Đặc điểm di truyền của vi khuẩn neisseria meningitidis gây bệnh viêm màng não mô cầu tại một số tỉnh miền bắc việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH š²œ Trần Văn Lực ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA VI KHUẨN Neisseria meningitidis GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MÔ CẦU TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Nghệ An – 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH š²œ Trần Văn Lực ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA VI KHUẨN Neisseria meningitidis GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MÔ CẦU TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.10.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Giang An TS Nguyễn Minh Hường Nghệ An - 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi, số liệu kết nghiên cứu ghi luận văn trung thực, đồng tác giả cho phép sử dụng chưa công bố cơng trình khác Họ tên tác giả Trần Văn Lực ii Lời Cảm Ơn Luận văn phần kết đề tài “Nghiên cứu phân bố đặc điểm di truyền vi khuẩn Neisseria meningitidis gây bệnh viêm màng não mô cầu miền Bắc Việt Nam” tài trợ Quỹ Phát triển khoa học Công nghệ quốc gia Nafosted (Mã số: 106-NN.02-2015.66, Chủ nhiệm: TS Nguyễn Minh Hường) Hồn thành luận văn này, tơi bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Giang An - Phó viện Trưởng viện Sư phạm tự nhiên, Trường Đại học Vinh TS Nguyễn Minh Hường phịng Vi sinh phân tử - Viện Cơng nghệ Sinh học, thuộc viện Hàn lâm khoa học cơng nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn quý thầy giáo, cô giáo viện Sư phạm tự nhiên, Trường Đại học Vinh nhiệt tình giảng dạy có ý kiến đóng góp q báu cho đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học Trường Đại học Vinh tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu Tôi gửi lời cảm ơn PGS.TS Đồng Văn Quyền cán phịng Vi sinh vật học phân tử, Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam trực tiếp hướng dẫn, tạo điều kiện cho tơi q trình nghiên cứu, thực đề tài Xin cảm ơn đồng nghiệp, bạn bè người thân nhiệt tình động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Nghệ An, tháng năm 2017 Tác giả Trần Văn Lực iii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Bảng chữ viết tắt v Danh mục bảng biểu vi Danh mục hình vii MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Cấu trúc luận văn CHƯƠNG TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Vi khuẩn Neisseria meningitidis bệnh viêm não mô cầu 1.1.1 Đặc điểm sinh học vi khuẩn Neisseria meningitidis 1.1.2 Đại cương bệnh viêm não mô cầu 1.2 Sinh học phân tử vi khuẩn Neisseria meningitidis 1.2.1 Hệ gene vi khuẩn Neisseria meningitidis 1.2.2 Đặc điểm gene đích phát vi khuẩn Neisseria meningitidis 10 1.2.3 Kháng nguyên bề mặt vi khuẩn Neisseria meningitidis 12 1.3 Tình hình nghiên cứu Neisseria meningitidis bệnh viêm não mô cầu giới 16 1.4 Tình hình nghiên cứu Neisseria meningitidis bệnh viêm não mô cầu Việt Nam 19 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Vật liệu 21 2.1.1 Nguyên liệu 21 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 21 2.1.3 Dụng cụ, thiết bị 22 2.1.4 Các dung dịch dùng điện di gel agarose 22 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 22 2.3 Phương pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Xác định có mặt Neisseria meningitidis mẫu bệnh phẩm phương pháp PCR 22 2.3.2 Tách chiết DNA tổng số 23 2.3.3 Định type Neisseria meningitidis mẫu phương pháp PCR 23 2.3.4 Kiểm tra sản phẩm PCR điện di gel agarose 23 iv 2.3.5 Tinh sản phẩm PCR 24 2.3.6 Phân tích phát sinh chủng loại nguồn gốc tiến hố trình tự gene chủng Neisseria meningitidis 24 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25 3.1 Thu nhận mẫu chứa vi khuẩn Neisseria meningitidis số tỉnh miền Bắc Việt Nam 25 3.2 Xác định vi khuẩn Neisseria meningitidis phương pháp PCR 26 3.3 Định danh type huyết phương pháp PCR .29 3.4 Phân tích gene porA 19 chủng Neisseria meningitidis phân lập miền Bắc Việt Nam 31 3.5 Phân tích gene fHbp 19 chủng Neisseria meningitidis phân lập miền Bắc Việt Nam 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 v BẢNG CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt bp Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt Nam Base pair Cặp bazo cADN Complementary DNA ADN bổ sung DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic CbF Cerebrospinal fluid Dịch não tuỷ PCR CDS Polymerase Chain Reaction Coding sequence Phản ứng thay đổi chuỗi nucleotide Trình tự mã hố HGT Horizontal gene transfer Chuyển gen ngang LOS Lipo-oligosaccharide Glycolipid màng fHpb Factor H binding protein vi Mã hóa kháng nguyên gắn yếu tố H DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Tên bảng Nội dung Trang Bảng 1.1 Thông tin hệ gene ba chủng N meningitidis 10 Bảng 1.2 Số liệu điều tra viêm màng não số quốc gia Châu Á 18 Bảng 2.1 Danh sách mẫu bệnh phẩm sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi sử dụng phản ứng PCR 22 Trình tự cặp mồi sử dụng để định type huyết 19 chủng Bảng 2.3 Neisseria meningitidis vi khuẩn Neisseria meningitidis thu số tỉnh miền Bắc Việt Nam 23 Trình tự cặp mồi sử dụng để thu nhận gene fHbp 19 chủng vi Bảng 2.4 khuẩn Neisseria meningitidis thu số tỉnh miền Bắc Việt Nam 24 Bảng 3.1 Thông tin chủng vi khuẩn viêm não mô cầu - Neisseria meningitidis sử dụng đề tài 25 Bảng 3.2 Kết đo nanodrop 19 chủng Neisseria meningitidis thu số tỉnh miền Bắc Việt Nam 28 Bảng 3.3 Các chủng huyết thu phương pháp PCR mẫu 30 Trình tự cặp mồi sử dụng để thu nhận gene porA 19 chủng vi Bảng 3.4 khuẩn Neisseria meningitidis thu số tỉnh miền Bắc Việt Nam 32 Kết so sánh alelle gene porA 19 chủng nghiên cứu chủng giới 36 Danh sách so sánh phân tích trình tự nucleotide gene porA Bảng 3.6 mối quan hệ nguồn gốc tiến hóa 19 chủng nghiên cứu với chủng tương đồng giới 38 Danh sách so sánh phân tích trình tự nucleotide gene fHbp Bảng 3.7 mối quan hệ nguồn gốc tiến hóa 19 chủng nghiên cứu với chủng tương đồng giới 47 Bảng 3.5 Bảng 3.8 Kết so sánh trình tự nucleotide gene fHbp với chủng sản xuất làm vacxin giới vii 50 DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Nội dung Trang Hình 1.1 Hình ảnh tế bào nhuộm Gram N meningitidis từ dịch não tủy Hình 1.2 Hình 1.3 Sơ đồ chế vi khuẩn N meningitidis gây nhiễm trùng viêm màng não Cấu trúc bề mặt vi khuẩn Neisseria meningitidis cắt ngang Hình 1.4 Quy trình sản xuất vacxin hệ Hình 1.5 Hệ gene vi khuẩn Neisseria meningitidis chủng MC58 Hình 1.6 Đặc điểm gene mã hóa kháng nguyên N.meningitidis 11 Hình 1.7 Hình ảnh màng tế bào N meningitidis cắt ngang 12 Hình 1.8 Vị trí gene porA fHpb gen vi khuẩn Neisseria meningitidis 14 Hình 3.1 Ảnh chụp vi khuẩn Neisseria meningitidis ni cấy môi trường thạch máu 26 Hình 3.2 Kết điện di DNA tổng số số chủng 19 chủng nghiên cứu 27 Hình 3.3 Điện di PCR số chủng với mồi CtrA vi khuẩn Neisseria meningitidis thu số tỉnh miền Bắc Việt Nam 28 Hình 3.4 Điện di sản phẩm PCR định type số chủng với mồi synD vi khuẩn Neisseria meningitidis thu số tỉnh miền Bắc Việt Nam 29 Hình 3.5 Điện di sản phẩm PCR định type số chủng với mồi synE vi khuẩn Neisseria meningitidis thu số tỉnh miền Bắc Việt Nam 30 Hình 3.6 Kết thu nhận gene porA mồi đặc hiệu porA 16/19 chủng vi khuẩn Neisseria meningitidis phân lập miền Bắc Việt Nam 32 Hình 3.7 Giản đồ phần trình tự gene PorA chủng 14156 33 Hình 3.8 Một phần trình tự nucleotide gene porA 19 chủng Neisseria meningitidis phân lập miền Bắc Việt Nam 33 Hình 3.9 Kết so sánh phần trình tự nucleotide gene porA 19 chủng nghiên cứu 34 Mối quan hệ nguồn gốc chủng loại 19 chủng nghiên Hình 3.10 cứu thành phần nucleotide gene porA phần mềm Mega 7.0 35 Hình 3.11 So sánh trình tự gene porA chủng 17088 với chủng tương 37 viii đồng giới Hình 3.12 So sánh trình tự gene porA chủng 17084 với chủng tương đồng giới 37 Hình 3.13 Kết so sánh trình tự nucleotide gene porA 19 chủng phân lập Việt Nam 10 chủng giới 39 Hình 3.14 Cây phát sinh chủng loại 19 chủng nghiên cứu với 10 chủng giới đăng ký ngân hàng gene 40 Kết sản phẩm PCR thu nhận gene fHbp số chủng vi Hình 3.15 khuẩn Neisseria meningitidis thu số tỉnh miền Bắc 42 Việt Nam Hình 3.16 Một phần trình tự nucleotide gene fHbp 19 chủng Neisseria meningitidis phân lập miền Bắc Việt Nam 43 Hình 3.17 Kết so sánh phần trình tự nucleotide gene fHbp 19 chủng nghiên cứu 44 Mối quan hệ nguồn gốc chủng loại 19 chủng nghiên Hình 3.18 cứu thành phần nucleotide gene fHbp phần mềm 45 Mega 7.0 Hình 3.19 Hình 3.20 So sánh trình tự gene fHbp chủng 14196 với chủng tương đồng giới So sánh trình tự gene fHbp chủng 14155 với chủng tương đồng giới 46 46 Cây phát sinh chủng loại so sánh nucleotide gene fHbp 19 Hình 3.21 chủng nghiên cứu với 18 chủng giới đăng ký ngân hàng gen 49 Hình 3.22 Trình tự amino acid allele 51 Hình 3.23 Trình tự amino acid allele 19 51 Hình 3.24 Kết so sánh trình tự amino acid gene fHbp allele với chủng Neisseria meningitidis phân lập miền Bắc Việt Nam 52 Hình 3.25 Kết so sánh trình tự amino acid gene fHbp allele 19 với chủng Neisseria meningitidis phân lập miền Bắc Việt Nam 52 ix Hình 3.17 Kết so sánh phần trình tự nucleotide gene fHbp 19 chủng nghiên cứu Ghi chú: Sự sai khác trình tự nucleotide biểu thị ký hiệu nucleotide đó, khơng có sai khác biểu thị dấu(.) Để biết quan hệ nguồn gốc, phát sinh chủng loại 19 chủng nghiên cứu Chúng tiến hành xây dựng phát sinh chủng loại phần mềm hỗ trợ Mega7 với phương pháp kết nối liền kề NJ, sử dụng độ tin cậy 1000 bootstrap thu kết hình 3.12 Kết cho thấy tất 19 chủng phân thành nhánh + Nhánh bao gồm chủng 14196; 17084; 17090; 17088 + Nhánh bao gồm chủng 37C; 40C; 1237C; 1513; 1532; 14072; 14075; 14089; 14155; 16457; 16456; 16406; 16408; 16416; Ngoc + Các chủng nhánh có tỷ lệ tương đồng cao (85-100%) Điều cho thấy, chủng phân lập miền bắc Việt Nam có trình tự nucleotide gene fHbp quan hệ gần gũi với (hình 3.18) 44 14155-fHbp 14157-fHbp 99 1237C-fHbp 37C-fHbp 40C-fHbp 96 14156-fHpb 1513-fHbp 1532-fHbp 100 14075-fHbp 14072-fHbp 14089-fHbp 16416-fHbp ngoc-fHbp 98 16406-fHbp 85 16408-fHbp 14196 - fHbp 17084_fHbp 100 17088_fHbp 17090_fHbp 0.1 Hình 3.18 Mối quan hệ nguồn gốc chủng loại 19 chủng nghiên cứu thành phần nucleotide gene fHbp phần mềm Mega 7.0 Phân tích chủng loại dựa vào sai khác amino acid, kết cho thấy chủng có quan hệ gần gủi giống với kết so sánh trình tự nucleotide Điều cho thấy chúng khơng có khác quan hệ chủng loại 3.5.4 So sánh trình tự gene fHbp mối quan hệ nguồn gốc tiến hóa chủng phân lập Việt Nam chủng giới Để thấy mối quan hệ nguồn gốc tiến hóa 19 chủng, với 18 chủng có quan hệ gần gũi giới đăng ký ngân hàng gen Do so sánh 19 45 chủng phân lập Việt Nam có tương đồng cao, chọn đại diện hai nhánh chủng 14196 14155 để so sánh mức độ tương đồng với chủng giới Những chủng lựa chọn để so sánh, có độ phủ từ 97 - 100% mức độ tương đồng từ 99% (Hình 3.19 hình 3.20) Hình 3.19 So sánh trình tự gene fHbp chủng 14196 với chủng tương đồng giới Hình 3.20 So sánh trình tự gene fHbp chủng 14155 với chủng tương đồng giới Kết phân tích cho thấy 18 chủng cịn lại với chủng phân bố giới có mức độ tương đồng cao Các chủng với 19 Neisseria meningitidis giới sử dụng so sánh với chủng nghiên cứu thể (Bảng 3.7) 46 Bảng 3.7 Danh sách so sánh phân tích trình tự nucleotide gene fHbp mối quan hệ nguồn gốc tiến hóa 19 chủng nghiên cứu với chủng tương đồng giới STT Tên chuỗi gen Ký hiệu chủng Địa điểm NC Số hiệu Đăng ký WUE2121 Đức CP012394 Neisseria meningitidis strain WUE2121, complete genome Neisseria meningitidis strain M02 240629 factor H-binding protein (fHbp) gene, complete M02 240629 Anh JF916583 Neisseria meningitidis strain M01 242006 factor H-binding protein (fhbp) gene, complete M01 242006 Anh JF916582 Neisseria meningitidis strain M06 240136 factor H-binding protein (fhbp) gene, complete M06 240136 Anh JF916581 Neisseria meningitidis M01-240355, complete genome M01-240355 Italy CP002422 Neisseria meningitidis strain 360509 factor H binding protein and acetoin reductase genes, complete 360509 Trung Quốc JN968367 Neisseria meningitidis strain M25419, complete genome M25419 Mỹ CP016678 Neisseria meningitidis strain M07161, complete genome M07161 Mỹ CP016675 Neisseria meningitidis strain DE8555, complete genome Đức CP012393 10 Neisseria meningitidis strain NM3683, complete genome NM3683 Mỹ CP009421 11 Neisseria meningitidis strain NM3682, complete genome NM3682 Mỹ CP009420 12 Neisseria meningitidis serogroup C FAM18 complete genome FAM18 Anh AM421808 13 Neisseria meningitidis strain FDAARGOS_212, complete genome FDAARGO S_212 Mỹ CP020423 14 Neisseria meningitidis strain M22790 genome M22790 Mỹ CP016883 15 Neisseria meningitidis strain M24705, complete genome M24705 Mỹ CP016682 16 Neisseria meningitidis strain M22828, complete genome M22828 Mỹ CP016672 47 DE8555 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 Neisseria meningitidis strain M22822, complete genome Neisseria meningitidis strain M22804, complete genome Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis M22822 Mỹ CP016680 M22804 Mỹ CP016660 1237C 14156 1513 1532 Ngọc 37C 14155 14157 14072 16406 16408 16416 40C 14075 14089 14196 17084 17088 17090 Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Qua hình 3.21, cho thấy: Kết cho thấy 19 mẫu nghiên cứu có tỷ lệ đồng cao nucleotide (95 -100%) Các chủng Việt Nam có mức độ tương đồng cao trình tự nucleotide với chủng giới Sau so sánh chủng Neisseria meningitidis phân bố giới với chủng vi khuẩn phân bố Việt Nam, phân chia chủng thành hai phân nhóm lớn phát sinh chủng loại Nhóm thứ bao gồm tất chủng Việt Nam 13 chủng nước Anh, Italy, Đức, Trung Quốc số chủng Mỹ (CP016883; CP016678; CP016675) Nhóm thứ bao gồm chủng Mỹ với tỷ lệ tương đồng 100% Nhóm thứ lại tiếp tục chia thành phân nhóm nhỏ: Phân nhóm thứ gồm 19 chủng Việt Nam có tỷ lệ đồng nucleotide cao (91-99%), phân nhóm thứ hai gồm chủng nước Anh, Italy, Đức tỷ lệ đồng nucleotide thấp (28 - 52%), phân nhóm thứ gồm chủng Mỹ với tỷ lệ tương đồng 43% 48 Kết phân tích cho chúng tơi nhận định, chủng xuất miền Bắc Việt Nam có nguồn gốc từ nước giới có quan hệ gần gũi với chủng có mặt Anh, Italy, Đức, Trung Quốc số chủng Mỹ 37C-fHbp 40C-fHbp 99 1237C-fHbp 14156-fHpb 14157-fHbp 91 14155-fHbp 14072-fHbp 1513-fHbp 1532-fHbp 96 99 14075-fHbp 14089-fHbp ngoc-fHbp 16406-fHbp 94 16408-fHbp 99 16416-fHbp 14196 - fHbp 17084_fHbp 17088_fHbp 99 17090_fHbp JF916581 JF916582 52 JF916583 28 CP002422 JN968367 CP012394 CP016883 CP016678 CP016675 43 CP012393 CP009421 CP009420 AM421808 CP020423 CP016682 CP016680 100 CP016672 CP016660 Hình 3.21 Cây phát sinh chủng loại so sánh nucleotide gen fHbp 19 chủng nghiên cứu với 18 chủng giới đăng ký ngân hàng gen Ghi chú: Ký hiệu ( ) mẫu nghiên cứu 3.5.6 So sánh trình tự nucleotide trình tự dịch mã acid amin gene fHbp với chủng sản xuất làm vacxin giới Để đánh giá sơ đa dạng serotype/serosubtype biến đổi di truyền nhanh Neisseria meningitidis qua tái tổ hợp Chúng tơi tiến hành so sánh trình tự 49 nucleotide 19 chủng với chủng giới sử dụng để sản xuất vacxin qua kênh liệu PubMLST (https://pubmlst.org/neisseria/) Kết allele, peptide, norvatis variant gene fHbp thể bảng 3.8 Bảng 3.8 Kết so sánh trình tự nucleotide gene fHbp với chủng sản xuất làm vacxin giới STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Tên chủng 1237C 14156 1513 1532 Ngọc 37C 14155 14157 14072 16406 16408 16416 40C 14075 14089 14196 17084 17088 17090 Allele 17 17 Không Không Không 17 17 17 Không Không Không Không 17 Không Không 14 14 14 14 Gen fHbp Peptide Norvatis variant 19 2/3 19 2/3 Không Không Không Không Không Không 19 2/3 19 2/3 19 2/3 Không Không Không Không Không Không Không Không 19 2/3 Không Không Không Không 7 7 Qua bảng 3.11 cho thấy: - Các chủng 1237C; 14156; 37C; 14155; 14157; 40C allele 17; peptide 19 norvatis variant 2/3 - Các chủng 14196; 17084; 17088; 17090 allele 14; peptide norvatis variant - Các chủng 1513; 1532; Ngọc; 14072; 16406; 16408; 16416; 14075; 14089 chủng không giống với allele, peptide norvatis variant sử dụng làm vacxin Để tìm hiểu nguyên nhân sai khác 09 chủng 1513; 1532; Ngọc; 14072; 16406; 16408; 16416; 14075; 14089, tiến hành so sánh trình tự nucleotide 50 acid amin chủng với trình tự acid amin sử dụng để sản xuất vacxin norvatis variant 2/3 norvatis variant Chúng tiến hành khai thác liệu trang PubMLST (https://pubmlst.org/neisseria/) thu kết trình tự amino acid vacxin norvatis variant 2/3 vacxin norvatis variant Kết thu hình 3.22 3.23 Hình 3.22 Trình tự amino acid allele Hình 3.23 Trình tự amino acid allele 19 Sử dụng phần mềm BioEdit để so sánh trình tự amino acid chủng ta thu kết sau: 51 Hình 3.24 Kết so sánh trình tự amino acid gene fHbp allele với chủng Neisseria meningitidis phân lập miền Bắc Việt Nam Kết so sánh 157 amino acid allele ta thấy: - Các chủng 16416; 16408; 16406 lập thành nhóm có sai khác 57/157 amino acid - Các chủng 14089; 14075; 14072; 1532; 1513 lập thành nhóm có sai khác 147/157 amino acid - Chủng Ngọc có sai khác 149/157 amino acid Như vậy, với kết phân tích sử dụng protein loại vacxin norvatis variant allele khơng đặc hiệu cho chủng 1513; 1532; Ngọc; 14072; 16406; 16408; 16416; 14075; 14089 phân bố Việt Nam 52 Hình 3.25 Kết so sánh trình tự amino acid gene fHbp allele 19 với chủng Neisseria meningitidis phân lập miền Bắc Việt Nam Kết so sánh 154 amino acid allele 19 cho thấy: - Các chủng 1513; 1532; 14072; 14075; 14089, lập thành nhóm có sai khác 139/157 amino acid - Các chủng 16408; Ngọc, lập thành nhóm có sai khác 138/157 amino acid - Chủng 16408;16406 lập thành nhóm có sai khác 52/157 amino acid Như vậy, sử dụng vacxin norvatis variant 2/3 allele 19 không đặc hiệu cho chủng 1513; 1532; Ngọc; 14072; 16406; 16408; 16416; 14075; 14089 phân bố Việt Nam 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã thu nhận 13 chủng 14072; 16406; 16408; 16416; 14075; 14089; 14196; 17084; 17088; 17090; 1513; 1532; 37C; Ngọc thuộc type B Bốn chủng 1237C; 14155; 14157; 40C thuộc type C Riêng chủng 14156 chưa phân biệt type huyết B hay C Trình tự nucleotide amino acid dịch mã gene porA vi khuẩn Neisseria meningitidis phân bố Việt Nam có quan hệ gần gủi với nhau, có tỷ lệ tương đồng cao (85-100%) Trong đó, có 14 chủng quan hệ gần gủi với chủng phân bố Anh; Ukaraina; Bazil chủng có quan hệ gần gủi với chủng nước Trung Quốc; Mỹ; Đức Trình tự nucleotide amino acid dịch mã gene fHbp 19 chủng vi khuẩn Neisseria meningitidis phân bố Việt Nam tính tương đồng cao (91-99%) Các chủng nghiên cứu này, lập thành nhóm phát sinh chủng loại chủng có quan hệ gần gũi với chủng có mặt Anh, Italy, Đức, Trung Quốc Mỹ Chủng vi khuẩn Neisseria meningitides phân bố Việt Nam có đa dạng biến đổi nhanh mặt di truyền, thể qua so sánh trình tự nucleotide dịch mã acid amin gene fHbp vi khuẩn lưu hành giới sử dụng sản xuất vacxin với vi khuẩn phân lập Việt Nam Trong đó, có chủng trùng trình tự vị trí allele thứ 17, peptide thứ 19 norvatis variant 2/3 (đó 1237C; 14156; 37C; 14155; 14157; 40C), có chủng (là 14196; 17084; 17088; 17090) trùng trình tự vị trí allele thứ 14; peptide thứ norvatis variant 3, lại 09 chủng (là 1513; 1532; Ngọc; 14072; 16406; 16408; 16416; 14075; 14089) có trình tự khơng giống với allele, peptide norvatis variant sử dụng làm vacxin giới Kiến nghị Tiếp tục thu thập chủng vi khẩn N.meningitidis phân bố vùng khác Việt Nam để phân tích đặc điểm di truyền mang tính đại diện cho di truyền chủng vi khuẩn Việt Nam Tiếp tục nghiên cứu biến đổi sinh học phân tử gene porB, fetA,…,các gene mã hoá cho kháng nguyên bề mặt gene quy định độc tố để có kết xác việc sử dụng vacxin nước cho Việt Nam 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Vũ Thị Xuân Thu, 2015, Nghiên cứu đặc điểm sinh học tính kháng kháng sinh Neisseria Meningitidis ổ dịch lưu hành quân đội, ĐH Quốc gia Hà Nội Tài liệu tiếng Anh [2] Borrow, R., H Claus, U Chaudhry, M Guiver, E B Kaczmarski, M Frosch, and A J Fox (1998), “siaD PCR ELISA for confirmation and identification of serogroup Y and W135 meningococcal infections”, FEMS Microbiology Letters 159, pp 209-214 [3] Borel, T., A M Rose, M Guillerm, F Sidikou, S Gerstl, A Djibo, N Nathan, S Chanteau, and P J Guerin (2006), “High sensitivity and specificity of the Pastorex latex agglutination test for Neisseria meningitidis serogroup A during a clinical trial in Niger”, Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 100, pp 964-969 [4] Bustin, S A (2004), “The PCR Revolution Basic technologies and Applications”, Cambridge University Press [5] Claus, H., M C Maiden, R Maag, M Frosch, and U Vogel (2002), “Many carried meningococci lack the genes required for capsule synthesis and transport”, Microbiology 148, pp 1813-1819 [6] Csako, G (2006) “Present and future of rapid and/or high-throughput methods for nucleic acid testing”, Clinica Chimica Acta 363, pp 6-31 [7] Corless, C E., M Guiver, R Borrow, V Edwards-Jones, A J Fox, and E B Kaczmarski (2001), “Simultaneous detection of Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, and Streptococcus pneumoniae in suspected cases of meningitis and septicemia using real-time PCR”, Journal of Clinical Microbiology 39, pp 15531558 [8] Darling A.C., Mau B., Blattner F.R., Perna N.T Mauve: multiple alignment of conserved genomic sequence with rearrangements Genome Res 2004;14(7):1394– 1403 [9] Dempsey J.A., Wallace A.B., Cannon J.G The physical map of the chromosome of a serogroup A strain of Neisseria meningitidis shows complex rearrangements relative to the chromosomes of the two mapped strains of the closely related species N gonorrhoeae J Bacteriol 1995;177(22):6390–6400 [10] Dolan-Livengood, J M., Y K Miller, L E Martin, R Urwin, and D S Stephens (2003), “Genetic basis for nongroupable Neisseria meningitidis” Journal of Infectious Diseases 187, pp 1616-1628 [11] Dolan-Livengood, J M., Y K Miller, L E Martin, R Urwin, and D S Stephens (2003), “Genetic basis for nongroupable Neisseria meningitidis” Journal of Infectious Diseases 187, pp 1616-1628 [12] Edwards, U., A Muller, S Hammerschmidt, R Gerardy-Schahn, and M Frosch (1994), “Molecular analysis of the biosynthesis pathway of the alpha-2,8 polysialic 55 acid capsule by Neisseria meningitidis serogroup B”, Molecular Microbiology 14, pp.141-149 [13] Frasch CE, Z W., Poolman JT (1985) "Serotype Antigens of Neisseria meningitidis and a Proposed Scheme for Designation of Serotypes." Rev Infect Dis 7: 504-510 [14] Frosch, M., and A Muller (1993), “Phospholipid substitution of capsular polysaccharides and mechanisms of capsule formation in Neisseria meningitidis” Molecular Microbiology 8, pp 483-493 [15] Gaher M., Einsiedler K., Crass T., Bautsch W.A physical and genetic map of Neisseria meningitidis B1940 Mol Microbiol 1996;19(2):249–259 [16] Giuliani, M M., et al 2006 A universal vaccine for serogroup B meningo-coccus Proc Natl Acad Sci U S A 103:10834–10839 [17] Granoff DM, F I., Borrow R (2004) Meningococcal vaccines O W Plotkin SA Philadelphia, Saunders: 959–987 [18] Harrison, L H., S I Pelton, et al (2011) "The Global Meningococcal Initiative: recommendations for reducing the global burden of meningococcal disease." Vaccine 29(18): 3363-3371 [19] Harrison, L H., C L Trotter, et al (2009) "Global epidemiology of meningococcal disease." Vaccine 27 Suppl 2: B51-63 [20] Hoa, N T., T S Diep, et al (1998) "Community-acquired septicaemia in southern Viet Nam: the importance of multidrug-resistant Salmonella typhi." Trans R Soc Trop Med Hyg 92(5): 503-508 [21] Jafri, R Z., A Ali, et al (2013) "Global epidemiology of invasive meningococcal disease." Popul Health Metr 11(1): 17 [22] Kim, S A., D W Kim, et al (2012) "An expanded age range for meningococcal meningitis: molecular diagnostic evidence from population-based surveillance in Asia." BMC Infect Dis 12: 310 [23] Lee, L G., C R Connell, and W Bloch (1993), “Allelic discrimination by nicktranslation PCR with fluorogenic probes”, Nucleic Acids Research 21, pp 3761-3766 [24] Lewis, L A., et al 2010 The meningococcal vaccine candidate neisserial surface protein A (NspA) binds to factor H and enhances meningococcal resistance to complement PLoS Pathog 6:e1001027 [25] Liu Y., Harrison P.M., Kunin V., Gerstein M Comprehensive analysis of pseudogenes in prokaryotes: widespread gene decay and failure of putative horizontally transferred genes Genome Biol 2004;5(9):R64 [26] Masignani, V., et al 2003 Vaccination against Neisseria meningitidis using three variants of the lipoprotein GNA1870 J Exp Med 197:789–799 [27] Masson, L., and B E Holbein (1983), “Physiology of sialic acid capsular polysaccharide synthesis in serogroup B Neisseria meningitidis”, Journal of Bacteriology 154, pp 728-736 56 [28] Messmer, T O., J S Sampson, A Stinson, B Wong, G M Carlone, and R R Facklam (2004), “Comparison of four polymerase chain reaction assays for specificity in the identification of Streptococcus pneumoniae”, Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 49, pp 249-254 [29] Mothershed, E A., C T Sacchi, A M Whitney, G A Barnett, G W Ajello, S Schmink, L W Mayer, M Phelan, T H Taylor, Jr., S A Bernhardt, N E Rosenstein, and T Popovic (2004), “Use of real-time PCR to resolve slide agglutination discrepancies in serogroup identification of Neisseria meningitidis” Journal of Clinical Microbiology 42, pp 320-328 [30] Moran N.A., Plague G.R Genomic changes following host restriction in bacteria Curr Opin Genet Dev.2004;14(6):627–633 [31] Murphy, E., et al 2009 Sequence diversity of the factor H binding protein vaccine candidate in epidemiologically relevant strains of serogroup B Neis-seria meningitidis J Infect Dis 200:379–389 [32] Neisseria Sequence Typing Home Page [http://pubmlst.org/neisseria/ PorA/] Accessed 15 April 2014] [33] Parkhill J., Sebaihia M., Preston A., Murphy L.D., Thomson N., Harris D.E Comparative analysis of the genome sequences of Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis and Bordetella bronchiseptica Nat Genet 2003;35(1):32–40 [34] Rouphael, N G and D S Stephens (2012) "Neisseria meningitidis: biology, microbiology, and epidemiology." Methods Mol Biol 799: 1-20 [35] Sadler, F., A Fox, K Neal, M Dawson, K Cartwright, and R Borrow (2003), “Genetic analysis of capsular status of meningococcal carrier isolates”, Epidemiology and Infection 130, pp 59-70 [36] Schoen C., Blom J., Claus H., Schramm-Glück A., Brandt P., Müller T Wholegenome comparison of disease and carriage strains provides insights into virulence evolution in Neisseria meningitides Proc Natl Acad Sci USA 2008;105(9):3473– 3478 [37] S.LMartina, et al 2000 Effect of sequence variation in meningococcal PorA outer membrane protein on the effectiveness of a hexavalent PorA outer membrane vesicle vaccine Pages 2476-2481 [38] Swartley, J S., J H Ahn, L J Liu, C M Kahler, and D S Stephens (1996), “Expression of sialic acid and polysialic acid in serogroup B Neisseria meningitidis: divergent transcription of biosynthesis and transport operons through a common promoter region”, Journal of Bacteriology 178, pp 4052-4059 [39] Tettelin H., Riley D., Cattuto C., Medini D Comparative genomics: the bacterial pangenome Curr Opin Microbiol 2008;11(5):472–477 [40] Tettelin H., Masignani V Cieslewicz M.J.,Donati C.,Medini D.,Ward N.L Genome analysis of multiple pathogenic isolates of Streptococcus agalactiae: implications for the microbial “pan-genome” Proc Natl Acad Sci USA 2005;102(39):13950–13955 57 [41] Tyski S, G W., Dulny G, Berthelsen L, Lind I (2001) "Phenotypical and genotypical characterization of Neisseria meningitidiscarrier strains isolated from Polish recruits in 1998." Eur J Clin Microbiol Infect Dis 20: 350-353 [42] Vyse, A., J M Wolter, et al (2011) "Meningococcal disease in Asia: an underrecognized public health burden." Epidemiol Infect 139(7): 967-985 [43] Yang, Y H., S G Fu, et al (1993) "Abuse of antibiotics in China and its potential interference in determining the etiology of pediatric bacterial diseases." Pediatr Infect Dis J 12(12): 986-988 58 ... X52996 Vi? ??t Nam Nghiên cứu Vi? ??t Nam Nghiên cứu Vi? ??t Nam Nghiên cứu Vi? ??t Nam Nghiên cứu Vi? ??t Nam Nghiên cứu Vi? ??t Nam Nghiên cứu Vi? ??t Nam Nghiên cứu Vi? ??t Nam Nghiên cứu Vi? ??t Nam Nghiên cứu Vi? ??t Nam. .. HỌC VINH š²œ Trần Văn Lực ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA VI KHUẨN Neisseria meningitidis GÂY BỆNH VI? ?M MÀNG NÃO MÔ CẦU TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VI? ??T NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: ... phịng bệnh vi? ?m màng não mơ cầu N meningitidis gây Vi? ??t Nam Nội dung nghiên cứu + Thu nhận mẫu chứa vi khuẩn Neisseria meningitidis số tỉnh miền Bắc, Vi? ??t Nam + Định danh type huyết vi khuẩn Neisseria