml 6 1066,67 5 533,33 1066,67 533,33 Trung bình 1066,67 533,333 296 B1+B6+B12 C 0,002 0,002 133,33 533,33 133,33 1066,67 133,333 800 41 Ảnh h ởng độ mặn m i tr ờng đến sinh tổng h p bacteriocin (Bacillus sp.) Nồng độ Lần 0.5% 1% 2% 3% M c pha loãng thấp AU/ml 2 6 7 7 1066,67 1066,67 1066,67 2133,33 533,333 2133,33 2133,33 2133,33 Trung bình 800 1600 1600 2133,33 42 Ảnh h ởng độ mặn m i tr ờng đến sinh tổng h p bacteriocin (Salmonella sp.) Nồng độ Lần 0.5% 1% 2% 3% M c pha loãng thấp AU/ml 2 6 6 533,333 1066,67 1066,67 1066,67 533,333 1066,67 1066,67 2133,33 Trung bình 533,333 1066,67 1066,67 1600 43 Ảnh h ởng glycerol tr ờng đến sinh tổng h p bacteriocin (Bacillus sp.) Nồng độ Lần 0.5% 1% 2% 3% M c pha loãng thấp AU/ml 2 3 3 266,667 133,333 66,6667 33,3333 133,333 133,333 133,333 33,3333 Trung bình 200 133,333 100 33,3333 297 44 Ảnh h ởng glycerol tr ờng đến sinh tổng h p bacteriocin (Salmonella sp.) Nồng độ Lần 0.5% 1% 2% 3% M c pha loãng thấp AU/ml 2 1 2 133,333 66,6667 33,3333 33,3333 66,6667 66,6667 66,6667 16,6667 Trung bình 100 66,6667 50 25 298 PHỤ LỤC Đại thể vi thể 28 chủng LAB Đại thể Vi thể T9 T11 T14 T15 299 T16 T17 T18 T19 300 T20 T21 T22 T23 301 T28 T29 T30 T31 302 T33 T34 T40 T42 303 T43 T44 T45 T46 304 T48 T49 T50 T51 305 T53 Khả phân giải CaCO3 chủng LAB 306 307 308 PHỤ LỤC Bảng kết thống kê theo phương pháp One way ANOVA (ANOVA chiều) phần mềm SPPS phiên 19 Khảo sát tỷ lệ cấy giống đến khả n ng sinh tổng h p lactase Descriptives Tỷ lệ cấy giống (%) 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std Deviation Std Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum 5,00 39777,5000 1024,59773 724,50000 30571,8547 48983,1453 39053,00 40502,00 10,00 50155,0000 2374,46457 1679,00000 28821,2822 71488,7178 48476,00 51834,00 15,00 43829,5000 1554,92781 1099,50000 29859,0279 57799,9721 42730,00 44929,00 20,00 40615,5000 167,58431 118,50000 39109,8147 42121,1853 40497,00 40734,00 Total 43594,3750 4507,33367 1593,58310 39826,1497 47362,6003 39053,00 51834,00 Test of Homogeneity of Variances Tỷ lệ cấy giống (%) Levene Statistic df1 df2 Sig ANOVA Tỷ lệ cấy giống (%) Sum of Squares Between Groups Within Groups Total df Mean Square 1,331E8 44359543,458 9133767,500 2283441,875 1,422E8 F 19,427 Sig ,008 Tỷ lệ cấy giống (%) Duncan a Subset for alpha = 0.05 VAR00001 N 5,00 39777,5000 20,00 40615,5000 15,00 43829,5000 10,00 Sig 50155,0000 ,058 1,000 309 H H ọv ê : U ịa c H G G Ứ ăm s : 21/10/1986 ê c: 877 uốc ộ s ẩm Email: tayxuyen@yahoo.com Á - H O - ẩm a òD u â Tel: 0984515235 O 09/2005 - 04/2010: S ố : Tây Ninh í vê ọc u ê ác : a– s ọc uốc a ọc 6/2010-12/2010: Nhân viên công ty P&G Indochina 9/ gia t a : Học v ê ca ố í ọc u ê ọc ác : s a– ọc ọc uốc ... Tên đề tài: ? ?KHAI THÁ GIÁ TRỊ PROBIOTIC CỦA HẠT KEFIR VÀ ỨNG DỤNG” Nội dung đề tài: Phân l p ch ng vi khuẩn lactic có hai mẫu h t Kefir Sàng lọc ch ng phân l p đ c qua ho t tính probiotic ịnh... t t nh probiotic nh : hịu dịch d dày, muối m t, hấp thu cholesterol, kháng khuẩn, b m d nh, lactase,… Do đ , ch ng t i tiến h nh đ t i: ? ?KHAI THÁ GIÁ TRỊ PROBIOTIC CỦA HẠT KEFIR VÀ ỨNG DỤNG” Lu... HÌNH Hình 1.1 Hạt kefir 23 Hình 1.2 Đặc điểm hình thái số hạt kefir 24 Hình 1.3 Quan sát bên ngồi hạt kefir kính hiển vi 26 Hình 1.4 Hình quan sát bên hạt kefir kính