Báo cáo bài tập lớn dược liệu bình vôi (stephania)

BÁO CÁO BÀI TẬP LỚN DƯỢC LIỆU: BÌNH VÔI (Stephania) GVHD: Phan Nguyễn Quỳnh Anh Lớp: HC17HD Nhóm 3   NỘI DUNG I. SƠ LƯỢC VỀ CÂY BÌNH VÔI 6 1. Phân loại khoa học 6 2. Đặc điểm thực vật 7 2.1. Stephania glabra (Roxb.) Miers 7 2.2. Stephania kuinanensis H. S. Lo et M. Yang 7 2.3. Stephania pierrei Diels 8 2.4. Stephania hainanensis H. S. Lo et Y Tsoong 8 2.5. Stephania cambodiana Gagnep 8 2.6. Stephania dielsiana Y. C. Wu 8 2.7. Stephania excentrica H. S. Lo 9 2.8. Stephania cepharantha Hay 9 2.9. Stephania sinica Diels 9 2.10. Stephania viridiflavens H. S. Lo et M. Yang. 9 3. Phân bố, trồng hái và chế biến 9 II. THÀNH PHẦN HÓA HỌC 10 1. Rotundin 10 1.1. Công thức phân tử: C21H25NO4. 10 1.2. Công thức cấu tạo: 10 1.3. Tính chất vật lý 11 1.4. Một số kết quả nghiên cứu về hoạt tính sinh học 11 2. Roemerin 12 2.1. Công thức phân tử: C18H17NO2. 12 2.2. Công thức cấu tạo 12 2.3. Tác dụng 12 3. Cepharanthin 12 3.1. Công thức phân tử: C37H38N2O6. 12 3.2. Công thức cấu tạo: 13 3.3. Tác dụng 13 III. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ ROTUNDIN TRONG CÂY BÌNH VÔI 13 1. Phương pháp chung chiết tách các hợp chất alkaloid 13 1.1. Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ không phân cực. 13 1.2. Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng muối bằng dung môi nước, nước acid hoặc cồn (ethanol, methanol ) 15 1.3. Các phương pháp tách alcaloid dưới dạng tinh khiết 16 2. Tách chiết và tinh chế Rotundin từ củ Bình vôi 18 IV. CHIẾT XUẤT CÁC ALKALOID TRONG CÂY BÌNH VÔI 21 1. Chiết bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm 21 2. Phương pháp chiết xuất Routundin trong công nghiệp 22 2.1. Chiết xuất Routundin thô 22 2.2. Quy trình tinh chế routundin thô 23 V. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH: 23 1. Định tính bằng thuốc thử 23 2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng 24 VI. ĐỊNH LƯỢNG ROTUNDIN 24 1. Định lượng bằng phương pháp cân: 24 1.1. Nguyên tắc chung 24 1.2. Các bước tiến hành: 25 2. Định lượng alkaloid bằng phương pháp acid base 26 2.1. Nguyên tắc chung 26 2.2. Các bước tiến hành 27 3. Phương pháp đo quang: 29 4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 30 VII. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA ROEMERINE 31 1. Nguyên liệu 31 2. Kiểm tra độ nhạy 31 3. Kết quả 31 VIII. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA ROUTUNDIN 33 IX. Ứng dụng 34 X. TÀI LIỆU THAM KHẢO: 35

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN HỮU CƠ BÁO CÁO BÀI TẬP LỚN DƯỢC LIỆU: BÌNH VƠI (Stephania) GVHD: Phan Nguyễn Quỳnh Anh Lớp: HC17HD Nhóm NỘI DUNG I SƠ LƯỢC VỀ CÂY BÌNH VÔI .6 Phân loại khoa học Đặc điểm thực vật 2.1 Stephania glabra (Roxb.) Miers 2.2 Stephania kuinanensis H S Lo et M Yang 2.3 Stephania pierrei Diels 2.4 Stephania hainanensis H S Lo et Y Tsoong .8 2.5 Stephania cambodiana Gagnep 2.6 Stephania dielsiana Y C Wu 2.7 Stephania excentrica H S Lo .9 2.8 Stephania cepharantha Hay 2.9 Stephania sinica Diels 2.10 Stephania viridiflavens H S Lo et M Yang .9 Phân bố, trồng hái chế biến II THÀNH PHẦN HÓA HỌC 10 Rotundin 10 1.1 Công thức phân tử: C21H25NO4 10 1.2 Công thức cấu tạo: .10 1.3 Tính chất vật lý 11 1.4 Một số kết nghiên cứu hoạt tính sinh học .11 Roemerin 12 2.1 Công thức phân tử: C18H17NO2 12 2.2 Công thức cấu tạo 12 2.3 Tác dụng 12 Cepharanthin 12 3.1 Công thức phân tử: C37H38N2O6 12 3.2 Công thức cấu tạo: .13 3.3 Tác dụng 13 III PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ ROTUNDIN TRONG CÂY BÌNH VÔI 13 Phương pháp chung chiết tách hợp chất alkaloid 13 1.1 Phương pháp chiết alkaloid dạng base dung môi hữu không phân cực 13 1.2 Phương pháp chiết alkaloid dạng muối dung môi nước, nước acid cồn (ethanol, methanol ) 15 1.3 Các phương pháp tách alcaloid dạng tinh khiết 16 Tách chiết tinh chế Rotundin từ củ Bình vơi .18 IV CHIẾT XUẤT CÁC ALKALOID TRONG CÂY BÌNH VƠI 21 Chiết dung môi hữu môi trường kiềm 21 Phương pháp chiết xuất Routundin công nghiệp 22 V 2.1 Chiết xuất Routundin thô .22 2.2 Quy trình tinh chế routundin thô 23 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH: 23 Định tính thuốc thử 23 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 24 VI ĐỊNH LƯỢNG ROTUNDIN 24 Định lượng phương pháp cân: 24 1.1 Nguyên tắc chung 24 1.2 Các bước tiến hành: 25 Định lượng alkaloid phương pháp acid- base 26 2.1 Nguyên tắc chung 26 2.2 Các bước tiến hành 27 Phương pháp đo quang: .29 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC .30 VII PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA ROEMERINE 31 Nguyên liệu 31 Kiểm tra độ nhạy 31 Kết 31 VIII PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA ROUTUNDIN 33 IX Ứng dụng .34 X TÀI LIỆU THAM KHẢO: 35 MỤC LỤC HÌNH Hình Cây bình vơi Hình Củ bình vơi khơ Hình Cơng thức cấu tạo Rotundin 11 Hình Công thức cấu tạo Roemerin .12 Hình Cơng thức cấu tạo Cepharanthin 13 Hình Sơ đồ chiết alkaloid dạng base dung môi hữu không phân cực 15 Hình Sơ đồ quy trình chiết L- Tetrahydropalmatin từ củ bình vơi 21 Hình MIC roemerine kháng sinh môi trường nuôi cấy Mueller-Hinton .32 Hình Sự ức chế phụ thuộc vào nồng độ roemerine đến sinh trưởng bốn chủng S aureus .32 Hình 10 Trục quay Rotarod 33 Hình 11 Sơ đồ nghiên cứu thời gian bám chuột trục quay Rotarod 33 Hình 12 Viên Rotundin 30mg 34 I SƠ LƯỢC VỀ CÂY BÌNH VƠI Phân loại khoa học Hình Cây bình vơi Giới (regnum): Plantae (không phân hạng): Angiospermae (không phân hạng) Eudicots Bộ (ordo): Ranunculales Họ (familia): Menispermaceae Chi (genus): Stephania Lour Chi Stephania có khoảng 45 lồi Một số lồi công bố Việt Nam:  Stephania glabra (Roxb.) Miers  Stephania kuinanensis H S Lo et M Yang  Stephania pierrei Diels  Stephania hainanensis H S Lo et Y Tsoong  Stephania cambodiana Gagnep  Stephania dielsiana Y C Wu  Stephania excentrica H S Lo  Stephania cepharantha Hay  Stephania sinica Diels  Stephania viridiflavens H S Lo et M Yang  Stephania brachuandra Diels  Stephania kwangsiensis H S Lo Đặc điểm thực vật 2.1 Stephania glabra (Roxb.) Miers Thân leo phát triển từ củ hình trịn, củ thường nằm khe đá, vỏ củ có nốt sần, đơi có rãnh nhỏ ngang dọc Nhựa từ thân không mang màu Lá đơn, mọc so le, mép nguyên, đơi chia thùy phần Tồn thân khơng có lơng Cuống dài – 25 cm, gốc phình lên cong Phiến hình tim, thn nhọn, mặt xanh lợt Lá có – 11 gân xếp tỏa trịn cuống dính vào 1/3 phiến tính từ gốc Cụm hoa đực dạng tán kép, cuống cụm hoa dài – 12 cm, cuống cụm hoa gồm nhiều tán, tán lại có nhiều tán cấp II, cuống tán cấp II mang tán cấp III, kết thúc gồm hoa với cuống hoa ngắn Hoa đực gồm đài rời xếp thành vịng (3 + 3), kích thước gần Đài hình trứng hẹp, chiều dài 1,55 mm Ba cánh hoa hình trứng màu xanh cịn nụ chuyển màu vàng hoa nở, gốc cánh hoa đơi tuyến Bộ nhị hàn liền thành trụ với bao phấn màu vàng xếp thành vòng tròn, trụ nhị hàn liền tạo thành cột ngắn 0,5 – mm Khi hoa nở, bao phấn mở nắp ngang xung quanh Hạt phấn nhỏ màu vàng Cụm hoa dạng xim tán, cuống hoa ngắn nên hoa xếp xít vào thành dạng đầu Mỗi đầu gồm 20 – 70 hoa Cuống cụm hoa dài – cm Hoa bất đối xứng Mỗi hoa có đài hình elip dài mm Hai cánh hoa gần trịn, đường kính – 1,2 mm, đài cánh hoa xếp lệch phía hoa Bầu hình trứng, núm nhụy chia – thùy dạng gai nhỏ khơng có vịi nhụy Quả hạch hình trứng ngược dài – mm, rộng – mm Vỏ nhẵn, lúc non màu xanh, chuyển sang màu vàng đỏ sẫm chín Hạt hình trứng ngược, cụt đầu, vỏ hạch cứng chia nhiều vạng (17 – 20 vạch) Giá nỗn có lỗ thủng Mùa hoa: tháng – Mùa quả: tháng – 2.2 Stephania kuinanensis H S Lo et M Yang Thân leo dài – m, củ trịn, bề mặt vỏ củ có nhiều nốt sần Tồn khơng có lơng, có cuống, phiến dạng tam giác, chop nhọn, gốc thay đổi từ từ đến gần lõm nơng rộng Gân – 10 chiếc, xếp dạng chân vịt, hệ gân phụ dạng mạng rõ Cụm hoa đực xim tán kép mọc nách lá, cuống cụm hoa dạng sợi nhỏ dài – 3,5 cm Đỉnh cuống cụm hoa có – cuống tán giả (xim tán) dài 0,6 – 0,8 cm Gốc cuống tán giả có bắc hình mác nhỏ dạng vạch Mỗi tán giả có – xim nhỏ Mỗi xim nhỏ có – hoa Hoa đực nhỏ, cuống ngắn 0,5 mm, có đài xếp vịng, đài vịng tronh hình thìa dài khoảng 1,5 mm, rộng khoảng 0,5 mm, cánh hoa hình quạt gần trịn, cong lõm đều, cao khoảng 0,8 – mm, rộng – 1,5 mm, phía gốc cánh hoa có tuyến Nhị đính thành cột ngắn, bao phấn dính liền thành đĩa, nứt ngang Cụm hoa gần dạng đầu có cuống dạng sợi nhỏ dài – 1,5 cm Đỉnh cuống cụm hoa có – xim nhỏ Ở gốc xim nhỏ có phiến bắc dạng gai nhỏ, mềm Mỗi xim nhỏ có hoa Hoa nhỏ, gần khơng cuống, có đài hình trứng ngược cao – 1,2 mm, rộng 0,5 – 0,7 mm Hai cánh hoa gần trịn, cong dạng vỏ hến, đường kính 1,5 mm Bầu hình trứng, đường kính – mm, núm nhụy có thùy dạng gai nhỏ mềm ngả phía ngồi Chùm nhỏ, Quả hạch hình trứng ngược, chín màu hồng Vỏ hình trứng ngược, dài 5,5 – 6,5 mm, rộng 5,5 mm Trên lưng có hai hàng vân ngang dạng trụ Hai đầu trụ tù tròn, tạo thành hàng vân hạt lưng vỏ Giá nỗn có lỗ Mùa hoa: tháng – Mùa quả: tháng – 2.3 Stephania pierrei Diels Ngọn có nhiều chấm màu tím hồng Lá có kích thước nhỏ tất lồi khác Hoa đực khơng có cánh hoa 2.4 Stephania hainanensis H S Lo et Y Tsoong Cành non cuống có dịch màu trắng vàng nhạt 2.5 Stephania cambodiana Gagnep Cuống cụm hoa cuống tán giả dài so với loài khác 2.6 Stephania dielsiana Y C Wu Nửa cuống phía đính vào phiến gân mặt sau có màu tím hay tím hồng 2.7 Stephania excentrica H S Lo Cuống dài, có đến 14 cm Giá nỗn có lỗ lệch bên 2.8 Stephania cepharantha Hay Giá nỗn khơng có lỗ 2.9 Stephania sinica Diels Giá nỗn khơng có lỗ 2.10 Stephania viridiflavens H S Lo et M Yang Lá có phiến tam giác, cuống dài phiến Phân bố, trồng hái chế biến Các lồi bình vơi nước ta phân bố rộng miền Bắc, Trung, Nam Thường gặp vùng núi đá vơi: Tun Quang, Hịa Bình, Cao Bằng, Lạng Sơn, Thái Nguyên, Phú Thọ, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Lâm Đồng, Bà Rịa – Vũng Tàu… Một số loài thương gặp vùng núi đất biển Stephania pierrei Diels, Stephania brachuandra Diels, Stephania hainanensis H S Lo et Y Tsoong Riêng loài Stephania pierrei Diels tập trung chủ yếu tỉnh ven biển Bình Định, Phú Yên, Ninh Thuận Hiện ta thu hái củ bình vôi chủ yếu từ nguồn mọc hoang Khi thu đem cạo vỏ nâu đen, thái lát mỏng đem phơi sấy khơ đem chiết lấy 1tetrahydropalmatin Có thể trồng hạt Thu hái chín, sấy lấy hạt đem gieo Ngồi ươm giống hạt lấy đoạn thân cắt phần đầu củ đem trồng Hình Củ bình vơi khơ II THÀNH PHẦN HĨA HỌC Trong củ bình vơi có alkaloid Các lồi bình vơi ta khai thác có alkaloid l – tetrahydropalmatin Hàm lượng alkaloid toàn phần l – tetrahydropalmatin (rotundin) thay đổi tùy theo loài vùng thu hái Theo Bùi Thị Hằng, hàm lượng l – tetrahydropalmatin đạt 3,55% loài Stephania brachuandra Diels (thu hái Hoàng Liên Sơn), 1,31% loài Stephania kwangsiensis H S Lo (thu hái Quảng Ninh), 0,72% loài Stephania hainanensis H S Lo et Y Tsoong (thu hái Thanh Hóa), 0,62% loài Stephania cambodiana Gagnep (thu hái Lâm Đồng), 0,29% loài Stephania cepharantha Hay (thu hái Hà Sơn Bình), 0,21% lồi Stephania pierrei Diels (thu hái Tây Nguyên) Theo Nguyễn Tiến Vững, Phạm Thanh Kỳ, lồi Stephania glabra (Roxb.) Miers thu hái Ninh Bình có 2,96% alkaloid tồn phần 0,59% l – tetrahydropalmatin; loài Stephania kuinanensis H S Lo et M Yang thu hái Lạng Sơn có 4,41% alkaloid tồn phần 3,06% l – tetrahydropalmatin Năm 1941, Bùi Đình Sang chiết từ củ bình vơi hỗn hợp alkaloid, chủ yếu l – tetrahydropalmatin gọi rotundin Năm 1964, Ngô Văn Thu chiết alkaloid khác từ củ bình vơi gọi tên alkaloid A Đến năm 1971, Nuhn Ngô Văn Thu xác định alkaloid A roemerin Năm 1992, Ngô Thị Tâm chiết cepharanthin từ lồi Stephania pierrei mọc Nghĩa Bình Nam 1997 – 1999, Nguyễn Tiến Vững, Phạm Thanh Kỳ phân lập l – tetrahydropalmatin, roemerin, palmatin từ loài Stephania glabra mọc Ninh Bình l – tetrahydropalmatin, stepharin từ củ loài Stephania kuinanensis mọc Lạng sơn; cycleanin từ lồi bình vơi thu hái Quảng Ninh Năm 1999, Nguyễn Thị Hoài An phân lập alkaloid từ củ bình vơi mọc Mộc Châu (Sơn La) 9,10 – hydroxy, 2,3 – dimethoxy tetrahydro – protoberberine, stepholidin, tetrahydrocolumbamin 10 Bước 1: alkaloid dược liệu thường tồn dạng: base muối Vì thế, kiềm hố giúp đưa tồn hoạt chất dạng base Sau dùng dung mơi CHCl để chiết toàn khỏi dược liệu Bước 2: dùng acid để đưa alkaloid dạng muối, tan phần nước, tách bỏ phần béo dầu không cần thiết Bước 3: dùng NH4OH đậm đặc đưa alkaloid base, tan dung môi không phân cực nên loại muối khoáng pha nước Phương pháp chiết xuất Routundin công nghiệp 2.1 Chiết xuất Routundin thô Chiết rotundin thô từ củ tươi: Xát nhỏ củ bình vơi gọt bỏ vỏ ngồi giã nhỏ, gói vào vải gạc đem ép lấy nước, thêm nước vào bã cho xâm xấp lại ép Làm - lần ép hết vị đắng không cho tủa với thuốc thử Mayer thơi Tập trung nước ép lại (nếu cịn bã lọc qua bơng trong) Dùng nước vơi để kiềm hố đến pH 9-10, rotundin thơ tủa xuống; gạn bỏ nước Lọc lấy tủa, rửa lại tủa nước máy Lấy tủa đem hong gió sấy nhẹ đến thật khơ 2.2 Quy trình tinh chế routundin thơ Routundin thơ cần tinh chế lại Quy trình tinh chế routundin - Chiết rotundin thơ cồn 90° bình Zaixenko hay Soxhlet khoảng (cho đến hết phản ứng alkaloid) Acid hoá dịch chiết HC1 đặc tới pH = 4, để nguội cho vào tủ lạnh, rotundin hydroclorid tủa xuống, kết tinh lại - lần Lọc lấy tinh thể, rửa - ml ether Sấy nhẹ cho khơ - Trong cơng nghiệp: ngưịi ta chiết rotundin thơ nhiều lần với dầu hoả nóng cách ngâm túi vải chứa bột rotundin thơ vào dầu hoả nóng đựng bình có vỏ Dầu hoả đun nóng nước nóng chạy lần vỏ bình Tiếp tháo dầu hoả nóng vào bình khác cho dung dịch acid loãng vào để tạo muối alkaloid, sau cho kết tinh lại rotundin tinh khiết (Hiện người ta thường chiết rotundin cồn 90°) V PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH: Định tính thuốc thử - Đối với thuốc thử chung: A Lấy g bột dược liệu cho vào bình nón có dung tích 200 ml, thấm ẩm dược liệu dung dịch amoniac N (TT), để n 30 phút Cho 23 vào bình nón 50 ml cloroform (TT), lắc – 10 phút, để yên giờ, lọc Lấy 30 ml dịch lọc cho vào bình gạn, thêm ml dung dịch acid sulfuric 10% (TT), lắc – phút, gạn lấy phần dịch chiết acid cho vào ống nghiệm:  Ống 1: Thêm giọt thuốc thử Mayer (TT), xuất tủa vàng nhạt  Ống 2: Thêm giọt thuốc thử Dragendorff (TT), xuất tủa đỏ cam  Ống 3: Thêm giọt thuốc thử Bouchardat (TT), xuất tủa nâu  Ống 4: Thêm giọt dung dịch acid picric(TT), xuất tủa vàng - Đối với thuốc thử đặc hiệu ta sử dụng: K2Cr2O7, K3Fe(CN)6 NaCl bão hoà  Các loại thuốc thử: - Thuốc thử Mayer: hỗn hợp clorua thủy ngân (1,36g) KI (5,00g) 100ml H2O - Thuốc thử Dragendorff: hỗn hợp Bi(NO3)3, tartaric acid KI - Thuốc thử Bouchardat: I-/ KI Phương pháp sắc ký lớp mỏng Sử dụng sắc ký mỏng TLC có thơng số sau: - Bản mỏng: Silica gel G (sắc ký hấp phụ) - Dung môi khai triển: Toluen- aceton- ethanol- amoniac (45: 45: 7: 3); CHCl3 – MeOH (9:1); CH3OH- NH4OH (100:1,5) - Dung dịch thử: Lấy g bột dược liệu chiết phần định tính trên, cách thủy dịch chiết đến khơ, cắn cịn lại để nguội, hòa tan ml ethanol 90% (TT) - Dung dịch đối chiếu: Hoà tan mg L-tetrahydro-palmatin ml ethanol 90% (TT) - Thuốc thử Dragendorff - Cách tiến hành: 24  Chấm riêng biệt lên mỏng 20 ml dung dịch Sau triển khai sắc ký, lấy mỏng ra, để khô nhiệt độ phòng  Phun thuốc thử Dragendorff (TT)  Trên sắc ký đồ dung dịch thử xuất nhiều vết, có vết có màu sắc giá trị Rf giống vết L-tetrahydropalmatin sắc ký đồ dung dịch đối chiếu VI ĐỊNH LƯỢNG ROTUNDIN Định hướng: Trước tiên ta thực tách chiết alkaloid từ Bình vơi Sau tiến hành định lượng alkaloid theo phương pháp cân định lượng alkaloid theo phương pháp acidbase sau thực HPLC phân tách Rotundin ethyl acetate Định lượng phương pháp cân: 1.1 Nguyên tắc chung Để định lượng alkaloid phương pháp cân, cần phải chiết alkaloid tinh khiết nghĩa loại hoàn toàn tạp chất kèm theo Do phương pháp tương đốỉ lâu người ta sử dụng không sử dụng phương pháp định lượng khác Phạm vi sử dụng alkaloid có tính base yếu, alkaloid không chuẩn độ phương pháp acid - base, số điện ly bé khơng có bước nhảy đường cong chuẩn độ nên không quan sát chuyển màu rõ rệt thị Ví dụ colchicin hạt tỏi độc, alkaloid có nhân purin cafein chè, hạt cà phê Ngồi ra, phương pháp cân cịn dùng trường hợp định lượng alkaloid chưa xác định rõ cấu trúc hoá học hỗn hợp nhiều alkaloid có phân tử lượng khác Khi định lượng, người ta phải chiết alkaloid tinh khiết dung mơi thích hợp, đem bốc dung môi, sấy cắn tới khối lượng không đổi đem cân Nếu hàm lượng alkaloid dược liệu rấ t thấp định lượng phương pháp cân trực tiếp khó xác, tạo dẫn chất có khối lượng phân tử lớn cách cho alkaloid tác dụng với thuốc thử tạo tủa acid silicovonframic, acid phosphovonframic, acid picrolonic Một hệ số xác định phương pháp thực nghiệm alcaloiđ nguyên chất cho phép tính hàm lượng alkaloid base dược liệu Ví dụ: Bertrand định lượng cafein, nicotin cách tạo tủa với acid silicovonframic Tủa tạo tương ứng với công thức 12WO 3.SiO2.2H2O.X.M.alc; rửa tủa, sấy khô cân; sau đem nung tủa thành tro lại hỗn hợp WO 3.SiO2 đem 25 cân Căn vào tính hệ số X=4 Bertrand lập thành công thức tủa để tính là: 12WO3.SiO2.2H2O.4M.alc 1.2 Các bước tiến hành: - Cân xác khoảng 5g bột Bình vơi cho vào bình nón nút mài 250ml, làm ẩm lượng vừa đủ NH4OH 10% 15 phút Cho vào bình 100ml CHCl 3, đun hồi lưu cách thủy 30 phút, lọc qua dung dịch CHCl Chiết tiếp cách đun hồi lưu cách thủy 15 phút với 50, 50 ml… CHCl dịch chiết khơng cịn phản ứng với thuốc thử Valse-Mayer - Gộp chung dịch lọc CHCl3 vào bình lắng gạn 250ml Chiết alkaloid HCl 2% (20, 10, 10 ml…) dịch HCl không cho phản ứng với thuốc thử Valse-Mayer (cách thử trên) - Gộp chung dịch chiết acid vào bình lắng gạn 250ml, kiềm hóa NH 4OHđđ pH 10, chiết alkaloid base CHCl (20, 10, 10 ml…) dịch CHCl3 khơng cịn phản ứng với thuốc thử Valse-Mayer (Cách thử trên) - Gộp dung dịch chiết CHCl3 vào bình lắng gạn 250ml, rửa dịch CHCl nước cất (10, 10ml) Gạn lớp CHCl vào becher khô 100ml làm khan bột natri sulfat khan - Gạn dịch chiết làm khan vào chén kết tinh hay becher 100ml khơ cân bì trước Rửa lớp natri sulfat clorofom (5ml x lần) gộp chung vào dịch CHCl3 Bốc dung môi bếp cách thủy cắn (trong tủ hút) sấy cắn 110oC khối lượng không đổi - Cân cắn alkaloid (P gam) tính hàm lượng alkaloid base tồn phần (A) có 100 gam mẫu theo công thức Với: a : khối lượng dược iệu đem định lượng (gam) h : độ ẩm mẫu định lượng Định lượng alkaloid phương pháp acid- base 2.1 Nguyên tắc chung Mặc dù alkaloid chiết xuất tinh chế định lượng phương pháp cân thường có sai số thừa tạp chất bị lôi theo lẫn với cắn alkaloid 26 Do định lượng alkaloid phươọg pháp acid-base dùng nhiều hơn, alkaloid họ Cà Muốn định lượng phương pháp alkaloid phải chiết dạng base Dung dịch alkaloid base phải có vẩn đục hay lẫn phần nhỏ nhũ dịch gây tượng hấp phụ chất kiềm làm cho kết định lượng sai số thừa Ngồi ra, có lẫn chất kiềm amoniac, amin chất béo chất màu ảnh hưởng tới kết định lượng phương pháp acid- base có dùng thị màu Nếu có amoniac amin gây sai số thừa, có lẫn chất màu chất béo làm cho chuẩn độ khó quan sát vùng chuyển màu thị Để loại amoniac amin người ta lợi dụng tính dễ bay Sau bốc dung mơi, cặn cịn lại cho thêm vài ml ether ethanol, cho bốc hết (nếu cần thu hồi dung mơi lần cất cần ý lấy bình khơng để dung mơi đọng rơi xuống) Chất béo nói chung loại trình tinh chế alkaloid cách lắc với acid lỗng, sau kiềm hố chiết dung môi hữu nhiều lần, người ta cho thêm ether dầu hoả vào chuẩn độ để ngăn cản ảnh hưởng chất béo Nếu dược liệu có nhiều chất béo thường loại chất béo cách chiết dược liệu với ether dầu hoả chiết xuất lấy alkaloid sau Các chất màu thường loại trình chuyển alkaloid từ dung môi sang dung môi khác thật cần thiết dùng chất hấp phụ màu Sau có dịch chiết alkaloid base, tiến hành định lượng cách lắc alkaloid dung môi hữu với lượng xác acid chuẩn độ (dư), sau định lượng acid thừa kiềm tương ứng, làm bốc dung môi hữu cơ, cắn alkaloid lại định lượng trực tiếp hay gián tiếp acid chuẩn độ Người ta thường dùng HC1 H 2SO4 có nồng độ 0,01 - ,1N để chuẩn độ, thị màu dùng định lượng alkaloid phần lớn methyl đỏ Vì theo lý thuyết thực tế pH hầu hết muối alkaloid có vùng chuyển màu thị (pH 4,2 - 6,3) Vài alkaloid (ví dụ hydrastin, narcotin, alkaloid vỏ lựu ) có điểm tương đương đưòng cong chuẩn độ khoảng pH 4, trường hợp người ta dùng methyl da cam làm thị màu Một số trưòng hợp dùng hỗn hợp thị để quan sát rõ vùng chuyển màu dùng thị màu (ví dụ định lượng alkaloid vỏ canhkina người ta dùng hỗn hợp methyl đỏ xanh methylen làm thị) 27 Khi tính kết quả, dược liệu có nhiều alkaloid mà chúng định lượng phép chuẩn độ tính theo hệ số khối lượng phân tử trung bình alkaloid có dược liệu, kết khơng xác tỉ lệ alkaloid thường khác Do dó người ta thưịng tính theo alkaloid dược liệu; ví dụ định lượng alkaloid tồn phần benladon tính theo hyoscyamin, ma hồng tính theo ephedrin Định lượng alkaloid mơi trường khan Những alcoid có tính base yếu chuẩn độ mơi trường dung dịch nước khơng xác Tuy vậy, hồ tan alkaloid vào dung môi nước, thường dùng acid acetic khan (gọi mơi trường khan) người ta định lượng alkaloid có tính base yếu Thường dùng acid percloric 0,1N để định lượng thị màu tím tinh thể Alkaloid + CH3COOH  Alkaloid H+ + (CH3COO)HClO4 + CH3COOH  (CH3COOH2)+ + ClO4Alkaloid.H+ + (CH3COO)- + HClO4 + CH3COOH  Alkaloid.H+ + (CH3COO)(CH3COOH2)+ + ClO42.2 28 + Các bước tiến hành - Cân xác khoảng 5g bột dược liệu cho vào bình nón 250ml, làm ẩm vừa đủ dung dịch NH4OH 10% chiết hồi lưu 80ml CHCl bếp cách thủy 30 phút Lọc dịch chiết vào bình lắng gạn 250 ml có sẵn 20 ml HCl 5% Chiết tiếp bã liệu (mỗi lần 50 ml CHCl 3, đun hồi lưu 15 phút) dịch chiết khơng cịn alkaloid Gộp chung dịch chiết với dịch chiết ban đầu - Chiết alkaloid dạng muối dung dịch HCl 5% (20, 10, 10 ml…) dịch HCl thu khơng cịn alkaloid Gộp chung dịch chiết acid vào bình lắng gạn 250 ml, lắc dung dịch với ether dầu hỏa (10ml × lần), loại bỏ lớp ether dầu hỏa - Kiềm hóa dịch HCl NH4OH 10% pH 11 chiết alkaloid base CHCl3 (20, 10, 10 ml…) dịch CHCl thu khơng cịn phản ứng alkaloid Gộp chung dịch CHCl3 vào bình lắng gạn rửa dịch chiết nước cất (3 lần × 10ml) Chuyển dịch chiết CHCl vào becher khô làm khan Na2SO4 khan - Gạn dịch CHCl3 khan vào becher 250ml Rửa lớp Na 2SO4 CHCl3 (5 ml × lần) gộp chung với dịch CHCl Bốc dung môi tới cắn bếp cách thủy (trong tủ hút) hòa tan cắn 20 ml (pipet xác) acid sulfuric 0,1N - Thêm giọt đỏ methyl (CT) định lượng alkaloid toàn phần dung dịch dung dịch NaOH 0,1 N có màu vàng - Tiến hành song song với mẫu trắng khơng có cắn alkaloid - ml dung dịch acid sulfuric 0,1 N tương ứng với 0,0712 g alkaloid tồn phần tính theo 1-tetrahydropalmatin (C21H26NO4 = 356) - Hàm lượng (%) alkaloid tồn phần dược liệu (A); tính theo 1tetrahydropalmatin khan; tính theo cơng thức: Với: n1: số ml NaOH 0,1N dùng cho mẫu trắng n2: số ml NaOH 0,1N dùng cho mẫu thử a: khối lượng dược liệu đem định lượng(gam) h: độ ẩm mẫu định lượng Tiến hành định lượng thực tế: - Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng - Pha động:  Dung dịch đệm pH 4,5 – aceton (70 : 30), điều chỉnh cần  Lọc qua màng lọc có cỡ lỗ 0,45 µm, lắc siêu âm - Dung dịch chuẩn:  Hoà tan L-tetrahydropalmatin chuẩn pha động để thu dung dịch có nồng độ khoảng 0,05 mg/ml - Dung dịch thử:  Cân xác khoảng 0,5 g bột dược liệu chuyển vào túi giấy lọc 29  Thấm ẩm 0,5 ml dung dịch amoniac N (TT), để yên 30 phút Chuyển túi giấy lọc vào bình Soxhlet dung tích 100 ml, thêm 30 ml cloroform (TT), chiết đến hết alkaloid Lấy dịch chiết cô cách thuỷ tới cắn, hòa tan cắn dung dịch acid sulfurric N (TT) (5 lần, lần 10 ml) Lọc qua giấy lọc vào bình gạn Kiềm hố dịch lọc amoniac đặc (TT) đến pH 10.Chiết cloroform (TT) lần, lần 10 ml Gộp dịch chiết cloroform, bốc cách thuỷ đến cắn khô Dùng pha động hồ tan cắn chuyển vào bình định mức 500 ml, thêm pha động đến vạch, lắc Lọc qua giấy lọc thường, bỏ 10 ml dịch lọc đầu Phần dịch lọc lại tiếp tục lọc lần qua giấy lọc có cỡ lỗ 0,45 µm dung dịch thử Điều kiện sắc ký:  Cột thép không gỉ (25 cm x mm) nhồi pha tĩnh C (5 mm) (Lichrosorb RP 18 thích hợp)  Detector quang phổ tử ngoại đặt bước sóng 260 nm  Tốc độ dịng: 1,5 ml/phút  Thể tích tiêm: 20 ml - Cách tiến hành: Tiêm riêng biệt dung dịch chuẩn, dung dịch thử Dựa vào diện tích (hay chiều cao) pic thu dung dịch thử, dung dịch chuẩn nồng độ L-tetrahydropalmatin (C21H25NO4) dung dịch chuẩn, tính hàm lượng L-tetrahydropalmatin (C21H25NO4) dược liệu Dược liệu phải chứa 0,4% (kl/kl) L-tetrahydropalmatin (C21H25NO4) tính theo dược liệu khơ kiệt Phương pháp đo quang: Phương pháp đo quang cần lượng nhỏ alkaloid, lại có độ nhạy có kết nhanh, đo phương pháp hay dùng để định lượng alkaloid Hầu hết alkaloid khơng có màu tiến hành định lượng phương pháp đo quang theo nguyên tắc: - Dựa vào phản ứng tạo màu alkaloid, dùng dung dịch có màu để định lượng 30 - Với alkaloid tạo thành dung dịch có màu để định lượng trực tiếp, người ta cho alkaloid tác dụng vói thuốc thử tạo tủa có màu, sau tách riêng tủa hồ tan dung mơi thích hợp sề dung dịch có màu để định lượng Ví dụ: Có thể định lượng alkaloid vỏ canhkina cách cho tác đụng với thuốc thử Reinecke để tạo tủa màu, lấy riêng tủa Reineckat alkaloid hoà tan aceton tạo dung dịch có màu để định lượng - Biến đổi alkaloid thành dẫn chất có màu Ví dụ biến đổi morphin thành nitrosomorphin có màu đỏ đậm mơi trường kiềm Hoặc dùng phản ứng giáng phân alkaloid thành phần nhỏ, lấy riêng phần cần thiết cho tác đụng với thuốc thử tạo dung dịch có màu để định lượng Ví dụ: physostigmin tác dụng với kiềm tạo thành eserolin, carbonat kiềm metylamin; lấy riêng metylamin cách cất kéo nước, sau cho tác dụng với thuốc thử ninhydrin tạo hợp chất có màu Định lượng phần metylamin, suy lượng physostigmin Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC Phương pháp HPLC có độ xác độ nhạy cao, có tính đặc hiệu, thực tương đối nhanh thuận tiện, áp dụng để định lượng alkaloid dược liệu phịng thí nghiệm có trang bị máy HPLC Để tiến hành định lượng alkaloid phương pháp HPLC cần phải: - Có alkaloid tinh khiết làm chất chuẩn - Xây dựng phương pháp chiết kiệt alkaloid dược liệu đáp ứng yêu cầu định lượng - Xây dựng chương trình sắc ký máy HPLC (pha tĩnh, pha động, detector, tốc độ dịng, thể tích tiêm, nhiệt độ phân tích) - Tính kết quả: Hàm lượng alkaloid cần định lượng tính dựa diện tích peak chất chuẩn chất thử thu sắc ký đồ theo công thức: X% ST mc Cc 100 Sc mT (1  b) ST: diện tích peak alkaloid cần định lượng thu sắc ký đồ dung dịch thử Sc: diện tích peak alkaloid chuẩn thu sắc ký đồ đung dịch chuẩn mc: lượng cân mẫu chuẩn (mg) 31 mT: lượng cân mẫu thử (mg) Cc: hàm lượng alkaloid chuẩn (%) b: độ ẩm dược liệu VII PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA ROEMERINE Nguyên liệu - S.aureus (Staphylococcus aureus) ATCC29213 mua từ Trung tâm giám sát kháng kháng sinh quốc gia Trung Quốc - Strain Mu50 (ATCC700699) mua từ MicroBiologics (Saint Cloud, MN, USA) - Strain LAC (USA300) cho Michael Otto (NIH) - MRSA (Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus) XJ75302 lấy từ phịng thí nghiệm lâm sàng Bệnh viện Xijing (Tây An, Trung Quốc) - Mười lăm chủng MRSA lấy đặc trưng từ đờm truyền nhiễm bệnh nhân bị bệnh nặng Bệnh viện Đa khoa Côn Minh Kiểm tra độ nhạy MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) xác định kỹ thuật vi lọc mơi trường tiêu chuẩn hóa với việc bắt đầu tiêm chủng 5×10 đơn vị hình thành quần thể vi khuẩn (khuẩn lạc), tức 5×105 (CFU)/mL theo khuyến nghị Viện Tiêu chuẩn Phịng thí nghiệm lâm sàng (CLSI) Các tác nhân thêm với nồng độ khoảng 0.25 –1024 μg/mL; giống chủng MRSA với khối lượng đối chứng Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) xác định cách mạ 100 μL mẫu thu từ giếng độ đục nhìn thấy thạch Mueller-Hinton Nồng độ thấp cho thấy tăng trưởng năm khuẩn lạc giống chủng agar (thạch trắng) lấy MBC Roemerine thêm vào mẫu nuôi cấy, mẫu thử nghiệm với nồng độ cuối 0, 8, 16, 32 64 μg/mL Các chủng nuôi cấy hệ thống Bioscreen C tự động (hệ thống Lab Helsinki, Phần Lan) sử dụng mơi trường ni cấy MH Thể tích làm việc giếng Bioscreen 300 μL với 150 μL nước 32 dùng MH 150 μL dung dịch thuốc Nhiệt độ kiểm soát đến 37°C mật độ quang huyền phù tế bào đo tự động 600nm 20 giờ, lần Các đường cong thời gian giết bốn chủng S.aureus xác định phương pháp nhỏ giọt vào kính (drop plate) Số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) tính từ số lượng khuẩn lạc mọc đĩa Các hợp chất có nồng độ khác thêm vào nuôi cấy tế bào Các phần mẫu mẫu thu thập 0, 3, 6, 12 24h, pha loãng cấy vào mơi trường thạch rắn Các đĩa sau ủ 48 37 ° C Kết Roemerine thể tác dụng diệt khuẩn chống lại tất chủng S.aureus thử nghiệm (cả hai chủng nhạy cảm với methicillin kháng methicillin) với MIC dao động từ 32 μg/mL đến 64 μg/mL (hình 1) Các MBCS roemerine chống S.aureus cao hai lần so với MIC (Hình 1) Trong hình 2, roemerine hoàn toàn ức chế tăng trưởng bốn chủng S.aureus nồng độ 32 64 μg/mL Đường cong giết cho thấy: 64 μg/mL roemerine làm giảm số lượng vi khuẩn từ gần 5×10 CFU/mL xuống nhỏ 20 CFU/mL vịng 24 Hình MIC roemerine kháng sinh môi trường nuôi cấy Mueller-Hinton 33 Hình Sự ức chế phụ thuộc vào nồng độ roemerine đến sinh trưởng bốn chủng S aureus VIII PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH ROUTUNDIN GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA Mơ hình trục quay Rotarod Nghiên cứu đánh giá tác dụng an thần Routundin tiến hành trục quay Rotarod, dựa mơ hình tác giả Shiotsuki H cộng Hình 10 Trục quay Rotarod Tiến hành: Chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên thành lô: 34 Lô (n=10): uống nước cất với lượng 0,2 ml / 10g thể trọng chuột Lô (n=10): Uống Routundin liều 10 mg/kg - Chuột uống thuốc thuốc thử ngày liên tiếp - Số liệu lấy vào thời điểm trước dùng thuốc; riêng ngày thứ sau uống thuốc 1h sau uống thuốc 3h - Đưa chuột vào phòng nghiên cứu 30 phút trước tiến hành thử nghiệm - Sau uống thuốc 1h 3h chuột theo giõi thời gian bám chuột trục quay Chỉ số đánh giá : Thời gian chuột trục quay thời điểm bắt đầu nghiên cứu, ngày thứ sau uống thuốc 1h 3h Hình 11 Sơ đồ nghiên cứu thời gian bám chuột trục quay Rotarod IX Ứng dụng Alkaloid hợp chất tổng hợp từ tự nhiên, phần lớn có dược tính cao nên chúng thường dùng để bào chế thuốc Trong đó, Bình vôi với hợp chất rotundin, roemerin, cepharanthin nghiên cứu sử dụng Hoạt chất rotundin dùng chữa suy nhược rối loạn tâm thần, loét tá tràng, roemerin có tác dụng gây ngủ nên Bình vơi dùng làm thuốc an thần, chữa nhức đầu, sốt nóng, đau dày (thuộc nhiệt), ho nhiều đờm, hen suyễn, khó thở Phối hợp với vị thuốc khác để trị ho lao, sốt rét, kiết lỵ, ngứa lở da, mụn nhọt Trong y học cổ truyền, nhân dân ta dùng Bình vôi thái lát, phơi khô ngâm rượu chữa ngủ, ho hen, sốt, lỵ, đau bụng Ngày uống -6 g dạng thuốc sắc tán bột ngâm rượu 40° với tỷ lệ phần bột phần rượu, uống - 15 ml rượu/ngày, thêm đưịng cho dễ uống Trong y học đại dùng chủ yếu dùng làm nguyên liệu chiết xuất lấy rotundin cepharanthin tuỳ theo lồi, sau bào chế thành dạng thích hợp 35 Hình 12 Viên Rotundin 30mg Rotundin dùng làm thuốc trấn kinh, an thần trường hợp: ngủ, trạng thái căng thẳng thần kinh, số trường hợp rối loạn tâm thần Liều dùng: 0,03 g - 0,10 g dạng viên rotundin hyđroclorid sulfat, viên 0,03 g Ngoài dạng viên 30 mg 60 mg rotundin cịn có dạng tiêm rotundin sulfat, ống ml (60 mg) làm thuốc giảm đau, an thần, gây ngủ điều trị loét dày hành tá tràng, đau dây thần kinh, ngủ lo âu, căng thẳng thần kinh, hen co thắt phế quản 36 X TÀI LIỆU THAM KHẢO: Nguyễn Văn Tâm (2019) Nghiên cứu độc tính, tác dụng an thần thực nghiệm điều trị ngủ không thực tổn lâm sàng cao lỏng dưỡng tâm an thần, Luận án Tiến sĩ, Học viện Y dược học cổ truyền Việt Nam Chiết tách hợp chất alkaloid bình vơi, Trường Đại học Cần Thơ https://xemtailieu.com/tai-lieu/tieu-luan-chiet-tach-cac-hop-chat-alkaloid-trong-cay-binhvoi-1244628.html Ngơ Đại Quang 1999 Tạp Chí cơng nghiệp hóa chất, NXB Vinachem Phan Đình Châu 1997 Cơ sở kỹ thuật tổng hợp Hóa dược, tài liệu giảng dạy sau Đại học, trường Đại học Dược Hà Nội Tạp chí dược học Bộ môn Công nghiệp Dược 2001 Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, tập I, trường ĐH Dược Hà Nội Nguyễn Kim Phi Phụng, Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên TPHCM Yin S, Rao G, Wang J, et al Roemerine Improves the Survival Rate of Septicemic BALB/c Mice by Increasing the Cell Membrane Permeability of Staphylococcus aureus PLoS One 2015;10(11):e0143863 Published 2015 Nov 25 doi:10.1371/journal.pone.0143863 37 ... 10 1. 2 Công thức cấu tạo: .10 1. 3 Tính chất vật lý 11 1. 4 Một số kết nghiên cứu hoạt tính sinh học .11 Roemerin 12 2 .1 Công thức phân tử: C18H17NO2... 19 97 Cơ sở kỹ thuật tổng hợp Hóa dược, tài liệu giảng dạy sau Đại học, trường Đại học Dược Hà Nội Tạp chí dược học Bộ mơn Cơng nghiệp Dược 20 01 Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, tập I, trường ĐH Dược. .. Cell Membrane Permeability of Staphylococcus aureus PLoS One 2 015 ;10 (11 ):e 014 3863 Published 2 015 Nov 25 doi :10 .13 71/ journal.pone. 014 3863 37