Nhap

W.J du Toit, I.S Pretorius SỰ TRAO ĐỔI CHẤT VÀ CHẤT CHUYỂN HÓA ĐƯC TẠO THÀNH CÓ THỂ ẢNH HƯỞNG ĐẾN CHẤT LƯNG VANG Sự oxi hóa ethanol tạo thành acetaldehyde acid acetic Sự oxi hóa ethanol thành acid acetic đặc điểm tiếng vi khuẩn acetic Do tầm quan trọng kinh tế trình việc sản xuất giấm, trình sinh hóa liên quan nghiên cứu rộng rãi (Drysdale and Fleet, 1988) enzym đóng vai trò định trình oxi hóa, cụ thể alcohol dehydrogenase liên kết màng aldehyde dehydrogenase liên kết màng, có tâm hoạt động (active sites) mặt màng tế bào chaát (Adachi et al., 1978, 1980; Saeki et al., 1997b) Những enzym dehydrogenase chứa quinoprotein flavoprotein mà chúng có pyrroloquinoline quinone flavin adenine dinucleotide có liên kết cộng hóa trị nhóm mang (prosthetic groups), tương ứng Alcohol dehydrogenase oxi hóa ethanol thành acetaldehyde, bị oxi hóa tiếp thành acetate aldehyde dehydrogenase Matsushita et al., 1994; Saeki et al., 1997b) Alcohol dehydrogenase chứa subunit, chúng bao gồm subunit dehydrogenase cytocrome-c mà cần thiết cho hoạt động enzym Loại alcohol dehydrogenase thành phần, chứa dehydrogenase 72-78 kDa, cytochrome-c 48 kDa subunit 20 kDa, tìm thấy A.aceti A pasterianus Loại alcohol dehydrogenase thành phần tìm thấy Acetobacter polyogenes Hai subunit lớn đóng vai trò vận chuyển electron nội phân tử từ alcohol dehydrogenase tới ubiquinone, xa tới oxidase cuối suốt trình oxi hóa ethanol Subunit nhỏ giúp subunit có chức (functional subunits) việc kết hợp chúng với màng (Kondo and Horinouchi, 1997b; Saeki et al., 1997b) Alcohol dehydrogenase liên kết màng (membrane-bound alcohol dehydrogenase) có pyrroloquinoline cofactor độc lập với NAD(P)+, alcohol dehydrogenase phụ thuộc NAD(P)+ tế bào chất xác định Cái sau (alcohol dehydrogenase phụ thuộc NAD(P)+ - Út), nhiên, có tính đặc hiệu (specific activity) thấp nhiều so với membranebound alcohol dehydrogenase có pH tối ưu cao vào khoảng 6-8, mà điều làm hạn chế đóng góp vào trình oxi hóa ethanol (Adachi et al., 1978; Takemura et al., 1993; Matsushita et al., 1994) Enzym độc lập với NADP(+) có pH tối ưu khoàng 4, enzym hoạt động tế bào nguyên hay chất đồng chất tế bào (cell homogenate) pH Khi enzym bị lấy khỏi màng tế bào, người ta không quan sát thấy có hoạt động mức pH thấp (Adachi et al., 1978; Nomura et al., 1997) Hoạt động alcohol dehydrogenas Acetobacter ổn định điều kiện acetic so với hoạt động Gluconobacter, giải thích cho tạo thành acetic acid cao Acetobacter (Matsushita et al., 1994) Tuy nhiên, chuỗi lồng vào (an insertion sequence) vô hoạt khả oxi hóa ethanol A pasterianus, mà điều giải thích cho bất lực tế bào đột biến có nguồn gốc tự phát oxi hóa ethanol (Kondo and Horunouchi, 1997a) Tuy nhiên, rõ ràng enzym hoạt động môi trường mà rượu vang áp đặt lên chúng Những enzym khác chất trung gian (intermediates) có liên quan việc sử dụng glucose ethanol thể Hình (Saeki et al., 1997a) Enzym lại có liên quan đến oxi hóa ethanol thành acetic acid aldehyde dehydrogenase Enzym độc lập với NAD(P) nằm màng tế bào chất có pH tối ưu Thêm vào đó, xúc tác oxi hóa acetaldehyde thành acetate giá trị pH thấp (Adachi et al., 1980) Saeki et al (1997b) tìm thấy trình định đặc điểm vi khuẩn acetic chịu nhiệt có khác bền nhiệt alcohol dehydrogenase aldehyde dehydrogenase từ chủng chịu nhiệt ưa ấm Enzym sau, nhiên, bền nhiệt alcohol dehydrogenase Các aldehyde dehydrogenase nhạy cảm với nồng độ rượu tìm thấy vang alcohol dehydrogenase điều dẫn đến tích tụ acetaldehyde vang việc tiêu phí vào tạo thành acid acetic (Muraoka et al., 1983) Drysdale Fleet (1989a) tìm thấy nồng độ acetaldehyde tăng lên vang với nồng độ oxi hòa tan thấp mà vi khuẩn acetic phát triển Chúng đòi hỏi điều kiện mà dẫn đến hoạt độ alcohol dehydrogenase cao so với hoạt độ aldehyde dehydrogenase, dẫn đến nồng độ acetaldehyde cao có nồng độ oxi thấp Vi khuẩn acetic, đó, tạo thành acetaldehyde nồng độ lên đến 250 mg/l, mà giá trị vượt giá trị ngưỡng cảm giác chấp nhận (100-125 mg/l) Acetaldehyde tạo cho vang thính chất oxi hóa mức độ cao không mong muốn, đặc biệt loại vang bàn ăn tinh tế Acetaldehyde kết hợp với SO2 hiệu quả, làm cho vô hiệu vi sinh vật (mất hiệu chống lại VSV, SO2 chất sát trùng – Út) Vi khuẩn acetic có khả tạo acid acetic với nồng độ cao Tính chất làm cho chúng quan trọng công nghiệp giấm Vài chủng dễ dàng tạo 50 g/l tới 150 g/l acid acetic trình lên men giấm (Sievers et al., 1997; Lu et al., 1999) Những nồng độ cao dường không tạo vang trình thực tế làm vang bình thường thiếu oxi, không nghi ngờ thật vi khuẩn rõ ràng làm tăng lên nồng độ acid acetic vang, mà điều dẫn đến hư hỏng Acid acetic xem có hại cho chất lượng vang nồng độ có phạm vi từ 0.7-1.2 g/l cao hơn, tùy vào loại vang, (sự gây hại – Út) thấy chí nồng độ thấp (Drysdale and Fleet, 1988) Trong khảo sát 7311 chai vang Australia, Eglington Henschke (1999) thấy tỷ lệ cao vang (lên tới 33% vang đỏ kiểm tra) có độ chua bay (volatile acidity) với mức độ làm cho nhà sản xuất vang phải lo ngại Một gia tăng nhỏ nồng độ acid acetic (10-50 mg/l) A.aceti A.pasteurianus báo cáo, G oxydans làm tăng nồng độ 1.64 g/l (Drysdale and Fleet, 1989b) Sự gia tăng độ chua bay chủng vi khuẩn acetic Nam Mỹ nước ép nho sâu sắc trường hợp loài Acetobacter, đặc biệt A.pasterianusi Gl hansenii, với loài sau tạo thành tới g/l ngày Chủng G oxydans kiểm tra tạo độ acid bay (< 0.2 g/l) (Du Toit, 2000) Sự gia tăng nồng độ acid acetic vang bão hòa gaz (fully aerated) mức 1.28 3.75 g/l sau phát triển A aceti A pasteurianus, với loài sau loài tạo acid acetic mạnh Sự gia tăng (nồng độ acid acetic – Út) tương quan với phát triển yếu vi khuẩn vang không bão hòa gaz, nhấn mạnh vai trò quan trọng oxi trình (Drysdale and Fleet, 1989a) Trong điều tra để xác định vi khuẩn acetic tạo phần lớn acid acetic vang, Kosebalan Ozilgen (1992) tìm chủng Acetobacter tạo phần lớn acid acetic pha cân pha suy vong (stationary and death phases), không tạo acid phát triển hoạt động (active growth) Sự xuất mở rộng chúng vang dẫn đến gia tăng nồng độ acid acetic hư hỏng có liên quan tới số tế bào vi khuẩn đếm Những tác giả đề cập công nhận vang bị hư vi khuẩn acetic cứu khỏi hư cách lấy vi khuẩn trước pha suy vong chúng Sự tạo thành độ chua bay suốt phát triển vi khuẩn acetic nước ép nho thiết lập nhiều acid acetic tạo pha cân (Du Toit, 2000) Sự tự phân (autolysis) vi khuẩn sau tế bào chết giải phóng nhiều acid vào vang Joyeus et al (1984a), nhiên, tìm thấy gia tăng nồng độ acid acetic đáng kể (significant) phát triển vi khuẩn vang Lu et al (1999) tìm thấy chủng Acetobacter chịu nhiệt oxi hóa ethanol thành acid acetic cách đặn suốt pha phát triển logarite (exponential growth phase) Sự tạo thành acid acetic, sau đó, đạt đến mức độ cao pha cân bằng, phần lớn acid acetic tạo pha pháttriển hoạt động (active growth phase) Vì vi khuẩn sống sót cuối trình lên men tăng sau tiếp xúc với không khí trình chiết rượu (racking), bơm (pumping over), v.v…, nên dường có tể chúng làm tăng độ chua bay nồng độ acid acetic vang trình tàng trữ (storage) làm chín (maturation) xa Những lượng nhỏ acid acetic tạo thành vi khuẩn acetic hay chí VSV khác, nấm men hay acid lactic làm tăng phát triển vi khuẩn ethanol, tìm Nanba et al (1984) Các chủng Acetobacter oxi hóa acid acetic xa thành CO2 nước thông qua chu trình tricarboxylic acid (De ley et al., 1984; Drysdale and Fleet, 1989b) Các chủng Gluconobacter làm điều này, kết chu trình tricarboxylic acid không hoạt động (nonfunctional) Điều enzym chu trình này, a-ketoglutarate dehydrogenase succinate dehydrogenase, không hoạt động (Greenfield and Claus, 1972) Sự khác khả oxi hóa acid acetic giống đặc điểm quan trọng để phân biệt chúng Quá trình oxi hóa không mong muốn công nghệ sản xuất giấm mát acid acetic Enzym acetyl-CoA synthethase (enzym tổng hợp acetyl-CoA – Út) chịu trách nhiệm cho việc tạo thành acetyl-CoA từ acid acetic AcetylCoA vào chu trình tricarboxylic acid để bị chuyển thành chất trung gian (intermediates) chu trình này, bị chuyển hóa xa thông qua chu trình glycoxylate (Hình 2; Saeki et al., 1997a) Sự gia tăng hoạt tính acetyl-CoA synthethase, isocitrate lyase malate synthethase xảy có maët acid acetic (Saeki et al., 1997a) Joyeux et al (1984b) tìm thấy chủng Acetobacter tạo lượng nhỏ acid acetic nước nho ép trước lên men rượu (must), G oxydans tạo tới 0.92 g/l acid loại nước nho ép Họ công nhận điều phân hủy (break down) acid acetic chủng Acetobacter Tuy nhiên, dường vi khuẩn acetic (unlikely) chuyển hóa acid acetic điều kiện sản xuất vang bình thường, vi khuẩn sử dụng acid acetic tất nguồn carbon thay khác, ethanol glucose, hết hoàn toàn (Saeki et al., 1997a) Acid acetic ức chế vi khuẩn acetic, VSV nhìn chung chịu (resistant) hiệu ứng tốt nhiều so với VSV khác có liên quan đến trình làm rượu vang Sức chịu đựng phụ thuộc vào chủng, ethanol hiệp lực với acid acetic ức chế vi khuẩn (Nanba et al., 1984) Enzym citrate synthase đóng vai trò then chốt sức chịu đựng này, khử độc acid acetic (detoxicates acetic acid) cách kết hợp (incorporation) vào chu trình tricarboxylic hay glyoxylate Citrate synthethase cung cấp lượng lớn ATP cần thiết để vượt qua hiệu ứng độc (toxic effect) acid (Fukaya et al., 1990; Sievers et al., 1997) Menzel vaø Gottschalk (1985) báo cáo chủng Acetobacter hạ thấp pH bên (internal pH) để đáp ứng với việc giảm pH bên Vi khuẩn phát triển với DpH (? – Út) nhỏ tồn (over) màng tế bào Tuy nhiên, thích nghi với nồng độ acetate cao dường điều kiện tiên cho sức chịu đựng cao (Lasko et al., 2000) Một sản phẩm khác chuyển hóa vi khuẩn acetic mà ảnh hưởng đến chất lượng rượu vang ethyl acetate Ester acid acetic góp phần tích cực vào hương vang nồng độ thấp, xem không mong muốn nồng độ cao hơn, có ngưỡng mùi (flavour threshold) thấp khoảng 10 mg/l (Berg et al., 1955) Kashima et al (1998) phân lập esterase chịu trách nhiệm cho việc tạo ethyl acetate A pasteurianus, hoạt hóa ethanol có hoạt tính pH Sự phát triển vi khuẩn acetic làm tăng nồng độ ethyl acetate lên tới 140 mg/l vang tới 30 mg/l nước ép nho (must) (Drysdale and Fleet, 1989a) Ethyl acetate tạo trình lên men rượu nấm men phát triển vi khuẩn acetic làm tăng lượng ester (over and above) nồng độ xem bất lợi cho chất lượng vang (Drysdale and Fleet, 1989a, b) Vi khuẩn lactic tạo ester này, nhưng, theo Henick-Kling (1993), mức độ thấp, thường làm hỏng vang theo kiểu cảm quan (a sensorially different manner) khác với vi khuẩn acetic – tạo mức độ cao Vi khuẩn acetic oxi hóa rượu cao hơn, isoamyl alcohol, 1-propanol 2phenylethanol thành aldehyde acid acrboxylic tương ứng (Molinari et al., 1997, 1999) Sự chuyển hóa carbohydrate sản phẩm trình Vi khuẩn acetic chuyển hóa cerbohydrate khác nguồn carbon Như trường hợp nhiều VSV khác, glucose nguồn carbon tốt cho hầu hết chủng vi khuẩn acetic Những vi khuẩn sử dụng glucose thông qua nhiều đường trao đổi chất khác Loài Acetobacter sử dụng đường qua đường hexose monophosphate (De Ley et al., 1984; Drysdale and Fleet, 1988), qua đường Embden-Meyerhof-Parnas đường Entner-Doudoroff (Attwood et al., 1991) Từ (sản phẩm chuyển hóa glucose – Út) chuyển hóa xa thành CO2 nước qua đường tricarboxylic acid Flucker Ettlinger (1977) công nhận vài chủng Acetobacter sử dụng đường pentose phosphate để chuyển hóa glucose Tuy nhiên, dường tất chủng Acetobacter sử dụng glucose hiệu quả, tìm thấy De Ley (1961) De Ley et al (1984) vài chủng A pasteurianus phát triển môi trường chứa glucose nguồn carbon Điều chủng khả phosphorylate đường lối vào tế bào (inability to phosphorylate this sugar upon entry into the cell) (De Ley, 1959) Tuy nhiên, dễ dàng thường xuyên việc A pasteurianus phân lập từ môi trường chứa glucose (Drysdale and Fleet, 1985; Du Toit and Lambrechts, 2002) chứng thực thật đặc điểm (sử dụng glucose – Út) phụ thuộc vào chủng Đường (sugar) thông thường Gluconobacter ưa thích nguồn carbon Acetobacter Điều phản ánh thất glucose nguồn carbon tốt cho giống cho Acetobacter (De Ley et al., 1984) Quá trình chuyển hóa glucose Gluconobater đề tài nhiều nghiên cứu tạo thành sản phẩm chuyển hóa (metabolites) có tầm quan trọng công nghiệp vi khuẩn phát triển glucose (Olijve and Kok, 1979; Weenk et al., 1984; Buse et al., 1991; Qazi et al., 1991; Qazi et al., 1993; Velizarov and Beschkov, 1994) Các sản phẩm chuyển hóa (metabolites) bao gồm gluconic, 2-ketogluconic, 5-ketogluconic 2,5diketogluconic acid Cũng enzym alcohol dehydrogenase, vi khuẩn aceticcũng sở hữu glucose dehydrogenase phụ thuộc NAD(P)+ tế bào chất glucose dehydrogenase liên kết màng không phụ thuộc NAD(P), với enzym sau chịu tr1ch nhiệm cho hầu hết chuyển hóa glucose Theo Qazi et al (1991), glucose bị oxi hóa thành gluconod-lactone từ thành gluconic, 2-ketogluconic, 2,5diketogluconic acid tương ứng Gluconobacter sử dụng đường pentose phosphate để tạo lượng Con đường (route) mà qua vi khuẩn acetic oxi hóa glucose phụ thuộc vào pH nồng độ glucose Olijve and Kok (1979) tìm pH thấp 3.5 nồng độ glucose 0.9-2.7 g/l ức chế oxi hóa glucose qua đường pentose phosphate (glucose) bị oxi hóa trực tiếp thành acid gluconic Theo Weenk et al (1984), vi khuẩn bắt đầu sử dụng acid gluconic nồng độ glucose thấp 1.8 g/l Nhiệt độ tối ưu cho oxi hóa trực tiếp 30 33 oC (StadlerSzoke et al., 1980) G oxydans tạo thành tới 120 g/l acid gluconic, chủng Acetobacter tạo mức cao (seiskari et al., 1985; Attwood et al., 1991) Sự tạo thành acid đường (sugar acids) nước ép nho (grape must) quy chủ yếu cho oxi hóa glucose vi khuẩn acetic phát triển nấm (fungus) Botrytis cinerea, trước nghó (Sponholz and Dittrich, 1984; Sponholz and Dittrich, 1985; Eschenbruch and Dittrich, 1986) Sự tạo thành acid gluconic acid ketogluconic ảnh hưởng đến trình làm rượng vang, kết khả acid kết gắn với SO 2, làm cho không hiệu chống lại vi sinh vật Điều có thể, sau đó, dẫn đến nồng độ SO tổng cao nước ép nho hay vang để trì mức SO tự mong muoán (Eschenbruch and Dittrich, 1986) Barbe et al (2001) tìm thấy lượng SO2 tổng 3000 mg/l cần để đạt mức SO2 tự 50 mg/l nước ép nho tổng hợp mà chủng Gluconobacter xác định phát triển, tạo thành nồng độ cao acid gluconic (51 g/l), 5oxofructose (5833 mg/l) dihydroxyacetone (2032 mg/l) từ glucose, fructose glycerol, tương ứng hợp chất sau kết hợp (bind) với SO hiệu Một sản phẩm phụ (byproduct) quan trọng khác trình chuyển hóa glucose tạo thành polysaccharides ngoại bào vi khuẩn acetic (Kouda et al., 1997) Tayama et al (1986) tìm polysaccharide chứa phần D-glucose liên kết -(1-4) (-(1-4)-linked D-glucose residues) với mạch bên gồm L-rhamnosyl-(1-6)-D-dlucosyl-(1-6)-D-glucosyl-(1-4)-Dglucuronosyl-(1-2)-D-mannose Drysdale Fleet (1989b) báo cáo chủng A.pasteurianus tạo lượng lớn vật chất ngoại bào giốm gum nướp nho ép với có mặt S.cerevisiae Sự tạo thành gum bất ngờ lại không quan sát thấy nấm men Sự tạo thành polysaccharide ảnh hưởng đến khả lọc vang Tahara et al (1998) mô tả exo-1,4-glucosydase phân lập từ Acetobacter xylinum mà phân hủy (break down) số oligosaccharide ngoại bào Vi khuẩn acetic sử dụng carbohydrate khác, arabinose, fructose, galactose, mannitol, mannose, ribose, sorbitol vaø xylose (De Ley et al., 1984) Joyeux et al (1984b) tìm thấy G oxydans A aceti thích glucose fructose nho ép, bắt đầu sử dụng fructose không glucose nho ép Fructose bị oxi hóa thành 5-oxofructose fructose dehydrogenase, mà nối với màng (màng tế bào – t) Gluconobacter Vi khuẩn có 5-oxofructose reductase thuộc tế bào chất, mà làm giảm đường bị oxi hoùa (which reduces the oxidised sugar) (Avigad et al., 1966; Barbe et al., 2001) Arabitol, erythritol, mannitol vaø sorbitol xuất nước nho ép nhiễm Botrytis nồng độ thấp (Barbe et al., 2001), thấy nế giúp (support) cho phát triển vi khuẩn acetic nho eùp hay vang Drysdale and Fleet (1989a), nhiên, tìm thấy A aceti A pasteurianus sử dụng hoàn toàn đường sót (residual sugar) loại vang đỏ trình phát triển chúng S cerevisiae chuyển hóa đường thời kỳ lên men sơ cấp (primary fermentation), để lại đường sót vang, cho phép vi khuẩn acetic phát triển Quá trình chuyển hóa acid hữu sản phẩm Vi khuẩn acetic chuyển hóa acid hữu khác Điều đạt thông qua chu trình tricarbixylic acid, mà qua acid bị oxi hóa thành CO nước Không ngạc nhiên Gluconobacter, thiếu chu trình tricarboxylic hoạt động, oxi hóa hầu hết acid hữu (Holt et al., 1994) Những acid hữ bao gồm acid acetic, citric, fumaric, lactic, malic, pyruvic, succinic Các chủng Acetobacter làm giảm rõ rệt nồng độ acid malic acid citric nho ép (4.7 xuống 1.8 g/l 230 xuống 147 mg/l, tương ứng), nồng độ acid succinic tăng, đặc biệt nho ép mà Gluconobacter có phát triển Sự giảm nồng độ acid tartaric nho ép phát tri6ẻn vi khuẩn acetic báo cáo Hiệu ứng tích lũy thay đổi ản hưởng đến chất lượng vang (Joyeux et al., 1984b; Drysdale and Fleet, 1989a) De Ley and Schell (1959) tìm thấy chủng Acetobacter phân hủy (degrade) D-lactate nhanh lần so với L-isomer Một acid khác tạo thành acid propionic, có ngưỡng giá trị 20 ppm, vi khuẩn acitic tạo thành acid mức 10 30 mg/l vang, điều sau ảnh hưởng chất lượng vang mùi khó chịu (Drysdale and Fleet, 1989a) Một sản phẩm chuyển hóa phụ quan trọng khác trình chuyển hóa lactate acetoin De Ley (1959) báo cáo chủng Acetobacter mà chuyển hầu hết lactate canh trường dinh dưỡng thành acetoin Sự tạo thành qua tạo thành a-acetolactate Mùi hương giống bơ hợp chất xem mùi không mong muốn 10 nhiệt độ pH có hiệu ứng rõ rệt lên vi khuẩn Watanabe and Iino (1984), trích dẫn Drysdale and Fleet (1988), tìm thấy đến 100 mg/l SO cần để ức chế phát triển loài Acetobacer nho ép (grape must) Drysdale and Fleet (1985) phân lập 10 tế bào A pasteurianus ml từ loại vang đỏ chứa 81.6 mg/l SO có pH 3.46, kết luận xuất cao vi khuẩn acetic không tất yếu tương ứng với nồng độ SO thấp pH cao Theo Boulton et al (1955), A aceti kiểm soát 0.8 mg/l SO2 phân tử Họ xu hướng làm vang với lượn SO thấp góp phần vào nguy cao việc tìm thấy A pasteurianus vang Giá trị đề cập tương ứng với nồng độ SO2 cần thiết để ức chế Gl Hansenii khỏi phát triển nước ép nho (grape juice) nghiên cứu thực xác định sức kháng (resistance) SO2 loài đại diện thường tìm thấy vang (Du Toit, 2000) Tuy nhiên, chủng chủng kháng SO2 chủng lại nhạy cảm với SO2 hơn, với 0.6, 0.2, 0.1 0.05 mg/l phân tử SO2 rút (eliminating) từ A pasteurianus, A aceti, Gl Liquefaciens G oxydans, tương ứng Sự kháng SO2 chủng tương quan với phát triển chúng nước ép nho, với chủng cho thấy phát triển nhanh chủng kháng SO2 Tuy nhiên, rõ ràng biến đổi chủng (strain variation – thay đổi; khác nhau; biến dạng, biến dị , Út) ảnh hưởng sức kháng SO2 (Du Toit, 2000) Việc tàng trữ SO2 thùng gỗ hành động thực tiễn (practice) sử dụng khắp giới Những thùng dùng đến lần và, chúng có giá thành mắc, trình làm cần thiết lần sử dụng để loại bỏ (eliminate) vi khuẩn khỏi thùng (Ribéreau-Gayon et al., 2000e) Trong kiểm tra xác định phương pháp xử lý hiệu để loại bỏ vi khuẩn acetic khỏi mảnh ván gỗ nhỏ (ghép lại thành thùng – staves – t) bị làm nhiễm với A aceti A pasteurianus, Wilker Dharmadhikari (1997) tìm chí 250 mg/l SO2 tự không đủ để loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn khỏi ván gỗ thùng Vi khuẩn acetic tìm thấy 18 tuần sau xử lý ván gỗ với SO Các tác giả xử lý ván gỗ thùng với kali carbonat, chlorine nước nóng Trong số xử lý trên, có xử lý nước nóng (8588oC 20 phút) hiệu để loại bỏ vi khuẩn acetic Những lỗ hổng gỗ, lớp màng (film) tạo vi khuẩn acetic, giữ cho việc xử lý hóa chất không vào tiếp xúc trực tiếp với vi khuẩn được, làm cho xử lý không hiệu Các chủng Gluconobacter tìm thấy chịu (be resistant to) đến 1000 mg/l acid sorbic (Splittstoesser and Churney, 1992) Rất (khả kháng lại ??? – t), việc xử lý (any work) thực với hiệu ứng chất bảo quản (preservatives), acid fumaric, acid sorbic, acid benzoic dimethyl dicarbonate, lên vi khuẩn acetic Việc sử dụng SO2 ức chế vi khuẩn acetic Do đó, dường nồng độ SO phân tử 0.7 mg/l đạt đến điều Xu hướng toàn cầu việc sử dụng thứ hóa chất bảo quản không nên ngăn cản nhà làm vang sử dụng chất bảo quản mức độ thích hợp theo cách thức có trách nhiệm (a responsible manner) (Du Toit, 2000) Tuy nhiên, người tiêu dùng có khuynh hướng tăng thành kiến với hóa chất bảo quản, nên chất thay khác, bacteriocins (thuốc kháng sinh làm vi khuẩn), nghiên cứu (investgation) để hỗ trợ cho nhà sản xuất vang để loại bỏ vi khuẩn acetic khỏi vang (Du Toit and Pretorius, 2000) Gạn lọc (Clarification and Filtration) Việc gạn xác nho trắng đặc biệt (in particular) trước lên men thực hành thường sử dụng quy trình làm vang Nấm men thường tạo nhiều ester lên men với nước ép (in clearer juice) Những enzym oxi hóa sulphur nguyên tố (elemental sulphur) từ vườn nho bị lấy với trình gạn Hệ vi sinh vật tự nhiên (natural microflora) xuất nho, bao gồm vi khuẩn acetic, làm giảm cách Những kỹ thuật để làm (clarify) bã (must) bao gồm để lắng tự 19 nhiên (natural settling) nhiệt độ thấp hơn, có hay tác nhân lọc (fining agents), tách (floatation), gạn với ly tâm lọc (filtration) (Boulton et al., 1995) Bằng việc giảm số lượng vi khuẩn acetic nho ép tươi (fresh must), khả phát triển chúng trình lên men giảm Điều làm giảm số lượng vi khuẩn “đem theo” (“brought over” - ?, t) đến trình làm vang (Fugelsang, 1997) Rất công trình thực hiệu ứng kỹ thuật gạn lọc vang (như lọc – fining) lên lượng vi khuẩn acetic đếm Tuy nhiên, lượng vi khuẩn đếm vang làm giảm việc di chuyển (racking, ? t) điều nên bao gồm giảm vi khuẩn acetic Lọc (filtration) thực để làm giảm chất rắn lơ lửng vi sinh vật vang Hiện có xu hướng sử dụng trình lọc cách hạn chế trình sản xuất vang đỏ số quốc gia sản xuất vang định, khả bị mùi màu trình lọc Điều dẫn đến phát triển việc hư hỏng vi khuẩn acetic chai, đặc biệt oxi thừa hòa tan công đoạn đóng chai (Baldwin and Wollan, 1999) Những hệ thống lọc khác bao gồm điatomit (diatomaceous earth), đệm yên ngựa (hay giấy lọc?, pad – t), chảy chéo dòng (cross-flow) lọc membrane Lọc điatomit pad, phương pháp lọc sâu (depth filtrations), thường áp dụng để lấy vật thể lơ lửng lớn khỏi vang, lọc cross-flow membrane, phương pháp lọc thường tốt hơn, sử dụng để lọc vang thành vô trùng (sterile) Một số nhà cung cấp định tuyên bố lọc vang vô trùng với lọc sâu, lọc kích cỡ lỗ (a uniform pore size), trường hợp lọc membrane mà thường dùng cho mục đích (Boulton et al., 1995) Việc sử dụng điatomit với tính thấm (permeabilities) khác hỗ trợ người làm vang để giảm số lượng vi khuẩn vang Trong thí nghiệm, số lượng vi khuẩn giảm từ 180,000 tế bào sống 100 ml 7,700; 3000 1,500 tế bào 100 ml với hệ lọc điatomit thô (1.5 darcys), trung bình (0.35 darcys) mịn (0.06 darcys), 20 tương ứng Tấm lọc (filter sheets) khác xét tới khả chúng làm giảm số lượng vi khuẩn (Ribéreau-Gayon et al., 2000d) Kích thước lỗ nhỏ hệ lọc membrane dùng công nghiệp vang 0.45m Điều giữ lại (retain) vi khuẩn acetic, mà có kích thước tế bào khoảng 0.6-0.8 m 1.0-1.4 m (Holt et al., 1994) Tuy nhiên, dường vi khuẩn acetic mà sống sót qua thời gian dài vang điều kiện có sulphate (conditions of sulphating) chịu giảm kích thước tế bào, mà điều làm cho chúng chui qua màng lọc 0.45 m Điều kiện đảo ngược lại vi khuẩn vào lại pha phát triển điều kiện thích hợp hơn, cho phép chúng bị giữ lại màng lọc (Millet and Lonvaud-Funel, 2000) Ubeda and Briones (1999) quan sát vi khuẩn acetic chai vang chưa lọc lọc, không xác định cụ thể loại lọc sử dụng Tuy nhiên, việc lọc nên áp dụng để làm giảm hay loại bỏ (remove) vi sinh vật, bao gồm vi khuẩn acetic, khỏi vang Không có chứng cụ thể trình lọc làm hợp chất mùi màu khỏi vang, chúng trạng thái hòa tan vang, dường thừa nhận (assumption) chiến lược marketing (Boulton et al., 1995; Baldwin and Wollan, 1999) 21 Nguyễn Lân Dũng – Vi sinh vật học – NXB GD, 1998 VSV nhân nguyên thủy (Prokaryotes) gồm Vi khuẩn thật (Eubacteria) Vi khuẩn cổ (Archaebacteria) Trong Vi khuẩn thật lại có nhiều nhóm, nhóm chủ yếu là: [p.25]  + Vi khuẩn (Bacteria) + Xạ khuẩn (Actinomycetes) + Vi khuẩn lam (Cyanobacteria) + Nhóm vi khuẩn nguyên thủy Mycoplasma, Ricketsia, Chlamydia Vi khuẩn Gram (-) Gram (+)  Phương pháp nhuộm Gram [p.26]: nhà vi khuẩn học Đan Mạch Hans Christian Gram phát minh năm 1884 Đầu tiên, cố định tiêu vi khuẩn lửa nhuộm thuốc đầu băng dd tím tinh thể (crystal violet) khoảng phút Rửa băng nước Nhuộm tiếp dd iốt (dd Lugol) phút Lại rửa nước Phủ lên vết bôi dd etanol 95% : axeton (1:1) khoảng phút Lại rửa nước Sau nhuộm tiếp thuốc nhuộm màu đỏ (như Safranin hay Fuchsin Ziehl) 30-60 giây Rửa qua nước, để khô soi kính + Nhóm VK G(+): không bị dung môi hữu (etanol, axeton) tẩy phức chất màu tím kết tinh iốt Kết cuối bắt màu tím + Nhóm VK G(-): bị dung môi tẩy màu thuốc nhuộm đầu bắt màu với thuốc nhuộm bổ sung (đỏ vàng với Safranin hay đỏ tía với Fuchsin)  Thành tế bào VK G(-) G(+) [p.27-29]: - Chức năng: + Duy trì hình dạng tế bào + Hỗ trợ chuyển động tiên mao + Cần thiết cho trình phân cắt bình thường tế bào + Giúp tế bào đề kháng với lực tác động từ bên  VK Gram (+): chịu áp suất thẩm thấu tới 15-20 atm  VK Gram (-): chịu áp suất thẩm thấu tới 5-10 atm + Cản trở xâm nhập vào tế bào số chất có hại  Thành tế bào Gram (-) cản trở xâm nhập chất kháng sinh có khối lượng phân tử vượt 800 + Có liên quan mật thiết đến tính kháng nguyên, tính gây bệnh, chẳng hạn khả sinh độc tố, tính mẫn cảm với thể thực khuẩn… - Thành phần cấu tạo: khác nhau: Thành phần Peptidoglican Axit teicoic Lipoit Protein Tỉ lệ % khối lượng khô thành tế bào VK Gram (+) Gram (-) 30-95 5-20 cao haàu 20 cao Bao nhầy (capsule) [p.33]: 16S rRNA: ARN cuûa riboxom 16S  Năm 1980, Woess nhận thấy thứ tự nucleotit ARN riboxom 16S 5S số vi khuẩn có sai khác lớn so với vi khuẩn khác Ông xếp nhóm vi khuẩn có sai khác lớn đó, mà trình dịch mã không chịu tác dụng cloramphenicol lại bị ức chế độc tố vi khuẩn bạch cầu, thành giới Vi khuẩn cổ (Archaebacteria) [p.6]  Trong so sánh đặc điểm VSV nhân nguyên thủy (Prokaryota) VSV nhân thật (Eukaryota): [p.7] Prokaryota Hệ thống sinh tổng hợp 70S protein: Đặc điểm ribosom Eukaryota 80S (tế bào chất) 70S (cơ quan tử, bào quan)  Riboxom nằm tế bào chất (TBC) TBC vùng dịch thể dạng keo chứa chất hòa tan suốt hạt riboxom, gồm khoảng 80% nước Trong TBC có protein, axit nucleic, hydratcacbon, lipit, ion vô nhiều chất có khối lượng phân tử thấp khác Riboxom nằm tự TBC chiếm tới 70& trọng lượng khô tế bào VK Phần có chức tổng hợp protein tiết gắn với phía màng TBC Riboxom gồm tiểu phần: 50S 30S Hai tiểu phần kết hợp vp71i tạo thành monoxom 70S S đơn vị Svedberg, đại lượng đo tốc độ lắng hạt huyền dịch ly tâm cao tốc (độ lắng trầm) Khi ly tâm dịch huyền phù có ribosom, ribosom có đơn vị Svedberg lớn lắng trước ngược lại Riboxom VK chịu tác động nhiều chất kháng sinh streptomixin, neomixin, tetraxilin… [p.30] Cho tới nay, giống Acetobacter Gluconobacter  Hình thái: tế bào có từ hình ellip đến hình gậy, kích thước Acetobacter 0.6-0.8 x 1.0-3.0m, Gluconobacter 0.6-0.8 x 1.5-2.0m Tế bào đứng mình, thành đôi hay thành chuỗi ngắn dài Chúng vi khuẩn Gram (-), số loài chuyển động, số không Ngoài ra, số loài sinh tổng hợp polysaccharide ngoại bào  Sinh sản vô tính  Thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc  Theo Viện Kỹ thuật Liên bang Zurich, Thụy Só (Swiss Federal Institute of Technology Zurich) Acetobacter oxi hóa hoàn toàn acid acetic thành khí carbonic nước hệ enzym chu trình Krebs Tuy nhiên, Gluconobacter không oxi hóa acid acetic đầy đủ hệ enzym chu trình Krebs Theo phân loại Bergey’s, Acetobacter chia làm loài (species) theo hai nhóm sau:  Nhóm I: Oxi hóa acid acetic thành CO2 H2O A Sử dụng muối amon nguồn nitơ Acetobacter aceti B Không sử dụng muối amon nguồn nitơ a Tạo thành màng cellulose dày bề mặt môi trường lỏng Acetobacter xulinum b Không tạo thành màng cellulose dày bề mặt môi trường lỏng Acetobacter rancens 3a Acetobacter pasteurianus 3b Acetobacter kuetzingianus  Nhoùm II: Không oxi hóa acid acetic A Tạo sắc tố môi trường glucose a Sắc tố nâu đậm đến đen Acetobacter melanogenus b Sắc tố hồng nhạt (pink) đến hồng đậm (rose) Acetobacter roseus B Không tạo sắc tố a Nhiệt độ tối thích 30o 35oC Acetobacter suboxydans b Nhiệt độ tối thích 18o 21oC