tính đa dạng di truyền ở thực vật

MỤC LỤC Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU ……………………………… 1.1 Cây ngô ………………………………………………………… 1.1.1 Đặc điểm ngơ………………………………………………… 1.1.2 Vai trị ngơ đời sống ………………………………… 1.1.3 Đặc điểm hóa sinh hạt ngơ……………………………………… 15 1.1.4 Tình hình sản xuất ngơ giới Việt Nam …………… 15 1.1.4.1 Tình hình sản xuất ngơ giới ………………………… 15 1.1.4.2 Tình hình sản xuất ngơ VIệt Nam ………………………… 19 1.2 Tình hình ngiên cứu tính đa dạng di truyền thực vật .21 1.2.1 Một số phương pháp sinh học phân tử sử dụng nghiên cứu quan hệ di truyền thực vật …………………………………………………… 21 1.2.1.1 Kỹ thuật RFLP (restriction fragment length polymorphisms – đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn)……………………………………… 21 1.2.1.2 Kỹ thuật AFLP (amplified fragment length polymorphism – đa hình độ dài đoạn nhân chọn lọc)………………… 23 1.2.1.3 Kỹ thuật RAPD………………………………………………… 25 1.2.1.4.Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat – trình tự lặp lại đơn giản……………… ……………………………………………………… .29 1.2.1.5 Bản đồ QTL (Quantiative Trait loci) ….………………………… 29 1.2.1.6 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ……… 30 1.2.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật kỹ thuật RAPD …………………………………………………………………… .32 1.2.3 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền ngô kỹ thuật RAPD …………………………………………………………………… 34 1.3 Nhận xét chung………………………………………………….…… 36 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 38 2.1 Vật liệu nghiên cứu………………………………………………… .38 2.1.1 Vật liệu thực vật …………………………………………………… .38 2.1.2 Hóa chất …………………………………………………………… 39 2.1.3 Thiết bị………………………………………………………………39 2.2 Phương pháp nghiên cứu ……………………………………… .39 2.2.1 Phương pháp hóa sinh ………………………………………… 39 2.2.1.1 Xác định hàm lượng lipid………………………………………….39 2.2.1.2 Xác định hàm lượng protein……………………………………….40 2.2.1.3 Xác định hàm lượng đường tan ………………………………… 40 2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử …………………………………… 41 2.2.2.1 Phương pháp tách DNA từ non ngô……………………… 41 2.2.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng độ tinh DNA tổng số …………………………………………………………………… 41 2.2.2.3 Phản ứng RAPD ………………………………………………… 42 2.2.2.4 Phương pháp xử lý kết tính tốn số liệu ………………… 45 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……………………………….46 3.1 Đặc điểm hình thái hóa sinh giống ngơ nghiên cứu ……………46 3.1.1 Đặc điểm hình thái 14 giống ngơ nghiên cứu ………………… 46 3.1.2 Hàm lượng protein, lipid, đường 14 giống ngơ nghiên cứu ……47 3.2 Phân tích đa hình DNA kỹ thuật RAPD …………………… 50 3.2.1 Kết tách chiết DNA tổng số từ ngô ………………………….50 3.2.2 Kết nghiên cứu đa hình DNA kỹ thuật RAPD ……… .52 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……………………………………………….61 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY NGÔ Ngô, bắp hay bẹ (danh pháp khoa học: Zea mays L ssp mays) loại lương thực canh khu vực Trung Mỹ sau lan tỏa khắp châu Mỹ Ngô lan tỏa phần cịn lại giới sau có tiếp xúc người châu Âu với châu Mỹ vào cuối kỷ 15, đầu kỷ 16 Ngô lương thực gieo trồng nhiều châu Mỹ (Chỉ riêng Hoa Kỳ sản lượng khoảng 270 triệu năm) Các giống ngô lai ghép nông dân ưa chuộng so với giống, thứ ngơ thơng thường có suất cao có ưu giống lai Trong vài giống, thứ ngơ cao tới m (23 ft) số nơi, giống ngơ thương phẩm tạo với chiều cao khoảng 2,5 m (8 ft) Ngô (Zea mays var rugosa hay Zea mays var saccharata) thông thường thấp so với thứ, giống ngô khác Nguồn gốc phân loại Ngô Cây Ngô (Zea mays L.) thuộc chi Maydeae, họ Hịa thảo Gramineae, có nguồn gốc từ từ Trung Mỹ Ngơ có nhiễm sắc thể (2n=20) Có nhiều cách để phân loại Ngơ, số cách dựa vào đặc điểm nội nhũ hạt hình thái bên ngồi hạt Ngơ phân loại thành lồi phụ: Ngơ đá rắn, Ngô ngựa, Ngô nếp, Ngô đường, Ngô nổ, Ngơ bột , Ngơ nửa ngựa Từ lồi phụ dựa vào màu hạt màu lõi, Ngô phân thành thứ Ngồi Ngơ cịn phân loại theo sinh thái học, nông học, thời gian sinh trưởng thương phẩm Hiện nay, xung quanh vấn đề nguồn gốc Ngơ có nhiều giả thuyết: Ngô sản phẩm dưỡng trực tiếp từ cỏ ngô (Zea mays ssp parviglumis) năm Trung Mỹ, có nguồn gốc từ khu vực thung lũng sơng Balsas miền nam Mexico, với tối đa khoảng 12% vật chất gen thu từ Zea mays ssp mexicana thông qua xâm nhập gen Hai loại cỏ ngô coi nguồn gốc ngô Ngô sinh từ q trình lai ghép ngơ hóa nhỏ (dạng thay đổi khơng đáng kể ngơ dại) với cỏ ngơ thuộc đoạn Luxuriantes, Z luxurians Z diploperennis Ngô trải qua hay nhiều lần dưỡng ngô dại hay cỏ ngơ Ngơ tiến hóa từ q trình lai ghép Z diploperennis với Tripsacum dactyloides (Thuật ngữ cỏ ngơ tất lồi phân loài chi Zea, ngoại trừ Zea mays ssp mays.) Vào cuối thập niên 1930, Paul Mangelsdorf cho ngô dưỡng kết lai ghép ngô dại mà người khơng biết rõ với lồi chi Tripsacum, chi có họ hàng gần Tuy nhiên, vai trò đề xuất Tripsacum (cỏ gama) nguồn gốc ngơ bị phân tích gen đại bác bỏ, qua đỏ phủ nhận mơ hình Mangelsdorf thuyết thứ tư 1.1.1 Đặc điểm Ngô Cơ quan sinh dưỡng Ngô bao gồm rễ, thân, làm nhiệm vụ trì đời sống cá thể Hạt coi quan khởi đầu Sau gieo hạt, ngô phát triển thành mầm Cây mầm chủ yếu sử dụng nguồn dinh dưỡng chứa nội nhũ hạt Bộ phận phía hạt phát triển lên mặt đất gồm có trụ mầm Phần đỉnh trụ mầm có mấu bao mầm, từ phát sinh bao mầm bên bao mầm thân mầm Trên trục mầm, đầu hình thành rễ mầm, sau phát triển thành rễ chính, từ rễ hình thành rễ phụ Ngơ loại có rễ chùm tiêu biểu cho rễ hịa thảo Hệ rễ có ba loại là: rễ mầm, rễ đốt rễ chân kiềng Rễ đốt giúp cho hút nước chất dinh dưỡng Rễ chân kiềng mọc xung quanh đốt phần thân sát gốc mặt đất, rễ giúp chống đổ, đồng thời tham gia vào hút nước chất dinh dưỡng cho Số lượng rễ, số lông rễ chiều dài rễ khác giống Thân ngô thường phát triển mạnh, thẳng cứng dạng bền Thân chia thành nhiều gióng, gióng nằm đốt, gióng dài to dần từ lên, chiều dài gióng khoảng 20-30 cm (8-12 inch) tùy thuộc vào giống ngô Lá ngô mọc từ mắt đốt mọc đối xứng xen kẽ Độ lớn số ngô dao động từ đến 22 tùy thuộc vào giống ngô điều kiện tự nhiên Lá ngô trưởng thành bao gồm phận: bẹ lá, phiến lá, thìa Ngơ có hình thái phát triển khác biệt; hình mũi mác rộng bản, dài 50–100 cm rộng 5-10 cm (2–4 ft 2-4 inch); thân thẳng, thông thường cao 2–3 m (7– 10 ft), với nhiều mấu, với tỏa từ mấu với bẹ nhẵn Dưới ôm sát thân bắp Khi non chúng dài khoảng cm ngày Từ đốt phía sinh số rễ Các ngô non đồng Bắp ngô phát sinh từ mầm nách thân, số mầm nách thân nhiều có 1-3 mầm nách phát triển thành thành bắp Tùy thuộc vào giống, điều kiện sinh thái chăm bón, mật độ , mùa vụ … mà tỷ lệ có 2-3 bắp, số hạt bắp, vị trí đóng bắp, thời gian phun râu, trổ cờ… khác Các bắp ngơ (bẹ ngơ) cụm hoa hình bơng, bao bọc số lớp lá, bao chặt vào thân đến mức chúng không lộ xuất râu ngơ màu vàng từ vịng vào cuối bắp ngô Râu ngô núm nhụy thuôn dài trơng giống búi tóc, ban đầu màu xanh lục sau chuyển dần sang màu đỏ hay vàng Ngô loại thực vật cần thời gian ban đêm dài hoa lượng định ngày nhiệt độ tăng trưởng > 10 °C (50 °F) mơi trường mà thích nghi Biên độ ảnh hưởng mà thời gian ban đêm dài có số ngày cần phải có để ngơ hoa quy định theo di truyền điều chỉnh hệ thống sắc tố thực vật Tính chu kỳ theo ánh sáng bị sai lệch giống trồng cho khu vực nhiệt đới, nơi mà thời gian ban ngày kéo dài cao độ lớn làm cho phát triển cao chúng không đủ thời gian để hoa, tạo hạt trước bị chết sương giá Tuy nhiên, đặc tính hữu ích sử dụng ngô làm nguồn cung cấp nhiên liệu sinh học Trên đỉnh thân cụm hoa sóc hình chùy chứa hoa đực, gọi cờ ngô Mỗi râu ngơ thụ phấn để tạo hạt ngô bắp Các bắp ngô non dùng làm rau ăn với tồn lõi râu, bắp già (thường vài tháng sau trổ hoa) lõi ngơ trở nên cứng râu khơ nên khơng ăn Các hạt ngơ dạng thóc với vỏ hợp với lớp áo hạt, kiểu thơng thường họ Hịa thảo (Poaceae) Nó gần giống loại phức cấu trúc, ngoại trừ điều riêng biệt (hạt ngô) không hợp thành khối Các hạt ngơ có kích thước cỡ hạt đậu Hà Lan, bám chặt thành hàng tương đối xung quanh lõi trắng để tạo bắp ngô Mỗi bắp ngô dài khoảng 10 – 25 cm (4 - 10 inch), chứa khoảng 200 400 hạt Các hạt có màu ánh đen, xám xanh, đỏ, trắng vàng Khi nghiền thành bột, ngô tạo nhiều bột cám so với lúa mì Tuy nhiên, khơng có gluten lúa mì làm cho thức ăn dạng nướng có độ trương nở nhỏ Thân ngơ non tích lũy chất kháng sinh mạnh DIMBOA (2,4dihydroxy-7-methoxy-1,4-benzoxazin-3-on) DIMBOA thành viên nhóm axít hydroxamic (cịn gọi benzoxazinoit) có khả phịng chống tự nhiên loạt loài gây hại côn trùng, nấm vi khuẩn gây bệnh DIMBOA tìm thấy số lồi “cỏ” có họ hàng gần, cụ thể lúa mì Giống ngơ đột biến (bx) thiếu DIMBOA dễ bị loài rệp nấm gây bệnh DIMBOA chất có tác dụng đề kháng tương đối ngô non sâu ngô bore châu Âu (họ Crambidae) Khi ngô trở nên già hàm lượng DIMBOA khả đề kháng trước sâu bore giảm Mỗi giai đoạn sinh trưởng, ngô yêu cầu điều kiện sinh thái khác Trong điều kiện đảm bảo độ ẩm, oxy nhiệt độ thích hợp cho ngô nảy mầm nhanh sau gieo Nhiệt độ tối thiểu cho nảy mầm 8-12 0C, nhiệt độ tối đa cho nảy mầm 40-450C, nhiệt độ tối thích từ 25-280C Ở thời kỳ sinh trưởng khác hút chất dinh dưỡng yêu cầu dinh dưỡng ngô khác nhau: Ở thời kỳ đầu ngô hút chất dinh dưỡng chậm, thời kỳ 7-8 đến sau 15 ngày, toàn phận mặt đất phận mặt đất ngô tăng trưởng nhanh, quan sinh dưỡng phát triển mạnh, lượng tinh bột chất khô tăng nhanh Đây giai đoạn ngô hấp thu chất dinh dưỡng tối đa (bằng 70-90% dinh dưỡng vòng đời hút) Ở thời kỳ thiếu nước chất dinh dưỡng làm giảm suất từ 10-20% Trong yếu tố dinh dưỡng đạm yếu tố quan trọng ngơ 1.1.2 Vai trị ngơ đời sống Ngô làm lương thực cho người: Ngô lương thực ni sống 1/3 dân số tồn giới, tất nước trồng ngơ nói chung ăn ngơ mức độ khác Tồn giới sử dụng 21% sản lượng ngô làm lương thực cho người Các nước Trung Mỹ, Nam Á, Châu Phi sử dụng ngơ làm lương thực Các nước Đông Nam Phi sử dụng 85% sản lượng ngô làm lương thực cho người, Tây Trung Phi 80%, Bắc Phi 42%, Tây Á 27%, Nam Á 75%, Đông Nam Á Thái Bình Dương 39%, Đơng Á 30%, Trung Mỹ vùng Caribe 61% …Nếu Châu Âu phần ăn bánh mỳ, khoai tây sữa; Châu Á cơm (gạo), cá, thịt, rau xanh châu Mỹ Latinh bánh ngơ, đậu, ớt Vì vậy, phạm vi giới ngô lương thực quan trọng, ngơ phong phú dinh dưỡng lúa mỳ gạo Tại Hoa Kỳ Canada, sử dụng chủ yếu ngô nuôi gia cầm gia súc, cỏ khô, cỏ ủ chua hay lấy hạt làm lương thực Cỏ ủ chua sản xuất cách lên men đoạn thân ngơ non Hạt ngơ có nhiều ứng dụng cơng nghiệp, chuyển hóa thành chất dẻo hay vải sợi Một lượng ngô định thủy phân hay xử lý enzym để sản xuất xi rô, cụ thể xi rô chứa nhiều fructoza, gọi xi rô ngô, tác nhân làm lên men để sau chưng cất sản xuất vài dạng rượu Rượu sản xuất từ ngô theo truỳen thống nguồn wisky bourbon Etanol từ ngô dùng hàm lượng thấp (10% hơn) phụ gia xăng làm nhiên liệu cho số động để gia tăng số octan, giảm ô nhiễm giảm mức tiêu thụ xăng (ngày gọi chung "các nhiên liệu sinh học" gây tranh cãi mạnh liên quan tới cần thiết nguồn nhiên liệu người với cần thiết phải trì, khu vực châu Mỹ Latinh, thói quen ăn uống chất văn minh văn minh xuất phát từ khu cực Trung Mỹ; Sự chấp nhận thỏa thuận thương mại ngô NAFTA làm trầm trọng thêm tranh cãi này, liên quan tới điều kiện lao động tồi tệ người công nhân cánh đồng, chủ yếu NAFTA "mở cửa cho việc nhập ngô từ Hoa Kỳ, nơi mà nông dân trồng ngô nhận trợ cấp nhiều tỷ đôla hỗ trợ khác từ quyền ( ) Theo OXFAM UK, sau NAFTA có hiệu lực, giá ngơ Mexico giảm 70% giai đoạn từ năm 1994 tới năm 2001 Số lượng việc làm giảm theo: từ 8,1 triệu vào năm 1993 xuống 6,8 triệu vào năm 2002 Phần nhiều số người việc làm người trồng ngô quy mô nhỏ [11] Tuy nhiên, việc đưa vào khu vực vĩ độ xa phía bắc Hoa Kỳ loại ngô sản xuất nhiên liệu sinh học không nhằm mục tiêu tiêu thụ người hay động vật, làm giảm xu hướng Sự tiêu thụ ngô từ phía người loại lương thực diễn nhiều khu vực giới Trong nhiều văn hóa người ta sử dụng cháo ngơ, polenta Italia, angu Brasil, mămăligă Romania hay mush Hoa Kỳ thức ăn gọi sadza, nshima, ugali mealie pap châu Phi Ngơ thành phần tortilla, atole nhiều ăn khác ẩm thực Mexico, hay chicha, loại đồ uống lên men Trung Nam Mỹ Việc ăn ngơ cịn lõi tùy thuộc vào văn hóa Nó phổ biến Hoa Kỳ dường không thấy châu Âu Ngô (hạt) Giá trị dinh dưỡng 100 g (3,5 oz) Năng lượng 360 kJ (86 kcal) Các bon hyđrát 19 g Đường 3.2 g Chất xơ thực phẩm 2.7 g Chất béo 1.2 g Protein 3.2 g Vitamin A equiv 10 μg (1%) Thiamine (Vit B1) 0.2 mg (15%) Niacin (Vit B3) 1.7 mg (11%) Axít folic (Vit B9) 46 μg (12%) Vitamin C mg (12%) Sắt 0.5 mg (4%) Ma giê 37 mg (10%) Ka li 270 mg (6%) Tỷ lệ phần trăm theo lượng hấp thụ thường nhật người lớn Nguồn: Cơ sở liệu USDA Ngô dạng biến đổi gen chứa nhiều đường tinh bột, dùng loại rau Bỏng ngô hạt ngô từ vài giống, thứ ngô nổ để xốp bị rang nóng Nó loại đồ ăn chủ yếu dành cho người thích ăn quà vặt 10 Taq-polymerase 0,5 Tổng 20,0 Điện di sản phẩm RAPD Pha agarose 2% TAE 1X Chạy điện di với hiệu điện 100V 90 phút Nhuộm gel ethidium bromide 0,5 µg/ml 15 phút, rửa nước, soi gel đèn UV chụp ảnh Phân tích số liệu RAPD Dựa xuất hay không xuất phân đoạn DNA điện di sản phẩm RAPD giống ngô nếp với đoạn mồi ngẫu nhiên để làm sở cho phân tích số liệu theo quy ước: Số 1: xuất phân đoạn DNA, số 0: không xuất phân đoạn DNA Các số liệu xử lý máy vi tính theo chương trình NTSYSpc version 2.0 để xác định quan hệ di truyền giống ngô mức độ phân tử 2.2.2.4 Phương pháp xử lý kết tính tốn số liệu Mỗi thí nghiệm nhắc lại lần Sử dụng toán thống kê để xác định trị số thống kê trung bình mẫu ( x), phương sai (σ2 ) độ lệch chuẩn (σ), sai số trung bình mẫu (S x), với n ≤ 30, α = 0,05.Các số liệu xử lý máy vi tính chương trình Excel Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, HĨA SINH HẠT CỦA CÁC GIỐNG NGÔ NGHIÊN CỨU 3.1.1 Đặc điểm hình thái 14 giống ngơ nghiên cứu Hình thái khối lượng hạt đặc tính quan trọng chọn giống ngơ liên quan đến chất lượng suất Kết nghiên cứu hình thái khối lượng 100 hạt trình bày bảng 3.1 hình 3.1 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khối lượng hạt 14 giống ngô nếp địa phương STT Hình thái hạt Khối lượng 100 Màu vỏ hạt TL Hạt nhỏ, góc hạt (g) 16,09 ± 0,001 Trắng ngà VN cạnh Hạt tròn, mẩy 16,72 ± 0,002 Trắng vàng, tím CB Hạt trịn, mẩy 20,45 ± 0,003 Trắng ngà SL0 Hạt tròn, mẩy 21,21 ± 0,002 Trắng ngà T26 Hạt dẹt , mẩy 28,88 ± 0,003 Vàng SL Hạt dẹt , mẩy 25,50 ± 0,003 Trắng ngà SLV Hạt tròn, mẩy 26,81 ± 0,004 Trắng đục TQ Hạt t rịn, mẩy 23,42 ± 0,001 Trắng đục ƠL Hạt nhỏ, dẹt ,dài 17,19 ± 0,002 Trắng ngà 10 ĐP Hạt nhỏ, trịn, 19,63 ± 0,001 Trắng đục, tím 11 LC mẩy Hạt tròn, mẩy 24,50 ± 0,001 Trắng đục 12 SLT Hạt nhỏ, dẹt , dài 23,35 ± 0,001 Trắng đục, tím Giống 41 13 YB Hạt trịn, mẩ y 27,42 ± 0,004 Trắng ngà 14 T4 Hạt nhỏ, dẹt 25,46 ± 0,003 Trắng ngà, vàng Tính trạng màu sắc hạt kiểu gen quy định, chịu ảnh hưởng môi trường Vỏ bao quanh hạt ngô màng mỏng, nhẵn có màu trắng, vàng hay tím tuỳ giống Màu sắc vỏ ngơ tiêu quan trọng để phân loại thứ loài phụ Kết bảng 3.1 cho thấy, khối lượng 100 hạt 14 giống ngô dao động khoảng 16,09 g đến 28,88 g, cao giống T26, thấp giống TL Khối lượng hạt phụ thuộc vào kiểu gen giống Thứ tự giống ngô từ cao xuống thấp xếp theo khối lượng 100 hạt là: T26 > YB > SLV > SL > T4> LC > TQ > SLT > SLO > CB > ĐP > ÔL > VN > TL Tính trạng khối lượng hạt phụ thuộc vào kiểu gen giống Tuy nhiên, khối lượng 100 hạt bị thay đổi chịu tác động xấu môi trường giai đoạn định 3.1.2 Hàm lượng protein, lipid, đường 14 giống ngô nghiên cứu Để đánh giá chất lượng hạt 14 giống ngô nghiên cứu, xác định hàm lượng protein, lipid, đường hạt giống ngô, kết phân tích thể bảng 3.2 42 Bảng 3.2 Hàm lượng protein, lipid, đường hạt 14 giống ngô STT Giống Protein (%) Lipid (%) Đường (%) TL 9,67± 0,001 4,51±0,01 7,21±0,01 VN 10,93±0,001 4,72±0,06 6,14±0,02 CB 11,24±0,002 5,05±0,05 6,22±0,02 SL0 10,25±0,001 4,45±0,02 6,45 ±0,05 T26 11,15±0,003 4,78±0,01 6,65±0,03 SL 10,55±0,003 4,56±0,04 5,76±0,03 SLV 12,25±0,001 4,64±0,05 6,34±0,04 TQ 11,39±0,004 4,50±0,06 6,41±0,01 ÔL 10,45±0,001 5,15±0,02 6,25±0,02 10 ĐP 11,64±0,002 4,0 5±0,01 6,62±0,04 11 LC 7,09± 0,001 3,75±0,05 8,5 0±0,05 12 SLT 8,25± 0,003 3,87±0,04 6,80±0,01 13 YB 8,61±0,002 3,93±0,03 5,51+0,03 14 T4 7,50±0,001 3,80±0,03 5,70±0,01 Bảng 3.2 cho thấy, hàm lượng protein 14 giống ngô dao động khoảng , - , % Giố ng SLV có hàm lượng protein cao nhất, cịn 43 giống LC có hàm lượng protein thấp Thứ tự giống ngô từ cao xuống thấp xếp theo hàm lượng protein là: SLV > ĐP > TQ > CB > T26 > VN > SL > OOL > Slo > TL > YB > SLT > T4 > LC Hàm lượng protein mà xác định theo phương pháp Kendal có thấp so với xác định phương pháp Lowry Ngô Việt Anh (2005) xác định hàm lượng protein tan giống ngô nếp theo Lowry, hàm lượng protein dao động khoảng 10,5%-14,11% Hàm lượng protein trung bình giống ngơ thấp so với số trồng đậu tương, đậu xanh, lạc Ở đậu xanh, hàm lượng protein chiếm khoảng 24%, đậu tương chiếm khoảng 30-45%, lạc khoảng 26% Kết phân tích hàm lượng lipid giống ngô cho thấy, hàm lượng lipid hạt dao động khoảng 3,75-5,15% Giống ƠL có hàm lượng lipid cao nhất, cịn giống LC có hàm lượng lipid thấp Thứ tự giống ngô từ cao xuống thấp xếp theo hàm lượng lipid là: ÔL > CB > T26 > VN > SLV > SL > TL > TQ > S L0 > ĐP > YB > SLT > T4 > LC Hàm lượng lipid ngô cao đậu xanh thấp so với đậu tương lạc Lipid hạt đậu tương chiếm khoảng 19-25%, đậu xanh chiếm khoảng 1,3%, lạc chiếm khoảng 49% Hàm lượng lipid liên quan đến bảo quản hạt giống, giống có hàm lượng lipid cao khó bảo quản Lipid hạt ngơ chứa khoảng 50% acid linoleic, acid béo quan trọng cần thiết cho người động vật động vật không tự tổng hợp acid Hàm lượng đường xác định theo phương pháp Bertrand Kết cho thấy, hàm lượng đường hạt giống ngô nghiên cứu cao, dao động từ 5,51-8,50% Giống LC có hàm lượng đường cao nhất, cịn giốngYB có hàm lượng đường thấp Thứ tự giống ngô từ cao xuống thấp xếp theo hàm lượng đường là: LC > TL > SLT > T26 > ĐP > SL0 > TQ > SLV > TL > CB > VN > SL > T4 > YB Đường đóng vai trò quan trọng việc điều chỉnh áp suất thẩm thấu dịch bào gặp điều kiện ngoại cảnh bất lợi 44 Hàm lượng đường hạt 14 giống ngơ phân tích cao so với hàm lượng đường trung bình ngơ (3,5%) 3.2 PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH DNA BẰNG KỸ THUẬT RAPD Cơng nghệ sinh học có nhiều đóng góp có giá trị sản xuất nông nghiệp đặc biệt lĩnh vực chọn giống trồng với việc sử dụng kỹthuật sinh học phân tử với mục đích phân tích quan hệ di truyền đánh giá hệ gen thực vật RAPD kỹ thuật thuận lợi có hiệu Trong nghiên cứu này, chúng tơi trình bày kế t ứng dụng RAPD vào việc phân tích tính đa hình DNA 14 giống ngơ nếp địa phương 3.2.1 Kết tách chiết DNA tổng số từ ngô Điều quan tâm hàng đầu kỹ thuật tách chiết acid nucleic thu nhận phân tử trạng thái nguyên vẹn không bị phân huỷ tác nhân học bị đứt gãy, điều kiện định cho thành cơng q trình nghiên cứu Kết đo phổ hấp thụ DNA bước sóng 260nm 280 nm thể bảng 3.3 Kết cho thấy, tỷ số A260/A280 dao động khoảng 1,8-2,0, chứng tỏ DNA tổng số thu đảm bảo cho việc thực kỹ thuật RAPD Kết kiểm tra cho thấy DNA mẫu thu không bị đứt gãy Khi đo OD bước sóng 260 nm có đỉnh hấp thụ 260 nm 45 Bảng 3.3 Phổ hấp thụ DNA bước sóng 260nm 280nm Tên mẫu TL VN CB A260 0,018 0,015 0,016 A280 0,0100 0,0080 0,0084 A260/A280 1,80 1,88 1,90 SL0 0,015 0,0079 1,89 T26 0,018 0,0090 2,00 SL SLV TQ ÔL ĐP 0,017 0,013 0,014 0,018 0,016 0,0090 0,0070 0,0070 0,0090 0,0085 1,88 1,86 2,00 2,00 1,88 LC SLT YB 0,015 0,016 0,015 0,0078 0,0081 0,0079 1,92 1,98 1,99 T4 0,017 0,0088 1,93 Như vậy, mẫu DNA thu có độ tinh cao, sử dụng cho thí nghiệm phân tích DNA Sau tách chiết tinh DNA tổng số tiến hành pha lỗng hàm lượng DNA hàm lượng 10ng/µl để phục vụ cho nghiên cứu đa hình DNA 3.2.2 Kết nghiên cứu đa hình DNA kỹ thuật RAPD Để phân tích mối quan hệ di truyền 14 giống ngô địa phương sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên có độ dài 10 nucleotide với kí hiệu M1, M2, M3, M4, M5, M6, M8, M9, RA159, UBC 23 Tổng số băng xuất mồi giống ngô thống kê sử lý kết Kết cho thấy, 10 mồi nghiên cứu mồi M4 xuất nhiều phân đoạn DNA nhân (13 phân đoạn) với kích thước quan sát từ 0,221,70kb, nhiều giống LC xuất 12 băng DNA nhân Tuy nhiên, có số mồi khuếch đại băng, làm ồi M1, M2, M5: Mồi M1 nhân băng DNA rõ nét hai giống YB T4, mồi M2 46 nhân băng DNA rõ nét giống SLV, mồi M5 nhân băng DNA giống TQ ÔL (Bảng 3.4) Bảng 3.4 cho thấy, tổng số phân đoạn DNA nhân giống với 10 mồi ngẫu nhiên dao động từ 41 đến 55 phân đoạn, giống LC có tổng số băng nhân với 10 mồi nhiều (55 băng), giống TL có số băng DNA nhân với 10 mồi (41 băng) Tổng số phân đoạn DNA nhân ngẫu nhiên thu từ 14 giống ngô với 10 mồi 674 Bảng 3.4 Số phân đoạn DNA xuất giống ngô nghiên cứu Mồi M1 M2 M3 M4 M5 M6 Giống TL VN CB SL0 T26 SL SLV TQ ÔL ĐP LC SLT YB T4 Tổng 3 3 3 3 1 35 2 2 2 2 2 29 4 11 3 10 8 10 7 11 55 123 114 9 9 9 10 10 9 10 25 M8 M9 4 4 4 4 4 4 4 112 64 RA159 UBC23 Tổng 9 7 90 7 7 5 69 41 48 51 50 50 53 49 47 43 45 55 48 45 49 674 Dưới kết phân tích RAPD mồi điện di sản phẩm RAPD gen agarose 2% Mồi M1 Kết điện di sản phẩm RAPD 14 giống ngô nếp với mồi M1 cho thấy, mồi có số phân đoạn DNA nhân ngẫu nhiên dao động từ đến phân đoạn 47 Kích thước phân đoạn có chiều dài ước tính khoảng 0,7 kb đến 1,4 kb Trong giống TL, CB, T26, SL, TQ, ƠL, ĐP, LC, SLT có số phân đoạn 3, giống VN, SLO, SLV có phân đoạn, cịn giống YB, T4 có phân đoạn nhân Tính đa hình thể xuất hay khơng xuất phân đoạn DNA nhân ngẫu nhiên so sánh giống với Tại vị trí 1,40 kb có ba giống SLT, YB, T4 khơng có đoạn DNA nhân bản, giống cịn lại xuất phân đoạn DNA Tại kích thước 1,20 kb có năm giống VN, SLO, SLV, YB, T4 khơng xuất phân đoạn DNA, giống cịn lại xuất phân đoạn Ở vị trí 0,8kb có hai giống YB, T4 khơng phân đoạn cịn lại phân đoạn Ở kích thước 0,7 kb ba giống SLT, YB, T4 phân đoạn, giống lại phân đoạn Như vậy, với mồi M1 số phân đoạ nDNA nhân 14 giống ngô nếp địa phương thể sai khác cấu trúc DNA giống ngô nếp bốn vị trí 1,40 kb, 1,20 kb, 0,8 kb, 0,7k b Mồi M2 Kết điện di sản phẩm RAPD 14 giống ngô nếp với mồi M2 cho thấy, số phân đoạn DNA xuất nhân ngẫu nhiên phân đoạn Ở kích thước khoảng 0,75kb, tất giống xuất băng Chỉ có hai giống TQ LC xuất băng DNA kích thước khoảng 1,2kb Ở kích thước 1,5kb, giống SLV không xuất băng DNA khuếch đại, giống lại xuất băng Mồi M3 Mồi M3 khuếch đại phân đoạn với kích thước từ 0,5-2,0kb Ở kích thước 0,7kb, 1,0kb 1,2kb, tất giống ngô nghiên cứu xuất Mồi M4 Kết điện di sản phẩm RAPD với mồ iRA40 14 giống ngô cho thấy, có từ đến 12 phân đoạn có kích thước tương ứng khoảng 0,22 kb đến 1,7 kb Giống LC có số phân đoạn DNA nhân nhiều 12 phân đoạn Giống 48 SLO, T4 có số phân đoạn DNA nhân 11 phân đoạn Ba giống TL, SLT, YB có số phân đoạn DNA phân đoạn Đặc biệt, vị trí 0,32kb 0,80kb có giống T4 xuất phân đoạn DNA nhân bản, giống lại khơng thấy x uất Ở kích thước 1,49 kb đến 1,70 kb hai giống SLT, YB không xuất phân đoạn D N A, giống lại xuất Tại kích thước 0,63 kb giống TL khơng xuất phân đoạn DNA, giống cịn lại xuất phân đoạn DNA nhân kích thước 0,60 kb giống CB, SLO, SL, LC, SLT, YB xuất phân đoạn DNA, giống cịn lại phân đoạn Ở vị trí 0,32 kb có giống LC xuất phân đoạn D N A, giống cịn lại khơng xuất phân đoạn DNA Kích thước khoảng từ 0,22 kb đến 0,24 kb có giống SLO, TQ, LC, T4 có phân đoạn DNA, 12 giống ngơ cịn lại khơng có phân đoạn Tại vị trí 1,25 kb, 1,10 kb, 1,0 kb, 0,72 kb, 0,46 kb tất giống có phân đoạn DNA Như vậy, với mồi M4 có 13 kích thước (0,22 kb, 0,24 kb, 0,32 kb, 0,60 kb, 0,63kb, 0,80 kb, 1,49 kb, 1,70 kb) thể tính đa hình có kích thước (1,25 kb, 1,10 kb, 1,0 kb, 0,72 kb, 0,46 kb) khơng biểu tính đa hình Mồi M5 Mồi M5 khuếch đại phân đoạn với kích thước từ 0,27-1,2kb Ở tất kích thước xuất biểu tính đa hình Mồi M6 Mồi M6 khuếch đại 10 phân đoạn với kích thước từ 0,2-2,0kb Biểu đa hình giống ngơ nghiên cứu thể hai băng kích thước 0,2kb 0,25kb Ở kích thước cịn lại (0,5kb; 0,7kb; 0,9kb; 1,0kb; 1,2kb; 1,4kb; 1,5kb; 2,0kb) khơng biểu đa hình Mồi Mồi M8 khuếch đại phân đoạn với kích thước từ 0,6-1,5kb Các giống ngơ nghiên cứu xuất băng DNA nhân Như vậy, mồi M8 khơng biểu đa hình 49 Mồi Mồi M9 khuếch đại phân đoạn với kích thước từ 0,4-0,6kb Chỉ có kích thước 0,6kb biểu đa hình, cịn kích thước 0,4kb 0,5kb khơng biểu đa hình (tất giống ngơ xuất băng này) Mồi RA159 Kết phân tích điện di sản phẩm RAPD 14 giống ngô nếp với mồi RA159 thể qua bảng 3.4 Kết cho thấy, xuất từ đến phân đoạn DNA có kích thước tương ứng khoảng 0,21 kb đến 1,50 kb Bốn giống VN, CB, T26, SL xuất phân đoạn DNA vị trí 1,50 kb Ở ba kích thước 0,7 kb, 1,0 kb 1,20 kb giống ĐP không xuất phân đoạn DNA, giống lại xuất phân đoạn Giống VN, CB, T26, LC, SLT, YB xuất phân đoạn nhân ngẫu nhiên kích thước 0,8 kb Cịn kích thước 0,56 kb có giống ƠL khơng phân đoạn, giống cịn lại xuất phân đoạn Ở vị trí 0,54 kb giống CB, SLO, T26, SL, SLV,YB phân đoạn DNA, giống cịn lại khơng phân đoạn Tại kích thước 0,36 kb giống TL, VN, TQ, ÔL, ĐP, T4 phân đoạn Kích thước 0,21 kb tất giống phân đoạn DNA Như với mồi RA159 có kích thước có kích thước (1,5 kb, 1,2 kb, 1,0 kb, 0,8 kb, 0,7 kb, 0,56 b, 0,54 kb, 0,36 kb) thể tính đa hình có kích thước 0,21 kb khơng biểu tính đa hình 50 Mồi UBC23 Phân tích điện di sản phẩm RAPD 14 giống ngô nghiên cứu với mồi UBC23 cho thấy, xuất từ đến phân đoạn DNA nhân ngẫu nhiên Các phân đoạn DNA có kích thước ước tính khoảng từ 0,19 kb đến 0,64 kb Trong bốn giống T26, SL, SLV, ĐP xuất phân đoạn DNA giống TL xuất phân đoạn DNA thấp (chỉ có phân đoạn) Các giống T26, SLV, ÔL, ĐP xuất phân đoạn DNA nhân ngẫu nhiên kích thước 0,64 kb Từ kích thước 0,48 kb đến 0,60 kb tất giống xuất phân đoạn DNA Ở kích thước 0,4 giống ngơ nghiên cứu xuất phân đoạn DNA (trừ giống TL) Tại vị trí 0,38 kb giống ngơ (TL, VN, CB, SLO,TQ, LC, SLT, YB, T4) phân đoạn DNA Còn vị trí 0,36 kb giống ngơ (T26, SL, SLV, TQ, LC, SLT, T4) xuất phân đoạn DNA, giống ngơ cịn lại phân đoạn Ở vị trí 0,30 kb giống phân đoạn DNA trừ giống LC, SLT, T4 Kích thước 0,24 kb có hai giống SL, ĐP xuất phân đoạn DNA nhân bản, giống lại không xuất phân đoạn Các giống phân đoạn DNA vị trí 0,21 kb trừ giống ƠL Hai giống CB, SL có phân đoạn DNA nhân ngẫu nhiên, giống ngơ cịn lại khơng phân đoạn DNA vị trí 0,20 kb Tại vị trí 0,19 kb giống khơng xuất phân đoạn DNA nhân ngẫu nhiên trừ bốn giống T26, SLV,TQ, ĐP xuất phân đoạn DNA nhân ngẫu nhiên Như vậy, sử dụng mồi UBC23 tính đa hình biểu kích thước (0,64 kb, 0,4 kb, 0,38 kb, 0,36, 0,3 kb, 0,24 kb, 0,21 kb, 0,2 kb, 0,19 kb), cịn kích thước 0,60 kb 0,48 kb khơng biểu tính đa hình Tỷ lệ đa hình phân đoạn DNA xuất Với 140 phản ứng PCR thực điện di sản phẩm thu 674 phân đoạn DNA 68 loại phân đoạn DNA từ 14 giống ngơ địa phương Kích thước phân đoạn DNA nhân khoảng từ 0,2kb-2,0kb Số lượng phân đoạn tương ứng với mồi nằm khoảng 3-13 băng, mồi M2 M9 nhân 51 (3 phân đoạn) mồi M4 nhân nhiều (13 phân đoạn) Qua phân tích điện di sản phẩm RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên 14 giống ngô nếp địa phương nhận thấy có mồi biểu đa hình, mồi khơng biểu đa hình (mồi M8), tỷ lệ % đa hình thể bảng 3.5 Bả n g 3.5 cho thấy, mồi M1 mồi M5 có số phân đoạn đa hình cao (100%) sau mồi RA159 với tỷ lệ đa hình chiếm 88,89% Mồi M8 khơng biểu đa hình băng DNA nhân có mặt tất mẫu ngô nghiên cứu Ngô Việt Anh (2005) sử dụng mồi nghiên cứu đa hình giống ng cho thấy tỷ lệ đa hình đạt từ 33,3% đến 80% [ ] Như vậy, so với kết tỷ lệ phân đoạn đa hình 14 giống ngơ mà chúng tơi nghiên cứu cao Bảng 3.5 Tỷ lệ phân đoạn đa hình sử dụng 10 mồi RAPD Mồi Phân đoạn DNA Phân đoạn đa hình Tỷ lệ % phân nhân đoạn đa hình M1 4 100 M2 66,67 M3 60 M4 13 61,54 M5 6 100 M6 10 20 M8 0 M9 33,33 RA159 88,89 UBC23 11 81,82 Mối quan hệ di truyền giống ngơ dựa phân tích RAPD Dựa xuất hay không xuất phân đoạn DNA giống điện di sản phẩm RAPD, xác định hệ số đa dạng di truyền giống ngô nếp mức độ phân tử Các số liệu tính tốn phân tích theo chương trình NTSYSpc version 2.0 (Applied Biostatistics Inc., USA., 1998) (theo quy ước = xuất hiện; = không xuất hiện) Kết nhận hệ số tương đồng di truyền giống ngô nếp thể (bảng 3.6) Bảng 3.6 Hệ số tương đồng di truyền 14 giống ngô nếp 52 Giống TL VN CB SL0 T26 SL SLV TQ ÔL ĐP LC SLT YB T4 TL VN CB Slo T26 SL SLV TQ ÔL ĐP LC SLT TB T4 1,00 0,85 0,84 0,84 0,89 0,79 0,78 0,82 0,87 0,81 0,75 0,97 0,75 0,74 1,00 0,87 0,87 0,81 0,82 0,81 0,76 0,81 0,75 0,81 0,82 0,81 0,82 1,00 0,79 0,87 0,82 0,81 0,79 0,74 0,85 0,81 0,82 0,84 1,00 0,87 0,88 0,84 0,85 0,79 0,74 0,78 0,74 0,72 1,00 0,78 0,79 0,79 0,76 0,78 0,77 0,75 1,00 0,84 0,81 0,78 0,74 0,69 0,79 1,00 0,85 0,71 0,75 0,71 0,75 1,00 0,68 0,69 0,68 0,69 1,00 0,84 0,76 0,78 1,00 0,90 0,82 1,00 1,00 0,85 0,85 0,87 0,82 0,75 0,79 0,77 0,82 0,84 0,82 0,72 1,00 0,84 0,77 0,78 0,75 0,78 0,79 0,75 0,74 1,00 0,78 Hệ số tương đồng di truyền phản ánh quan hệ di truyền giống ngô với Hai giống ngô gần mặt di truyền hệ số tương đồng chúng lớn ngược lại hai giống có hệ số tương đồng di truyền thấp mối quan hệ di truyền chúng xa Bảng 3.6 thể hệ số tương đồng di truyền cặp giống Kết cho thấy, hệ số di truyền 14 giống ngô dao động khoảng 0,68 đến 0,90 Trong đó, hai giống SLT YB có hệ số đồng dạng lớn 0,90, cặp giống: LC ĐP, ĐP YB có hệ số tương đồng nhỏ 0,68 Sau phân t ích hệ số đồng dạng chúng tơi xây dựng sơ đồ hình (hình 3.12) để sai khác di truyền giống ngô Mức độ khác biểu hệ số sai khác giống Các giống có hệ số di truyền cao xếp vào nhóm, nhóm lại có liên kết với Ta thấy, 14 giống ngơ chia làm nhóm chính: - Nhóm I: gồm giống TL, ƠL, TQ, ĐP, VN, CB, SLo, SL , T26, SLV - Nhóm II : LC, SLT, YB, T4 Hai nhóm ngơ có sai khác di truyền từ 10% đến 23% (tức tỷ lệ tương đồng di truyền 77% đến 90%) - Nhóm I lại chia làm hai nhóm phụ Nhóm phụ thứ gồm giống ( TL, ƠL, TQ, ĐP); nhóm phụ thứ hai gồm giống (VN, CB, SL, T26, SLV) với khoảng cách di truyền 20,5% (100% - 79,5%) 53 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN 1.1 Khối lượng 100 hạt giống ngô dao động từ 16,09g đến 28,88 g Trong đó, giống T26 có khối lượng hạt cao (28,88g), thấp giống TL (16,09g) 1.2 Đánh giá chất lượng hạt cho thấy, hàm lượng protein, lipid đường tương đối cao Hàm lượng protein hạt 14 giống ngô dao động khoảng 7,09-12,25%, hàm lượng lipid khoảng 3,75-5,15% , hàm lượng đường khoảng 5,51-8,50% 1.3 Bằng kỹ thuật RAPD với việc sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên nhận 674 phân đoạn DNA nhân ngẫu nhiên từ hệ gen 14 giống ngô nếp địa phương Trong số 10 mồi ngẫu nhiên sử dụng có mồi biểu tính đa hình 1.4 Hệ số sai khác di truyền giống ngô dao động từ 10% đến 32% 14 giống ngơ chia làm hai nhóm với khoảng cách di truyền từ 10% đến 23% ĐỀ NGHỊ Kết hợp số kỹ thuật phân tích quan hệ di truyền khác SSR, AFLP,…để xác định mối quan hệ di truyền giống ngô để kết tin cậy 54 ... CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở THỰC VẬT 1.2.1 Một số phương pháp sinh học phân tử sử dụng nghiên cứu quan hệ di truyền thực vật 1.2.1.1 Kỹ thuật RFLP (restriction fragment length polymorphisms – đa. .. lúa mì, đu đủ, đậu tương phát hiện, bảo tồn đa dạng di truyền đặc biệt lồi q hay số giống thực vật địa phương 1.2.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật kỹ thuật RAPD Hiện nay, kỹ thuật RAPD ứng... giá di truyền ngơ nước ta cịn Sự đa dạng di truyền mức độ sai khác giống ngô nghiên cứu mức độ phân tử đồng thời giải thích tính đa dạng nguồn gen ngô 33 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 VẬT