Học thuyết tế bào - Có 3 nguyên lý: + Tất cả sv đều được cấu tạo từ: 1 or nhiều TB + TB: đơn vị cấu trúc của sự sống + TB: chỉ được sinh ra từ “sự phân chia” của TB đã tồn tại trước đó
MiMi nè :) LÝ THUYẾT ÔN TẬP Y SINH HỌC PHÂN TỬ Học thuyết tế bào - Có nguyên lý: + Tất sv cấu tạo từ: or nhiều TB + TB: đơn vị cấu trúc sống + TB: sinh từ “sự phân chia” TB tồn trước Đặc điểm TB - Kích thước: nhỏ bé (vài μm) - Đa dạng: hình thái, chức - Thành phần hóa học: giống (DNA,RNA,Protein, H 2O, C6H12O6,Na+,Mg2+,Ca2+ ) - Tiến hóa từ tổ tiên chung - Gen quy định: cấu trúc, chức năng, hoạt động - Đa bào: vào chục - nhiều tỷ TB (người 100 tỷ TB) - Xảy trinh trao đổi chất: giúp TB sinh trưởng, phát triển, trì, phục hồi Gồm trình: + Sự đồng hóa: chất đơn giản kết hợp với tạo thành chất phức tạp => thu lượng (đơn giản + đơn giản => phức tạp) + Sự dị hóa: phân giải chất phức tạp tạo thành chất đơn giản => giải phóng lượng (chia phức tạp => đơn giản) - Tính cảm ứng: Phản ứng lại với MT lý, hóa trực tiếp xung quanh - Khả sinh trưởng: Tăng kích thước, số lượng - Khả sinh sản: Vơ tính, hữu tính Phân loại tế bào - Dựa vào: cấu trúc kích thước Tế bào nhân sơ (Prokaryote): VK, Cổ khuẩn - Hình thái: que, cầu, xoắn, chuỗi, khối - Có roi di động - KT: 1-10 μm - TBC: bao bọc Màng vách TB + Chứa 65-90% nước, chất vô cơ, hữu + Phân bố gồm: Ribosome (tổng hợp Protein), enzyme, DNA Vi khuẩn (DNA trần, dạng vịng, khu trú thể nhân - nucleoid), q trình trao đổi chất lượng: Tổng hợp protein, trình đường phân, hơ hấp hiếu khi, quang hợp + DNA dạng vòng khác, nhỏ gọi plasmid: chưa thông tin di truyền, truyền từ VK sang VK khác (tải nạp) - Vách TB chứa peptidoglycan: polysaccharide liên kiết với polypeptide ngắn Vách TB => Kháng sinh + VK Gram dương: Vách đơn, peptidoglycan dày => tím đậm + VK Gram âm: Vách mỏng, peptidoglycans mỏng, không giữ màu => màu hồng MiMi nè :) - Màng TB: lipoprotein, bao bọc TBC, ngăn cách MT bên TB Tế bào nhân thật (Eukaryote): ĐV,TV, tảo, nấm, ĐV nguyên sinh - KT: 5-100 μm - Cấu trúc: nhân rõ rệt, màng nhân bao bọc chất nhiễm sắc (DNA liên kết histone) - Màng TB: + Màng kép (2 lớp phospholipid) bao bọc TBC + Màng ngăn có chon lọc: cho oxi, chất dinh dưỡng, chất thải qua màng + Có protein gắn màng: gọi thụ thể/kênh dẫn truyền - TBC: + Nằm nhân, màng TB + Chứa nhiều bào quan, khác MT bán lỏng + Là nới diễn hoạt đọng trao đổi chất - Ty thể: diễn hô hấp TB sinh tổng hợp ATP - Ribosome: sinh tổng hợp protein, nằm tự TBC/gắn lưới nội chất hạt, màng nhân - Lưới nội chất: mạng lưới túi, ống có màng bao bọc, hoạt đơng q trình tổng hợp màng, tổng hợp khác, trình trao đổi chất + Mạng lưới nội chất hạt: bề mặt gắn nhiều riboxome, tổng hơp protein để xuất khỏi TB (insulin, hormone) + Mạng lưới nội chất trơn: gắn enzyme xúc tác tổng hợp hydrocacbon lipid cho TB (TB ruột non tổng hợp glycerid, TB gan chưa nhiều enzyme phân giải chất độc) - Bộ máy Golgi: + Hệ thống túi màng dẹt, xếp chồng song song vòng cung, nối ống nối + Là nơi tập trung, sửa đổi, phân loại, tiết chất tổng hợp TB (protein,lipid) - Lysosome: bào quan dạng túi, chứa hệ enzyme đậm đặc thủy phân đại phân tử protein, acid nucleic, lipid, hydrocacbon => đổi mơi stp TB, tạo nguồn nguyên liệu sinh tổng hợp chất - Peroxisome: tồn Gan, thận ĐV có vú, nấm men, - hạt TV Chuyển hóa chất sinh tổng hợp H2O2 (catalase) - Trung thể: q trình phấn bào tạo thoi vơ sắc - Lông nhung: lấy mấu lồi tăng diện tích bề mặt - Nhân TB: hình cầu, d=5μm, chứa thơng tin truyền mã hóa phân tử DNA Là trung tâm điều hành, định hướng, giám sát hoạt đọng trao đổi chất trình sinh trưởng, sinh sản - Màng nhân: mang phospholipid kép, có lỗ, nối lưới nội chất - Nhân con/ hạch nhân: tham gia sinh sản ribosome, có nhiều MiMi nè :) - Chất nhiễm sắc: hạt (DNA sơik + histone) TB phân chia, DNA xoán cực đại => nhiễm sắc thể: dạng que, màu đậm So sánh TB nhân sơ TB nhân thật - Giống nhau: (4) + Màng TB màng kép, chứa phospholipid + Thơng tin di truyền mã hóa DNA mã di truyền giống + Quy trình tổng hợp RNA (phiên mã) tổng hợp (dịch mã) tương tự + Có ribosome nơi tổng hợp protein - Khác nhau: (5) NHÂN SƠ NHÂN THẬT 1-10μm 5-100μm Cấu tạo đơn giản, TBC chứa: Cấu tạo phức tạp, TBC phân vùng ribosome, thể nhân chứa bào quan: lưới nội chất,ribosome,ty thể, golgi, lysosome, Thông tin di truyền chứa Thông tin di truyền chứa phân tử DNA trần, dạng vòng, nằm phân tử DNA sợi, liên kết với TBC protein histone tạo thành thể nhiễm sắc, khu trú nhân Khơng có nhân Có nhân với màng nhân Chỉ nhân vùng TBC chứa DNA Phân bào đơn giản: trực phân Phân bào phức tạp: nguyên phân, giảm phân Cấu trúc DNA - Đại diện phân tử thông tin di truyền, nằm nhân - Gồm: chuối xoắn kép + mạch đơn nối với liên kết hydrogen + mạch đơn = chuỗi nucleotic + nucleotic: nhóm phosphate, đường ribose (pentose carbon), base (2 nhóm: purine pyrimidine) Nucleotic thuộc purine: A,G Nucleotic thuộc Pyrimidine: T,C,U + Nucleotic mạch đơn liên kết = liên kết phosphate - Phân tử DNA: mạch đơn gắn = lk hydrogen base, theo nguyên tắc bổ sung: A-T, G-C + Mỗi mạch đơn: đầu 5’ phosphate tự đầu 3’ OH tự MiMi nè :) Định hướng 5’ 3’ + Hướng mạch: ngược (2 mạch đối song song) + Đường kính: 20A Nhiễm sắc thể - Trong TB Eukaryote, phân tử DNA quấn quanh histon nucleosome chuỗi nucleosome sợi nhiễm sắc chất (chromatin) - d chuỗi: 20A ; d chromatin: 100 – 300 A - Phân bào: chromatin xoắn cuộn NST (NST ngắn DNA 50.000 lần) - DNA prokaryot: mang thông tin mã hóa protein - DNA eukaryote: mang trình tự mã hóa (exon) khơng mã hóa (intron) + Các trình tự lặp lại nhiều lần: 10-15% hệ gen, trình tự ngắn, khơng mã hóa, tập trung tâm động, đầu NST Chức năng: tham gia trình di chuyển thoi vô sắc, bảo vệ đầu mút NST trình chéo DNA + Các trình tự lặp lại trung bình: 25-40% hệ gen, đa dạng, kích thước lớn, phân bố tồn hệ gen Là trình tự khơng mã hóa mã hóa cho rRNA, tRNA + Các trình tự nhất: Gen mã hóa cho protein, trình tự đặc biệt cho gen - DNA có khản biến tính hồi tính: + Biến tính: sợi đơn DNA tách lk hydrro base bị phá vỡ hóa học hay vật lý + Hồi tính: sợi đơn DNA bắt cặp lại với theo nguyên tắc bổ sung giảm nhiệt độ nồng độ Sinh tổng hợp DNA – Qúa trình nhân đơi DNA - Qúa trình nhân đơi DNA: q trình phân tử DNA ban đầu nhân lên thành phân tử DNA giống hệt giống phân tử DNA ban đầu Diễn trước phân bào - Gồm bước: Mở đầu, kéo dài, kết thúc Mở đầu: + Quá trình nhân đơi “Điểm khởi đầu chép OriC” giàu A,T + Enzyme DNA helicase: trượt chuỗi xoắn kép DNA → tháo xoắn DNA → tách rời mạch DNA → chạc ba nhân đôi + Protein SSB: gắn vào mạch đơn → giữ mạch thẳng sẵn sàng làm khuôn mẫu để tổng hợp mạch DNA Kéo dài: + DNA primase: tổng hợp đoạn mồi: 3’-OH, kết thúc OriC + mạch đơn thành khuôn mẫu tổng hượp mạch nhờ: DNA polymerase III → bán bảo tồn, độ xác cao MiMi nè :) + Mạch DNA tổng hợp theo chiều 5’ - 3’: cách kết hợp nucleotic bổ trung theo trình tự mạch khn mẫu + Mạch mới: tổng hợp liên tục mạch tới, mạch lại mạch chậm: tổng hợp gián đoạn Kết thúc: + Đọan mồi RNA: phân gải RNAse H, thay DNA bới DNA polymerase I + DNA ligase: nối okazaki mạch chậm → DNA hoàn chỉnh - Các enzyme khác: + Topoisomease: ngăn cản hình thành xoắn cực đại đoạn DNA trước chạc chép + Protein Sliding clamp: giữ DNA polumerase chuỗi DNA So sánh Prokaryotes Eukaryotes GIỐNG NHAU - bước - Cần RNA primer - Bán bảo tồn - Mạch DNA tổng hợp theo hướng 5’ - 3’ mạch tới mạch chậm KHÁC NHAU Prokaryotes Eukaryotes - Xảy TBC - Xảy nhân, giai đoạn S phân bào - Có điểm khởi đầu phiên mã - Có nhiều điểm khời đầu phiên mã - Đoạn Okazaki dài (1000-2000 - Đoạn Okazaki ngắn (100-200 nuc) nuc) - Xảy nhanh (1000nuc/s) - Xảy chậm (1/10 so với Prokaryotes) - Bao gồm DNA polymerase I,III - Bao gồm DNA polymerase α,σ,ε + DNA polymerase α + DNA primase → RNAprimer + DNA polymerase σ,ε thay DNA polymerase α tổng hợp đoạn Okazaki mạch tới - Khơng có nucleosome - Có nucleosome → giải phóng/kết hợp histone - DNA vịng → ko có điểm tập hợp - DNA thắng → tổng hợp telomere cuối = ezyme telomerase Một số kỹ thuật Y sinh học phân tử thông dụng - PCR: + Kỹ thuật nhân nhanh đoạn DNA (gen) phịng thí nghiệm MiMi nè :) + Tạo hàng triệu trình tự DNA 1-2h + Mơ q trình nhân đơi DNA + Ứng dụng: sinh học, y học, nông nghiệp - Real-time PCR: + Kỹ thuật PCR định lượng: định lượng DNA gốc có bệnh phẩm + Có chất phát quang, ghi tín hiệu DNA tổng hợp + Rút ngắn thời gian làm XN + Phát diện yếu tố gây bệnh, gen qan tâm - Giải trình tự DNA: + Có phương pháp thường dùng: Maxam-Gilbert: hóa học, đồng vị phóng xạ Sanger-Couulson: enzyme (4 loại dNTP loại ddTNP) + Ứng dụng: xác định đột biến gen, tầm soát ung thư, định danh tác nhân gây bệnh - Tính đa hình chiều dài đoạn DNA cắt giới hạn - RFLP: + Kỹ thuật nghiên cứu dựa điểm cắt enzyme giới hạn, khai thác điểm khác biệt trình tự DNA → lập đồ gen + Enzyme cắt giới hạn: có khả nhận biết trình tự DNA đặc hiệu Có loại: Loại 1: enzyme nhận biết trình tự di chuyển cắt vị trí cách 1000-5000 cặp base Loại 2: enzyme nhận biết trình tự cắt vị trí Loại 3: en zyme nhận biết trình tự cắt vị trí cách 20 cặp base + Nguyên tắc: dựa độ đặc hiệu enzyme cắt giới hạn vị trí nhận biết chúng DNA gen Sự khác biệt vị trí cắt hai cá thể → đoạn cắt khác + Ứng dụng: Lập đồ gen, XN phả hệ, xác định giống, tác nhân gây bệnh, phân tích đột biến, bệnh di truyền - Lai phân tử: + Là bắt cặp đoạn dò acid nucleic mạch đơn với mạch đơn acid nucleic khác từ mẫu + Mẫu chứa DNA → Southern blot + Mẫu chứa RNA → Northern blot + Đánh dấu protein → Western blot + Phát trình tự nucleotide, nghiên cứu cấu trúc DNA hệ gen Khái niệm Kỹ thuật PCR - Là kỹ thuật nhân gen (DNA) ống nghiệm, cho phép khuếch đại theo hàm số mũ lên đến hàng triệu lần đoạn DNA quan tâm - Thực với đoạn base: từ vài chục → hàng ngàn cặp base - Nguyên lý: Biến tính, hồi tính trình nhân đơi DNA MiMi nè :) - Ứng dụng: phát diện yếu tố gây bệnh, gen quan tâm - Thiết bị: máy luân nhiệt - Ưu điểm: độ nhạy cao, phát lượng DNA nhỏ mẫu 1-2h - Nhươc điểm: Chỉ phân biệt dựa kích thước, khơng phát đột biến điểm, phải xử lý sau PCR, chất nhuộm DNA Ethidium bromide gây ung thư Nguyên tắc PCR: - Là chuỗi 25-35 chu kỳ nhiệt,mỗi chu kỳ giai đoạn: + Biến tính: Nâng nhiệt độ 94-98 độC, cắt lk hydro mạch đôi DNA, time:15-20s → DNA đích bị biến tính + Bắt cặp: Hạ nhiệt độ 45-65 độC, time: 10-30s → đoạn mồi bắt cặp bổ sung vào DNA đích + Kéo dài: nâng nhiệt độ lên 72 độC, time: tùy chiều dài DNA đích → đoạn DNA tổng hợp - Qua chu kỳ, từ DNA ban đầu nhân lên thành 21 = DNA => n chu kỳ, số lượng DNA đạt 2n phân tử → theo hàm số mũ Thành phần phản ứng PCR: - Đoạn DNA đích (khuôn mẫu) cần khuếch đại - loại Deoxyribonucleotic (dNTPs): dATP,dGTP,dTTP,dCTP - Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt - Cặp mồi: dài 10-30 base, trình tự bổ sung, đặc hiệu với DNA đích - Dung dịch đệm: chứa cation NH4+, K+,Mg2+, Cl DNA khuôn mẫu: - Độ tinh cao, không lẫn tạp chất - Hàm lượng: 10-500ng/50μl phản ứng - Mạch đơn ỏ mạch đơi - Có thể tách chiết từ bạch cầu mãu ngoại vi, mô sinh thiết, dịch thể, mơ xương, răng, tóc - Ngun lý tách chiết DNA: + Phá vỡ màng TB màng nhân + Loại bỏ thành phần bị biến tính + Loại bỏ protein + Kết tủa DNA - Phân tích định tính định lượng DNA: điện di, sắc ký, độ hấp thụ UV 260/280nm Đoạn mồi: - Là đoạn oligonucleotic dài 10-30base, có trình tự bổ sung đặc hiệu với đầu DNA đích - Gồm: mồi xuôi bắt cặp với mạch antisense mồi ngược bắt cặp với mạch sense - Nồng độ: 10-50μm phản ứng MiMi nè :) - Các phần mềm thiết kế mồi: primer express, primer - Lưu ý thiết kế mồi: + Trinh tự mồi: 35-50% GC + đoạn mồi ko có trình tự bắt cặp bổ sung + Tránh vùng: trình tự khơng bình thường, trinh tự lặp + Nhiệt độ nóng chảy mồi: Tm (oC)=4(G+C) + 2(A+T) + Nhiệt độ giai đoạn bắt cặp: Ta=Tm - 5oC + Nhiệt độ nóng chảy đoạn mồi không nên cách xa DNA polymerase - Vai trò: định hiệu phản ứng - Enzyme chịu nhiệt (>90oC), thường Taq polymerase - loại chiu nhiệt khác: Tth polymerase, Pfu polymerase Lượng Taq polymerase cho pư 1-2 đơn vị Các deoxyribonucleotic tự - loại dNTP: dATP,dTTP,dGTP,dCTP - Nồng độ cho pư: 20-200μm - loại dNTP phải có nồng độ tương đương Ion Mg2+ dung dịch đệm - Thành phần dung dịch đệm chứ: Tris HCl, K+,NH4+,Mg2+, Cl - Nồng độ Mg2+ thích hợp: 0.5-5 mM - Nồng độ Mg2+: Quá thấp: Taq polymerase ko thể hoạt động bình thường thời gian kéo dài Quá cao: ngăn ngừa biến tính hồn tồn DNA Phát sản phẩm PCR - Phương pháp: Điện di gel agarose + Tạo thạc agarose + Dùng dung dịch TAE + DNA tích điện âm: di chuyển vê cực + + Tốc độ di chuyển phụ thuộc kích thước DNA + Nồng độ agarose cao: độ phân gải lớn + Sau điện di, nhuộm DNA gel với chất sáng sáng tia UV + Chất nhuộm bám vào mạch đơi phát sáng, cho phép quan sát, chụp hình DNA + Ethidium bromide: chất độc → ung thư + Nếu đoạn DNA rẩ nhó ( đổi... DNA Phân bào đơn giản: trực phân Phân bào phức tạp: nguyên phân, giảm phân Cấu trúc DNA - Đại diện phân tử thông tin di truyền, nằm nhân - Gồm: chuối xoắn kép + mạch đơn nối với liên kết hydrogen... nucleosome → giải phóng/kết hợp histone - DNA vịng → ko có điểm tập hợp - DNA thắng → tổng hợp telomere cuối = ezyme telomerase Một số kỹ thuật Y sinh học phân tử thông dụng - PCR: + Kỹ thuật